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抗体生产纯化 图 1. 治疗性单抗技术演化 一、单抗技术的发展、应用和市场前景 Kohler和Milstein于 1975年发明了被称之为“魔弹”的单克 隆抗体技术,并在1984年获得了诺贝尔奖。单抗是B淋巴细 胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的,其重链和轻 链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。1987年单抗技 术被成功应用到诊断试剂当中,但由于 HAMA (人抗鼠抗体) 反应,没能有效应用在人类疾病的治疗上。90年代,随着基 因工程技术的迅速发展,治疗性单抗从早期 100%的鼠源单 抗 (Mab),到...

抗体生产纯化
图 1. 治疗性单抗技术演化 一、单抗技术的发展、应用和市场前景 Kohler和Milstein于 1975年发明了被称之为“魔弹”的单克 隆抗体技术,并在1984年获得了诺贝尔奖。单抗是B淋巴细 胞和骨髓瘤细胞杂交形成的杂交瘤细胞产生的,其重链和轻 链所形成的结构域可以识别和结合特异抗原。1987年单抗技 术被成功应用到诊断试剂当中,但由于 HAMA (人抗鼠抗体) 反应,没能有效应用在人类疾病的治疗上。90年代,随着基 因工程技术的迅速发展,治疗性单抗从早期 100%的鼠源单 抗 (Mab),到嵌合抗体,人源化抗体 (Humanized Mab),到近 年的全人源性抗体 (图1、2),逐步消除了异源性抗体的免疫 原性问题,在保持对抗原高亲和力的同时,改善了抗体的药 代动力学。 抗体生产纯化 苗景 孙文改 ·通用电气 (中国) 医疗集团 GE Healthcare 图 2. 上市单抗的分布图 正在临床试验的单抗分布 1997年FDA批准第一个治疗淋巴癌的嵌合单抗药物Rituxan, Anti-CD-20抗体上市,并进入56个国家,由 IDEC/Genentech/ Roche三大药厂联合生产和销售,至今仍然供不应求1。2001 年5月,《时代周刊》封面文章指出,治疗性单抗是人类与癌 症战斗中的一次重大胜利 2。 单抗药物的主要治疗机制是: 1. 直接诱导癌细胞凋亡或抑制癌细胞生长和代谢,或通过补 体效应或ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用) 间接 杀死癌细胞; 2. 癌症、心血管等疾病的导向治疗:以单抗荷载同位素、毒 素蛋白、抗生素等药物制成生物导弹; 3. 应用抗体T细胞、抗IL-2R的单抗防治器官移植排斥反应等; 4. 以单抗制成避孕、传染病的预防药物。 至 2007年,FDA已批准了 20多种治疗性单抗药物,约一半 用于治疗癌症 (详见附录1),多个已成为年销售额超十亿美元 的“炸弹药物” (Blockbuster Drug,图3)。全球抗体药物的市 场增长十分迅猛,有约 200多种单抗在临床实验,占整个临 床生物技术药品总数的三分之一多,其中四分之一在临床三 期或等候批准。预计单抗的全球销售额将从 2004年的 50多 亿美金增至2010年的300多亿美元,年均复合增长达到30%。 整个抗体市场 (包括多抗) 2007年即已经达到 210多亿美金 (表1)。2000年人类基因组序列初稿的完成,近年蛋白质组和 结构基因组技术的蓬勃发展,也给抗体研究带来更多机遇和 挑战。而高细胞密度培养及表达技术、高表达细胞株构建技 术以及大规模蛋白质纯化技术的发展则极大的推动了抗体产 业化的发展。 表 1. 全球治疗性抗体 (包括单抗与多抗) 市场预测 (单位:亿美元) 2001 2002 2004 2007 2010E 01-10年 年均复合增长率 治疗用抗体 29 40 105 210 300 26% 图 3. 全球主要单抗销售额趋势 3, 4 注:2007年有7个抗体品种进入“重磅炸弹”销售行列,有5个进入 单一药品销售前十名。 DNA重组技术,在全分子抗体向嵌合抗体及改型抗体发 展的同时,小分子及单链等基因工程抗体 (Gab) 也得到了极 大的发展 (表 2)。 2. 单抗特性及纯化策略 每个单抗等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,既要了解他们的共性,又要 了解个性,从而制定相应的纯化策略 (表 3)。 二、单抗的结构、种类、性质及纯化策略概览 1. 单抗的结构和种类 传统单抗的 Y型结构,由重链和轻链组成 (图 4)。 图 4. 全分 子、小分子 及单链抗体 结构示意图 -2- 表 2. 基因工程抗体 (Genetically engineered antibody,Gab) 基因工程抗体 特 点 人-鼠嵌合抗体 在基因水平上将鼠源单抗的可变区和人抗体恒定区重构并在合适的宿主细胞中表达。其人源化低于80%,但HAMA反应比鼠源 单抗明显减少,人源的恒定区可更有效介导人体内的CDC和ADCC等免疫效应。如Remicade (Centocor公司) 抗 TNF-a抗体,治 疗风湿性关节炎和节段性回肠炎。 人源化抗体 将鼠单抗的 CDR移植到人抗体的骨架区,保持了鼠单抗的抗原特异性,并最大限度地降低其异源性,形成改型抗体,HAMA反 应更低。如Herceptin (Genentech 公司),抗 HER2/neu抗体,用于治疗乳腺癌。 人源性抗体 主要通过噬菌体显示技术和转基因动物制备人源性抗体,全人源抗体。如Abbott开发的D2E7,抗 TNF-a 抗体Humira,治疗关 节炎。 F (ab’) 2 用胃蛋白酶处理,分子量小,穿透力强。 Fab片段及重组 Fab 用木瓜蛋白酶分解全分子抗体纯化得到 Fab片段,如果恒定区片段是人源性的则称为重组 Fab。它具有与亲本全分子抗体相同 的抗原特异性但组织穿透能力更强,结构稳定,制作简单。如抗 Crohn 病的 Cimzia。 Fv和单链抗体 ScFv 将重链可变区V H 和轻链可变区V L 通过共价健结合得到完整抗原结合活性的最小功能片段即为Fv。如用一段肽链将二者连接起来 形成单一链分子即得到单链抗体 (scFv)。穿透力强但往往亲和力下降。 