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(一)立项依据与研究
内容
财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容
1、项目的立项依据(附主要的参考文献
目录
工贸企业有限空间作业目录特种设备作业人员作业种类与目录特种设备作业人员目录1类医疗器械目录高值医用耗材参考目录
)。
肝移植目前已成为治疗终末期肝脏疾病的有效手段,然而仍需长期应用免疫抑制剂来预防和治
疗排斥反应,这些药物不仅具有一些严重的副作用,而且可能会抑制免疫耐受的产生,使患者必终
生应用免疫抑制剂。移植物排斥反应的本质是免疫应答,探索控制移植后的排斥反应,提高移植物
的存活率,一直是移植免疫学家致力攻克的堡垒。近年来器官移植已经取得重要进展,移植前的组
织配型、供体的预处理以及移植部位的选择等手段明显减轻了移植免疫排斥反应,各种免疫制剂的
长期应用进一步控制了排斥反应。但由于无关人群中,HLA 相同的个体十分罕见,而免疫抑制目前
的方法有许多明显的副作用,慢性移植排斥也没有有效控制的方法,因此临床器官移植中抗移植排
斥的问题仍没有彻底解决。目前认为解决这些问题的关键是在于诱导受者对供体组织器官的免疫耐
受。90 年代以来,随着基因转移技术的迅速发展及基因治疗理论和实践的不断完善,使基因治疗成
为在分子水平研究移植免疫耐受的重要手段,移植中应用基因治疗有许多优越性,活体内基因转导
不仅可以产生持续的生物调控基因产物的表达,而且能在低温下进行而不影响肝脏的功能(1)。免
疫耐受是指免疫系统接触抗原后产生的特异性无应答或低应答性。Medawar (1953 年)(2)首先报
道了给新生鼠注射同种淋巴细胞诱导获得性移植免疫耐受性,这极大地推动了移植免疫耐受研究的
进展。近年的研究表明通过基因治疗阻断协同共刺激信号以及建立受体体内微嵌合体在诱导移植免
疫耐受方面发挥重要作用(3,4),然而目的基因转染载体的选择及移植供体基因修饰的最佳时间和
有效方法仍存在很大争议。在器官移植中,细胞因子构成了一个非常复杂的网络结构并发挥着相互
作用。1989 年 Fiorentio 等发现 TH2 细胞株 D10.G4.1 能分泌一种抑制 TH1 细胞功能的因子白细胞介
素-10(interleukin-10,IL-10)。有研究表明 rhIL-10 可抑制 Kupffer 细胞产生中性粒细胞特异性的化
因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant ,CINC)而减少中性粒细胞的浸润和缺血再灌注损
伤的程度,延长大鼠肝移植后生存时间,夏家红发现 IL-10 参与调节移植排斥反应,其表达水平
与移植物存活时间成正相关。Deng 等应用 IL-10 和 TGF-β基因,在异种胰岛移植模型中延长了胰岛
移植物的存活时间。最近 Shinozaki(7)等研究也表明 IL-10 能抑制大鼠肝移植后排斥反应并提高移
植物存活期。IL-10 是由多种细胞产生的具有多样性生物学活性的细胞因子,可降低抗原递呈细胞
MHCII 类抗原表达,IL-10 还可抑制 IL-2、IFN-r、TNF 等细胞因子的合成,并且可以降低 ICAM-1 等
黏附因子的表达和维持树突状细胞的幼稚状态,从而在降低移植物排斥反应和诱导受体体内的 GM 。
许多研究表明 DC 表型在嵌合水平方面发挥重要作用,以往多在供体器官灌洗过程中导入目的基因,
近来研究发现病毒载体介导的目的基因表达一般 2-3 周后达到高峰,而器官移植排斥反应多发生在
移植术后的一周,所以治疗性目的基因的表达与排斥反应的发生往往不同步,因此选择有效的目的
基因转染方法和最佳的基因导入时间至关重要。DC 几乎存在于哺乳动物的所有器官中,未成熟 DC
可长期存在于非淋巴器官中,具有很强的抗原识别、捕捉和处理能力,成熟 DC 的 T 细胞刺激能力
大大增强,从而启动 T 细胞抗原特异性增殖并激活免疫应答。在器官移植中,异体移植物发生的免
疫应答反应十分复杂,在致敏和识别反应过程中起关键作用的是抗原递呈细胞(antigen presenting cell,
APC)。其中树突状细胞(dentritic cell, DC)以其强大的专职性抗原递呈能力而备受注目[8]。人们对
不同组织来源的 DC 表型分析表明,刚从非淋巴组织分离出来的 DC 为不成熟的 DC,无法激活同种
异型的 T 细胞。不成熟的 DC 与成熟的 DC 相比其表达的 MHC Ⅱ分子很少,另外表达的两种共刺分
子 B7 -1 和 B7 -2 也很少,这样不成熟的 DC 无法激发同种异型的 T 细胞免疫反应。有文献报道
从小鼠骨髓分离,在体外经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子+β型转化生长因子-CSF+TGFβ)培