双体分子Diabody 一条单链抗体分子上的 V H 和V L 与另一条相同的单链抗体分子上的V L 和V H 分别配对形成双价的抗体分子。 单域抗体 比 Fv更小的亚单位结构组成的具有抗原结合活性的分子,如重链可变区。 最小识别单位 抗体互补决定区 CDR 衍生的多肽小分子,该多肽具有亲本单抗的亲和力和选择性,无免疫原性。 双/多特异性抗体 具有两种或多种抗原结合特异性。 抗体融合蛋白 导向抗体与毒素、免疫粘附素、酶或细胞因子联合或 Fc段与功能蛋白融合等。 特殊类型抗体 细胞内抗体和抗原化抗体等。 单 抗 特 性 纯 化 策 略 分子量 IgG 150-170KD (重链 50KDa, 单抗样品浓缩一般选择 30KD或 50KD的超滤膜。分子筛层析 Superdex 200或 Sephacryl S-300,能有 轻链 25KDa) IgM约为 900KD 效去除抗体聚集体。选择超滤膜和分子筛介质时除了分子量,还须考虑单抗不同亚型 (SubClass) 的 (五聚体) 空间结构和形状,如人 IgG 3 较细长,需要选分子量较小的超滤膜。 GE HC 新一代超滤膜孔径更均一,可以使用更大孔径 (50-100KD MWCO) 超滤膜进行抗体的浓缩而保 持极高的收率,在浓缩单抗的同时,有效的去除大量蛋白酶 (多为60-70KD) 和BSA等杂质,有效避免 了纯化过程中蛋白酶对抗体的破坏,使终产品更均一,比活更好。 等电点 从 pH4.0 到 9.0不等, 大多数IgG等电点高于一般血清蛋白,建议用阳离子交换层析5捕获浓缩抗体或流穿模式的阴离子交换 大部分超过 pH6.0 层析以除去大部分杂蛋白,DNA和内毒素 (图5)。 注意:CHO细胞表达的基因工程抗体 (Gab) 由于 细胞培养过程带来的糖基化的不均一以及后期的脱氨基脱酰胺等作用,存在着等电点不同的多种抗体 变体 (见图5),离子交换层析根据带电性质的不同可以有效去除这些变体,使产品性质更均一。 疏水性 大多数 IgG 疏水性较强 大多数 IgG可以在0.5-1.0M硫酸铵结合疏水介质,让大部分杂蛋白流穿。单抗在硫酸铵30-50%时会沉 淀,可重溶后直接上疏水层析6。不同抗体疏水性程度也不相同,如用 Source 15PHE可除去含血清培 养基中的牛 IgG 7。 糖基化 IgG含 2-3%糖基,IgM含 12% 主要在重链的Fc区产生N-link的糖基化。 注意:抗体糖基化不均一,所带电荷也不同,IEF等点聚焦 糖基 电泳呈多条带 (图5),会影响离子交换层析效果。 pH稳定性 稳定性较好 IgG在水溶液或一般的缓冲液中都比较稳定。但应避免较极端的pH,如低pH促使蛋白聚集8;pH>8.5, 脱酰胺酶可能降解单抗。 多聚体、复 没有保护剂的情况下 IgG 浓度高 pH、盐浓度、buffer种类、温度等都会影响抗体的聚集动力学。如pH<3,抗体会发生不可逆聚集;盐 合物的形成 于 2mg/ml 容易形成二、多聚体 浓度过高增强疏水聚集;碱性单抗在多价阴离子缓冲液中易形成稳定的离子复合物,导致抗体之间的 聚合;在 0.3M-1.0M NaCl中,单抗与核酸可形成可逆的复合物,离子交换层析纯化时须留意。 溶解度 大多数 IgG在中性偏碱和低电导 有些单抗在温度低于 37˚C时溶解度会降低,易结晶,纯化过程避免冷室操作。 的缓冲液中是稳定可溶的 表 3. 单抗的基本性质 图5. 抗体及主要杂蛋白等电点分布范围 (右下图为抗体等电聚焦 结果图) 基因工程抗体 (Gab) 由于细胞培养过程带来的糖基化的 不均一,等电点往往较分散而非单一条带 3. 针对不同抗体和其生产宿主的特性制定纯化策略 (表4) 三、治疗用抗体生产策略:技术选择与工艺整合 一般用于检测等用途的抗体,一步亲和层析达到大于90-95% 的纯度即可满足要求。而治疗用抗体一般使用动物细胞大规 模高密度无血清悬浮培养进行生产,不仅对终产品的单体含 量有严格的规定,还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安 全的要求,因此在蛋白A亲和层析之后还需要进行多维纯化。 2003 年初,中国 SFDA 下属的中国药品与生物制品检定所 (NICPBP) 公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》16。 生产者除须保证最终抗体产品纯度,还需要验证所用的纯化 方法能有效对潜在的污染物,如宿主细胞蛋白 (HCP)、免疫球 蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、其 它热原物质、培养液成分、层析凝胶析出成分 (脱落的蛋白A 配基) 进行去除;并能有效的去除/灭活病毒。也就是说,在 设计下游工艺时,需多角度充分综合考虑抗体本身的性质, 抗体的来源,发酵培养技术,发酵液蛋白浓度,宿主杂质,抗 体批间的差异,潜在污染及病毒灭活等问题。目前,用CHO 细胞大规模生产 (超过一万升培养罐) 的单抗表达水平已在1- 10 g/L。 -3- 抗体生产 优/缺点 主要相关杂质 针对宿主特性的纯化策略 宿主 鼠/兔等 直接免疫动物, 方法成熟, 产量 动物腹水各种生物 由于HAMA 反应, 鼠源单抗大多仅用于诊断试剂,规模较小,产品纯度要求 动物 * 可达 1-15 g/L。单抗亲和力高, 大分子、脂类 较低 (电泳纯 90-95%)。Protein A或G亲和层析配合分子筛 Superdex 200或 但生产周期长,难以大量生产 Sephacryl S-300一般已可以达到所需纯度 杂交瘤 5-10%小牛血清培养表达量 培养基内的杂蛋白,如 用于诊断试剂和治疗性单抗,后者纯度要求较高 (95-99%)。需要多步、多维层 细胞 * 10 g/L,但纯化困难,并有动物 血清白蛋白、转铁蛋 析去除宿主杂质。转铁蛋白、牛IgG与目标抗体性质接近,污染问题十分显著。 源污染风险。无血清培养表达 白、酶、小牛 IgG、脂 一般可通过优化疏水层析和离子交换层析去除。若白蛋白的量较多,可先用 量可达 1~4 g/L 类以及宿主蛋白和DNA 白蛋 A、蛋白G等亲和层析法直接捕获抗体 CHO/NS0 利用基因工程技术将抗体人源 宿主、培养基内的杂蛋 主要为治疗性单抗。临床剂量大 (数十至几百毫克 /dose),批产量达公斤级, 等哺乳动 化。目前上万升发酵罐的单抗 白、核酸、脂类等 纯度要求极高 (>99%)。约 80%的下游工艺用 Protein A亲和层析如MabSelect 物细胞* 表达量可达 1-10 g/L Family进行快速捕获,再配合离子交换、疏水层析等进行精纯,以达到治疗用 要求 E.coli 利用基因工程技术表达人源化小 宿主杂蛋白、核酸、脂 对于 E.coli表达的蛋白,可以使用中空纤维结合层析进行纯化。不同孔径的中 分子抗体 (Fab, ScFv)、特殊抗 类、内毒素等 空纤维膜广泛用于菌体收集、裂解液澄清和包涵体洗涤,完全代替离心机,收 体及抗体融合蛋白。相比动物细 率高成本低。经过中空纤维洗涤的包涵体可考虑用Sepharose 4FF 先纯化包涵 胞,生产周期短,成本较低,但 体,再进行柱上复性,提高回收率 9, 10。也可用中空纤维膜做透析复性,不但 与相应抗原结合靶点减少 容易放大,而且效率更高。融合蛋白可考虑GST 或HisTag 表达系统,用 GST Sepharose 或螯合了镍离子的Chelating Sepharose 纯化11。两者都可进行柱上 酶切 12 酵母 表达量高,培养规模容易放大, 宿主细胞蛋白及培养基 用中空纤维膜做样品的澄清,之后用离子交换结合疏水层析进行纯化 13 Pichia 相比动物细胞成本低;糖基化 中蛋白 pastoris 仍然存在问题影响比活,难以 表达全分子抗体 转基因 可表达全分子抗体,能正确糖 动物蛋白及宿主抗体 转基因动物分泌表达如动物乳中,可采用中空纤维超滤技术进行分级分离, 动物 * 基化;但转基因较困难,表达 降低纯化难度,然后用高分辨率的疏水层析分离宿主抗体 不稳定 转基因 降低了动物细胞污染的可能性, 色素、植物细胞杂蛋白 用亲和层析纯化植物表达抗体效果比较好,会有少量色素吸附在亲和胶上, 植物 * 能够大规模低成本生产;破碎细 等 但可用分子筛除去 14, 15 胞及分离纯化难度加大 * 需考虑不同宿主病毒灭活验证问题。 表 4. 不同宿主生产抗体纯化策略 -4- 除上面所提到的各种杂质外,治疗用抗体在生产和纯化过程 中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱 酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体;另外,抗 体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径。针对这些变体, 一方面,在表达和纯化过程中选择参数 (如pH、盐浓度等) 时 要充分考虑到目标抗体的稳定性;另一方面,应控制细胞培 养的条件 (DO、渗透压等),同时加快下游分离纯化的速度,最 大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体,从而保证终产品 的均一性和高的比活,也有利于控制终产品的内毒素水平。 3.1 治疗用抗体生产技术选择(Wave细胞培养技术/膜 分离技术/层析纯化技术) 3.1.1 Wave细胞培养技术 (图6-7): 治疗用抗体的表达一般采 用大规模悬浮动物细胞培养,常用的细胞系为CHO和NS0,可 以选择批式流加或连续灌注的培养方式。连续灌注培养 (perfusion) 可以避免细胞代谢的废物在反应器中的累积,连 续收获培养液的同时不断加入的新鲜培养基以维持恒定的营 养物质浓度,使得细胞密度大大增加,从而提高抗体滴度、减 少反应器的体积,降低生产投资成本。批式流加 (Fed Batch) 的培养方式通过对培养基和培养条件的优化和严格控制,达 到较高的细胞密度和较高的产量,同时操作也更简单。 Wave反应器是兼容各种表达系统 (细胞、酵母、细菌等) 的 新型生物反应器,它通过无介入的搅拌提供温和高效的混合, 在极低的剪切力下大大提高传氧系数,尤其适合于高密度的 细胞培养和酵母、细菌等的发酵,目前已经广泛用于悬浮细 胞培养生产抗体、微载体细胞培养生产疫苗、腺病毒等各个 生物制药领域。 图 6. Wave反应器的主要组件 图 7. Wave反应器成功用于连续灌注培养 Wave反应器的优点 17: 1. 经济、高效:相比搅拌罐式生物反应器,Wave生物反应器 大大降低了前期的投资成本,同时对厂房要求低,可以节 省厂房建设和验证的时间,加快生物制品上市的速度。 2. 高传氧系数:Wave反应器采用高效温和的无介入搅拌,大 的气液表面积大大提高了传氧系数,同时剪切力远远低于 搅拌式鼓泡反应器,易于规模放大。这对于大规模高密度 细胞培养非常有意义。 3. 操作方便、不易污染:Wave生物反应器采用预先灭菌的无 菌无热原细胞培养袋 (图23),材质完全符合USPVI 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,即 开即用,避免了反应器日常清洗、灭菌和验证等操作。细 胞培养袋有多种扩展接口,方便的进行DO、pH的在线检 测和控制,还可以通过无菌焊接机实现全封闭可移动的生 物制品生产。 4. 验证:提供完整的验证支持文件,符合 GMP的生产要求。 Wave反应器适合批式流加和连续细胞灌注培养 (图24) 的方 式。目前,Wave反应器进行抗体的生产已经成功放大到500L 的规模 18,抗体表达量和产品质量均与搅拌式反应器相当。 3.1.2 膜分离技术: 下游的分离纯化单元操作包括一系列的膜 分离技术和层析技术,膜分离技术通常用于培养液的固液分 离 (澄清,代替离心机),样品的浓缩、纯化中间产物的缓冲 液置换以衔接不同的层析步骤,以及终产品的制剂和无菌过 滤等; 而层析技术则凭借高的分辨率去除特定杂质。因此,将 膜分离技术和层析技术有效的结合成为下游分离纯化工艺开 发的关键。 3.1.2.1 中空纤维膜:GE HC的中空纤维滤膜是近年来发展起 来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜 可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、 速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜 已经广泛用于生物制药的各个领域 19 (图 8)。 对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤 维微滤膜 (0.22或0.45m ) 进行澄清,而无需事先经过离心和预 过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具 有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接 进蛋白 A亲和层析进行纯化。 图 8. 中空纤维膜过滤生产系统和中空纤维滤柱 中空纤维膜澄清细胞培养液的优势: 1. 中空纤维澄清步骤少,速度快,收率更高 (通过有效的洗 滤可使样品收率稳定而且高于离心机),同时最大程度上 避免抗体降解而影响产品均一性。 2. 成本低: 中空纤维膜澄清不仅省去了连续流高速离心机昂 贵的前期投资和运转的日常维护成本,还节省了离心后死 端过滤 (NFF) 的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定,可 以通过清洗而反复使用,成本低廉。 3. 有利于内毒素控制: 中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受 1N NaOH 40-50˚C和氧化剂NaClO的清洗,从而有效去除 内毒素;封闭的系统,也更有利于生产过程中内毒素的控 制。此外,大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。 4. 低剪切力:中空纤维采用低剪切力 (Shear Rate = 4q/pr3, q-crossflow in cm3 (ml)/sec,r-fiber radius in cm) 的开放 式流道,不仅可以处理含有高固含量的料液,还避免了蛋 白质活性分子在高剪切力下的聚集变性,有利于抗体的稳 定。 5. 工艺耐用性强:相比死端过滤,切向流中空纤维澄清具有 很好的操作灵活性和耐用性,可以通过调整操作参数 (流 速,TMP) 处理不同性质的细胞培养液。 6. 易于线性放大:通过维持切向流速、TMP等参数恒定,方 便地进行线性放大,生产规模的Grandstand系统处理量 可达几千升料液,目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系 统已达400 M2且生产稳定。 中空纤维微滤澄清一般主要受孔径、中空纤维膜长度、管径 以及过程及样品条件等因素的影响 20, 21,样品澄清的操作方 式一般采用透过端出口控制的操作方式22,有利于降低TMP, 增加处理量,根据细胞密度和细胞活性比率的不同,一般的 操作条件为:选择 1 m m 直径的中空纤维管,剪切力 4000~8000/sec,透过端30~150LMH;处理载量达80~120L/ m2膜面积 (图9)。具体的参数需要根据不同的料液性质对膜 孔径、剪切力、透过速度等参数进行优化。 图9. 不同细胞密度和细胞活性条件下,不同孔径的中空纤维膜处理 抗体培养上清 90%细胞活性 5 ´ 105浓度 90%细胞活性 1.7 ´ 107浓度 60%细胞活性 1.7 ´ 107浓度 新推出的 RTP (Ready To Process) 中空纤维滤柱预先经过灭 菌,除用于培养液澄清和浓缩外,还可以结合Wave反应器 进行连续的细胞灌注培养 23,进一步增加细胞密度,提高产 量,或直接用中空纤维膜做抗体表达的细胞培养 24。 3.1.2.2 Kvick 盒式膜包:多步层析纯化得到的洗脱峰可以使 用GE HC的Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲 液置换 (图 10)。 图 10. 板式超滤系统及超滤膜包 (左图为自动液压夹具系统,最大 可带 7.5m2膜包,中图为最大可带 0.55平米的膜包系统) Kvick盒式膜包进行抗体浓缩/缓冲液置换的优点: 1. 无热原:高剂量抗体类药物的热原去除是非常关键的。很 多时候,仅用0.5N NaOH清洗难以彻底去除膜表面的热 原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定,可以使用 1N的 NaOH在 40-50度下进行彻底的SIP/CIP,避免最终超滤浓 缩时引入热原而影响产品质量。 2. 孔径均一、速度快:Kvick盒式膜包孔径更均一,甚至可以 使用50-100k的膜包 (其它公司必须用30k膜包) 进行抗体 浓缩而不漏过,速度更快,大大节省了操作时间。 3. 易于线性放大:通过保持流速、TMP等参数恒定,可以直 接线性放大到生产规模。通常样品浓缩的切向流速度控制 在500-700ml/min/ft2,TMP可以控制在 25-40psi (图 11), 在防止形成凝胶层的条件下取得最佳的单位透过速度 (FLUX),并取得最优化的膜的载量。 图 11. FLUX-TMP条件优化 (上) 及膜载量优化 25 (下) -5- 浓缩样品的缓冲液更换通常用洗滤的方式完成,洗滤方式通 常有一次性加入置换缓冲液,分次加入置换缓冲液或连续加 入置换缓冲液,连续加入置换缓冲液的方式是最有效,缓冲 液的消耗也最小 (图12)。通常在层析的衔接步骤进行缓冲液 更换,连续方式洗滤5个体积就可以了,而在最后一步制剂 时进行缓冲液更换则需要洗滤 10个体积以进行彻底的缓冲 液置换。 图 12. 洗滤方式与缓冲液的消耗 无论是中空纤维膜切向流,还是盒式膜包切向流工艺条件的 开发与优化,都可以在 UNICORN控制的全自动膜过滤系统 AKTAcrossflow (图 13左) 上来进行,其得到的参数可以线性 放大到生产,最优化的生产参数可以节省投资成本,提高膜 使用与生产效率。对于使用全自动的 UNICORN软件控制的 UNIFLUX系统 (图 13右) 进行抗体样品的澄清生产,其透过 控制非常稳定,可以有效保持生产的稳定性,批与批之间重 复性好。 图13. 全自动膜过滤实验室工艺开发与优化系统 (左) 和自动化 生产系统 (右) 3.1.2.3 ULTA Pure SG 26 和 ULTA Pure HC 27 新型除菌滤器 (图 14):Kvick盒式膜包浓缩后的样品,最终经过ULTA Pure 0.22u 无菌过滤器进行除菌过滤。ULTA SG系列除菌过滤器具有过 滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点,细菌 挑战实验表明其除菌能力大于7 log。除菌过滤过程的优化主 要从三个方面入手:操作过程中过膜压力的控制、过膜流速 以及单位膜载量控制,这三个参数优化以后,可以在同种类 型、材质的NFF膜上进行线性放大,否则很容易影响收率 (图 15)。 图 14. 除菌 NFF 过滤器 图 15. 操作压力降曲线 3.1.3 不同亲和层析介质捕获技术及优化策略 3.1.3.1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层 析介质与抗体的结合 目前,约70-80%的抗体纯化使用 Protein A、Protein G亲和 层析 28。蛋白 A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株 系,它含有5个可以和抗体 IgG分子的Fc段特异性结合的结 构域。蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上,可以特 异性的和样品中的抗体分子结合,而使其他杂蛋白流穿,具 有极高的选择性,一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。 1个蛋白A分子至少可以结合2个 IgG。蛋白A也可以结合另 一些免疫球蛋白,如用于某些种属的 IgA、IgM的纯化。 天然 (Native Protein A) 和重组的蛋白 A (rProtein A) 对于 IgG 的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋白A经改造后含有一 个C末端半胱氨酸,可以单一位点偶联于琼脂糖上,降低了 空间位阻,增加了与 IgG的结合能力。蛋白 A与 IgG的结合 强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型,而其动态结合 能力则决定于结合强度 (解离常数) 及传质阻力等多种因素 (例如上样时样品在柱内的停留时间)。 3.1.3.2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合 29 蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白,为三型Fc受 体。其通过类似于蛋白A的非免疫机制与抗体的 Fc段结合。 像蛋白A一样,蛋白G可以与 IgG的 Fc区域特异性结合,不 同的是,Protein G Sepharose可以广泛、更强地结合更多类 型的IgG, 多克隆IgG及人IgG,同时血清蛋白结合水平更低, -6- ˙˙ 纯度更高,配基脱落也相对更低。此外,蛋白G还可以和某 些抗体的 Fab和 F (ab’)2段结合。 3.1.3.3 Protein A 、Protein G 亲和层析方法优化 由于不同抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力不同,有必要单独 优化结合和洗脱条件和层析柱载量,层析条件优化的过程可 以通过用自动化层析系统如 AKTA来自动快速完成。以下是 一个杂交瘤细胞培养小鼠单抗的纯化条件探索 (表5,图16- 19)30。 图 18. Superdex 200精细纯化 Lane 1: LMW; Lane 2: Starting material; Lane 3: PrA elution; Lane 4: PrA Flow through; Lane 5: Polishing-Superdex 200; Lane 6: LMW 1 2 3 4 5 6 94.0 k 67.0 k 43.0 k 30.0 k 20.1 k 14.4 k 第一步用rProtein A亲和层析,洗脱后 自动上样过Superdex 200分子筛精纯 图 19. 全自动二维抗体纯化及纯化结果电泳图 (还原电泳) 3.1.3.4 MabSelect ——大规模抗体纯化新型蛋白A亲和层析 介质 32, 33 MabSelect 是第一个使用高流速琼脂糖凝胶 (High flow Agarose) 作为骨架的新型蛋白A层析介质,专为大规模抗体 纯化而设计,适合快速高效的进行抗体生产和放大,已经成 为单抗纯化和放大的标准介质。 Mabselect的特点包括: 1. 高流速琼脂糖作为骨架: 介质的刚性和传质性能大大优于 传统的Sepharose 4FF和 6FF琼脂糖骨架,可以在大规模 生产时,使用更高的流速而保持更高的载量,大大提高生 产效率。 2. 更高的流速和动态载量:蛋白 A经基因工程改造,C端含 一个半胱氨酸,形成一个定向的硫酯键 (见图21),同时增 加了对IgG的有效结合。蛋白A和凝胶偶联时采用了全新 的单点偶联工艺,降低了空间位阻,因此可以在使用更高 流速的条件下增加动态载量:在线形流速为500cm/hr和 柱床高度为20cm (停留时间 2.4min) 的条件下,每毫升 MabSelect 的动态载量可以达到>30mg IgG。在纯化特性 (杂蛋白去除、产品纯度等) 方面明显优于其它的蛋白A亲 和介质。图20、22是几种不同的蛋白A介质纯化人 IgG的 动态载量与线形流速的比较。 3. 更低的非特异性吸附,抗体纯度更高:和传统的rProteinA FF介质相同,Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最 大程度上降低了非特异性吸附,使得洗脱峰中杂蛋白和 DNA更少,有利于后期抗体的精细纯化。 优化条件 优化过程 优化目的、结果 rProtein A柱 利用 AKTA 的自动探索功能 尽量避免杂蛋白的结 结合缓冲液中 (scouting) 连续尝试不同浓 合,在载量与纯度间 所需NaCl 浓度 度的NaCl (0-3.5M) 下单抗 取得平衡。最佳条件 的载量、收率和纯度。 为NaCl 2.5M。 rProtein A柱 利用 AKTA 的自动缓冲液配 避免剧烈的洗脱条件 洗脱pH 置功能 (bufferprep) 在 pH (如 pH<3.0) 易导致抗 7-2.5范围逐步降低 pH, 找 体失活。最佳条件为 最佳的 pH洗脱条件。使 pH 4.5。 用精氨酸作为洗脱缓冲液, 更利于保护抗体活性, 提高 回收率和防止抗体聚合 31。 Superdex 200 利用自动探索功能 (scouting) 去除微量杂质和二、 柱上样量 尝试不同上样量 (1-5%柱体 多聚体,达到最终 积),并探索连续自动进样 所需纯度。 的条件。 ˙˙ ˙˙ 图 16. AKTA自动摸索HiTrap rProtein A FF上样最佳盐浓度˙˙ 图 17. AKTA 自动摸索 HiTrap rProtein A FF最优 pH洗脱条件: pH梯度从 pH 7.4到 pH 3.0 ˙˙ -7- 著名的抗体生产商IDEC公司34以及R. Hahn45的研究显示, Mabselect对 CHO细胞 CHOP (宿主蛋白) 的吸附比其它蛋 白A介质如 Prosep A低 7倍 34。 Robert L. Fahrner等对于多种商品化的 Protein A介质的性 能进行了研究比较,结果表明:以亲水的琼脂糖凝胶作为 骨架的蛋白A介质所得抗体的 DNA残留量比 Prosep A低 30%35。 4. 更低的蛋白 A 脱落:MabSelect由于通过新型环氧共价交 联技术,蛋白A的脱落比其它同类介质低,这不仅有利于 抗体纯化,还延长了介质的使用寿命,降低生产成本。微 量的脱落可以在后续的层析中,如凝胶过滤或离子交换层 析有效去除。 5. 生产过程无动物血清成分:配基重组蛋白A在大肠杆菌中 表达,通过多步柱层析纯化,完全适用于抗体药物纯化。 6. 更易于工艺的线性放大:通过实验室条件的优化, MabSelect可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的 条件下,通过增加柱直径进行线性放大。装填在内径为60- 80厘米层析柱时,可以在一个工作日处理超过上万升高表 达的抗体培养液36。 图 20. 蛋白 A亲和凝胶载量测定 图21. MabSelect蛋白A的单点定向硫酯键偶联方式增加了 对 IgG的有效结合 图22. 不同凝胶动态载量受线性流速影响比较 (MabSelect在柱床高 度 20cm,线性流速 500 cm/h时动态载量达 32 mg hIgG/ml) 7. MabSelect 易于清洗与除菌,寿命更长、更经济:在长期 连续的生产中,介质寿命是成本效益的一项重要指标,有 效的CIP有助于延长介质使用寿命,但蛋白A配基比一般 层析介质的配基对苛刻的在位清洗 (CIP) 更加敏感,往往 不能耐受NaOH,只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清 洗。而MabSelect的 CIP和除菌程序简单,一般用很常规 和经济的试剂如50 mM NaOH + 1M NaCl或 50 mM NaOH + 0.5 M Na2SO4溶液就可以有效去除沉淀和变性物质; 用 非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质; 用0.1M醋酸和20%酒精可以SIP除菌。由于CIP所使用的 化学试剂不能被重复使用,CIP试剂的成本对整个生产成 本的影响不容忽视。使用尿素、盐酸胍等作为CIP试剂,长 期的CIP成本甚至超过了蛋白 A介质本身的价值 (图 23)。 经测试,Mabselect配合 CIP (50 mM NaOH + 1 M NaCl) 纯 化三百次后,抗体产品纯度与回收率不变 (图 24)37, 38。 图23. 使用不同试剂有效在位清洗 (CIP) 时的成本比较。物料来源: Sigma 2003, NaCl>99.5%, 5 kg; NaOH>98%, 1 kg; Urea>99.5%, 5 kg; Gua-HCl>995, 10 kg。38 图24. Mabselect每使用5次进行一次CIP (50 mM NaOH + 1 M NaCl), 第 1-299次纯化的选择层析图谱,每次纯化回收率 95-100%38。 3.1.3.5 MabSelect Xtra ——载量更高的商品化蛋白A亲和层 析介质 39 Mabselect Xtra介质是目前市场上所有的商品化蛋白 A介质 中载量最高的亲和层析介质,其动态载量超过41mg/ml介质 (2.4min)。在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积, 从而降低生产成本。 -8- Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来, 它使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖 (high flow agarose) 作 为骨架,同时减小介质粒径 (75u)。这样不仅增加了比表面 积和配基密度,还降低了传质阻力,从而有效的增加动态载 量 (图 25)。 图 25. Mabselect Xtra介质的设计及和其它类型蛋白 A亲和胶动态 载量比较 40 R.Hahn等41的数据表明Mabselect Xtra的载量高于Prosep vA Ultra等其它蛋白A亲和介质。K. Swinnen等42也对近年来较 新的蛋白 A亲和介质进行了比较,结果显示:Mabselect的 动态载量几乎不受样品中抗体浓度的影响,因而Mabselect 介质的工艺耐用性 (Robustness) 最好;而Mabselect Xtra的 载量最高,Mabselect Xtra对CHO细胞HCP (宿主蛋白) 的吸 附比其它蛋白 A介质更是低了近 10倍 43。 除载量更高外,Mabselect Xtra的性质和Mabselect相似,比 传统的 Sepharose 4FF介质流速更快,刚性更好;可以使用 50mM NaOH£´1M NaCl进行有效的CIP;0.1M 醋酸 in 20%乙 醇用于SIP消毒;也具有极低的非特异性吸附,产品纯度高, 介质寿命长 40。 3.1.3.6 Mabselect Sure ——唯一耐强碱的蛋白A亲和层析介 质 44 在生物药物的生产过程中,为避免细菌、内毒素或病毒的污 染,需要对层析系统、介质等进行在位消毒 (SIP),以保证产 品的质量。另外,变性的蛋白、脂类和DNA等分子会不可逆 的沉淀在层析柱的顶部而降低柱效和传质速度,从而影响收 率和产品质量。 0.1~1N的氢氧化钠可以有效的除菌除热原以及灭活病毒,而 且对于沉淀的蛋白、脂类和核酸具有很好的溶解作用,可以 有效的对层析介质进行在位清洗 (CIP) 而延长使用寿命,因 此使用氢氧化钠进行消毒和清洗成为生物制药生产中SIP/CIP 的经典方法。这一点对于内毒素要求极为严格的抗体生产来 说尤为重要。 图 26. 盐酸胍和碱清洗效果的比较 图 27. SuRe配基的结构 但天然或重组的蛋白A配基对NaOH非常敏感,强碱性条件 下易变性或脱落,因此只能选用高浓度的盐酸胍或尿素进行 清洗,但清洗的效果远远不如NaOH (图26),而且清洗成本 非常高 (图 23)。 天然或重组的蛋白 A配基具有 5个不同的抗体 Fc结合结构 域,每个域均可以和IgG的Fc段结合,但不同的域结合强度 略有差异。将其中的 B domain中对碱敏感的 Asp氨基酸突 变为耐碱的氨基酸 (图 27),得到新的四聚体配基 SuRe Ligand,将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上,成为耐碱 的新型高流速Mabselect SuRe蛋白 A层析介质。 Mabselect SuRe的优点: 1. Mabselect Sure可以耐受0.1~0.5N的氢氧化钠:使用高达 0.5N的氢氧化钠进行在位清洗/消毒大大降低了抗体产品 被内毒素污染和批间交叉污染的风险,清洗效果更好,有 利于延长介质使用寿命,同时也大大降低了CIP/SIP的成 本。 -9- Mabselect SuRe介质可使用 0.1N NaOH 15min/circle进行 “纯化-清洗”循环200次以上仍保持稳定的载量 (图28), 对碱的耐受性远远好于其它的蛋白A亲和层析介质 44。 图28. Mabselect SuRe介质对碱的耐受性 (上) 和0.1N NaOH 15min/ circle处理低脱落 (下) R.Hahn的研究也表明:与其他蛋白 A亲和介质相比, Mabselect SuRe具有无可比拟的稳定性,配基脱落最少, 寿命最长,而且宿主蛋白HCP的残留比Prosep A低10倍以 上43。 2. 更温和的洗脱,避免抗体聚集,提高收率:新的 SuRe配 基是一个同型四聚体配基,避免了不同配基与抗体Fc段 亲和性的差异,也消除了某些域对Fab段的亲和作用,使 得洗脱条件更加均一而温和。相比以rProtein A为配基的 介质,Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱,有 效的避免抗体在低pH下的聚集,产品纯度和均一性更高, 浊度也更低46。 3. 不同抗体洗脱所需 pH差异小:由于消除了对抗体 Fab段 的亲和作用,使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需 的条件更接近 (图29),有利于平台技术的建立,进一步降 低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。 图 29. 不同抗体在Mabselect和 SuRe介质的洗脱 图 30. SuRe配基的稳定性 4. SuRe配基稳定性更好:新型的SuRe配基对碱和蛋白酶更 稳定47 (图 30),纯化过程中脱落更少 (<10 ppm),有利于 后期泄漏配基的进一步去除。甚至只有1-3ppm的脱落55, 无需在后续步骤中增加专门去除Sure配基的步骤,即可达 到FDA的蛋白 A配基残留标准。 Mabslect SuRe介质是市场上唯一耐碱的蛋白 A亲和层析介 质,寿命最长,稳定性最好,这一点已被文献所证实45。纯 化所得的抗体除蛋白A泄漏更少、纯度更高之外,其它产品 性质 (如 CHOP、电泳、IEF等) 和Mabselect介质相当 46。 3.1.3.7 MabSelect SuRe 介质成功案例 48 Lonza Biologics是全球最大的抗体合同生产商 (CMO) 之一, 为了开发一个稳定的20,000L的抗体生产工艺,其纯化开发 部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较,他 们发现Mabselect SuRe的动态载量高 (大于 26mg/ml,线性 速度>500cm/hr,结合时间小于2.4min条件下),使用寿命最 长 (每个cycle都用0.1M NaOH清洗15mins,测试100个Cycles 后宿主细胞蛋白和DNA的去除效果, 蛋白A的脱落都无明显 变化)、蛋白A脱落最低 (平均 5.4ng Protein A/mg抗体),实 验数据明确支持放大到1.4M直径的柱子用于20000L培养规 模的经济生产。 目前,已有多家大规模抗体生产厂商,将其它蛋白A亲和胶 转换为寿命更长、稳定性更好的MabSelect SuRe用于抗体生 产。MabSelect SuRe 也成为市场上销量最大的抗体生产亲和 凝胶。 -10- 图 31. Lonza Biologics开发Mabselect SuRe于大规模治疗用单抗生 产 3.1.4 层析精细纯化技术: 层析技术是抗体分离纯化的核心技术,一般采用经典的三步 纯化策略:粗纯-中间纯化-精细纯化。其中,粗纯的主要 目的是捕获、浓缩和稳定样品;粗纯一般使用蛋白A亲和层 析一步即可达到95%以上的纯度;中间纯化和精细纯化去除 特定的杂质,如HCP、DNA、聚集体和变体等,常用的层析 技术有离子交换、疏水层析等,达到最终治疗用抗体所需的 纯度 (图32)。随着凝胶技术的发展,一些新型复合作用凝胶 的出现:如Capto Adhere的上市,抗体层析纯化工艺也在向 两步层析技术演变 (图 33)。 图 32. 一般的Mab下游层析纯化三步曲 图 33. 抗体纯化中的三步层析工艺与最新两步层析工艺 3.1.4.1 新型高流速琼脂糖基质的离子交换介质: Capto Family 系列 新型的Capto系列介质是以高流速琼脂糖 (High Flow Agarose) 为骨架,同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链,这样不仅增 加了比表面积,同时降低了传质阻力和空间位阻,使得介质 在高流速下的动态载量大大增加,有利于提高生产效率,降 低成本 49。 与传统的SP,Q Sepharose FF介质相比,新型的Capto S,Q 系列离子交换介质刚性更好,流速更快,同时具有更高的载 量 (图 34)。Capto系列介质可以装填在直径 60cm的工业层 析柱中使用高达 500cm/h的流速进行纯化 (柱高 30cm)。这 样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装 (图 3 5, 300mm生产规模层析柱,20cm柱高),还大大提高了生产 效率,每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分 离纯化过程中产生各种变体和聚集体,使得收率更好,终产 品的活性更高、性质更均一。 图 34. Capto Q和Q Sepharose FF载量比较 两步合并一步 -11- 图 35. 制备层析柱中 Capto介质的流速-压力曲线 3.1.4.2 Capto Adhere ——实验设计 (DoE) 与 HTPD 技术 为了进一步减少抗体分离纯化步骤,提高特定杂质的去除效 率,以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要,2007年初, GE HC推出了新型混合作用模式的强阴离子交换介质: Capto Adhere介质。 Capto Adhere介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计,其配 基 (N-Benzyl-N-methylethanolamine) (图 36) 综合了阴离子 交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式50, 51,因此对于抗 体的聚集体具有非常独特而高效的去除能力。此外,通过有 效的实验设计 (Design of Experiment,DoE),Capto Adhere 介质还可以同时有效去除泄漏的蛋白A配基、宿主蛋白、核 酸、内毒素和潜在的病毒,并使得结合MabSelect SuRe的抗 体的两步层析纯化工艺成为现实 52。 图 36. Capto Adhere基架和配基 首先,需要优化抗体在Capto Adhere上的结合条件,确定的 实验目标为:产品收率>90%,终产品中二聚体和多聚体含 量 £ 1%,蛋白 A残留量 A £ 5ppm,HCP £ 50ppm。确定的 主要影响因素和实验设计范围为:电导:2-15mS/cm,每毫 升凝胶上样载量为75-300mg/ml (流穿模式),pH范围需要做 起始结合条件确定:通常在低电导条件下 (如2mS/cm时) 样 品完全不结合到有少量样品结合的pH条件 (以pH 6-8为例, 图 37)53。 图 37. DoE优化结合条件 图 38. DoE优化结合条件 Load pH Cond (mg/ml) (mS/cm) 75 6 2 75 8 2 300 6 2 300 8 2 75 6 15 75 8 15 300 6 15 300 8 15 187.5 7 8.5 187.5 7 8.5 187.5 7 8.5 75 7 8.5 300 7 8.5 187.5 6 8.5 187.5 8 8.5 187.5 7 2 187.5 7 15 确定好实验条件后,可以采用HTPD Predictor同时平行做所 有不同的结合条件,将试验结果相应于响应因子进行统计学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 (如图 38 左上角中上样量/ pH/ 电导对收率的影响分 布),合并分析结果可以得到满足实验目标的操作范围,如图 3 8 图中的红色区域 5 3,对满足实验目标的实验条件用 AKTAdesign系统进行验证和微调 (图39)54。这样的实验过程, 既可以节约样品、缩短工艺开发的时间,所开发的工艺还具 有很好的稳定性和可验证性。 ˙˙ 图 39. HTPD条件筛选- AKTAdesign验证与微调-线性放大˙˙ Capto Adhere已经成功的用于多种抗体的精纯 (表 6),对于 不同的抗体,层析条件不同。流穿模式的Capto Adhere将宿 主蛋白、脱落的蛋白A和聚集体降低到很低的水平,载量可 达 100-200mg/ml介质,单步收率>90%。 此外,Capto Adhere还具有很强的病毒去除的能力,如MVM 病毒的去除能力可达5.9个 Log51。目前,新型的两步法抗体 层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体 的分离纯化,各项指标均符合治疗级抗体的要求。 Capto Adhere层析纯化还可以和阴离子交换 (Capto Q) 和疏水层析 等结合使用,以达到更高的质量要求。 3.1.4.3 全自动生产层析系统:AKTAProcess 系统 近年来,生物制品的质量标准和各种法规的要求越来越严 格,需要生物制品生产厂家提供完整的工艺验证资料和法规 支持文件,如清洗验证、管路材质生物相容性等相关文件。 AKTAProcess层析系统是全自动的工业层析系统,该系统耐 压高 (6-10bar)、流速范围广 (可达1800L/h),精度高,使用 Unicorn软件进行自动控制,保证了工艺放大后的重复性和 稳定性,提高生产效率。同时,卫生级的流路设计和管路材 质完全符合 USP Class VI标准,通过了 FDA 21 CFR Part 11 认证 (图4
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