养、扩增的 DC 前体细胞在体外不能激发异体 T 细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)。这种细胞改变了
供者与受者之间的免疫反应过程,在宿主体内形成了一个较高的“微嵌合性”(microchimerism)水
平[10]
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能的形成与诱导微环境关系密切,最近的研究更加集中在通过各种方式改变 DC 分子表达而获得耐
受性,使 DC 能最大限度地应用于移植排斥反应的治疗。目前非病毒基因转染的方法简单易行、安
全,但转染效率不甚理想且基因表达为瞬时的。大多数野生型病毒对机体都具有致病性,因此需要
对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但是由于病毒的
多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发
展的关系等的认识还很不全面 ,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近 20 年来,只有
少数几种重组 DNA 病毒如腺病毒、腺相关病毒和重组 RNA 病毒如逆转录病毒、短病毒(Lentiviral)
等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用,其优点是转染效率高,但缺乏确切的
组织特异性和靶向性。逆转录病毒将治疗基因转入靶细胞并将外源基因整合入基因组,实现目的基
因持久稳定的表达,但只能感染分裂相的细胞,容量有限,更难以克服的是随机整合,在理论上有
使靶细胞发生插入突变和激活原癌基因或使抑癌基因失活的可能。Donahuc RE 等用缺陷型逆转录病
毒感染 8 只猴的脊髓细胞再移植回体内,有 3 例出现恶性 T 淋巴瘤,说明逆转录病毒作为载体存在
潜在的危险。短病毒可同时感染分裂或非分裂相细胞,可应用于不同细胞类型的基因转移。目前应
用的载体都有着不同的缺陷,理想的载体应为安全、高效、稳定、特异、可控及简便易行的载体腺
体相关病毒(adeno-associated virus,AAV)独特的生物学特性使其成为许多基因治疗的理想载体,
目前,在 rAAV 载体的制备、基因治疗中基因型的选择以及扩大其包装容量方面都有了很大进展(11,
12,13,)。rAAV 是微小病毒科家族的成员之一,是一种单链线状 DNA 病毒。约 80%的成年人感染
过 rAAV,但尚未发现该病毒与人的任何疾病相关。rAAV 是目前已知的唯一对人无致病性的病毒,
可感染非分裂细胞,并且对分裂期细胞和静止期细胞具有同样的感染能力,宿主范围广,可整合于
靶细胞基因组,或以附加体的形式存在,有利于目的基因的长期、稳定的表达,由于其细胞介导的
免疫性低,机体产生的目的基因抗体的可能性小,具有低免疫原、免疫毒的特点。目前,本课题组
已完成 hIL-10 基因的克隆、鉴定和逆转录病毒载体的构建(14),并且在肝移植前转染供体肝脏,
大大降低了大鼠肝移植后排斥反应的发生和程度(15,16)。虽然 hIL-10 应用器官移植的基因治疗,
在降低移植物排斥反应和提高存活期方面均取得令人鼓舞的成绩,但成功诱导免疫耐受尚未成熟,
我们分析免疫耐受可能是多种因素共同作用的结果,并且与目的基因载体的选择和基因转染的效率
密切相关,基因治疗研究中,重组逆转录病毒和重组腺病毒在基因转移载体中一直占主导地位。但
近年来这一情况有所改变,用 AAV 作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。AAV 具有以下特
点:(1)安全性好。迄今从未发现野生型 AAV 对人体致病; 重组 AAV 去除了野生型 AAV 基因组的
96%,进一步保证了安全性;(2) 宿主范围广。不仅可转导分裂细胞,而且可转导静止期细胞;(3)
野生型 AAV 可整合到人基因组 19 号染色体 q 臂的特定位置,利用这一特点,有可能研制出具有特异性
整合功能的 AAV 载体;(4) AAV-2 的基因组仅 4681 个核苷酸, 便于用常规的重组 DNA 技术进行
操作;(5) 物理性质稳定。在 60°C 不被灭活, 能抵抗多种有机溶剂和离子去污剂的作用; (6) 重
组 AAV(rAAV)病毒可长期稳定地表达外源基因, 构建 hIL-10 重组腺相关病毒载体可能发挥更有效
的治疗作用(17 )。基因转染的效率主要取决与转染方法、病毒滴度和灌注时间,本研究我们尝试
应用一种全新的夹闭灌注转染技术,它弥补了注射或循环灌洗后病毒载体很快被循环血液所稀释及
补体清除的不足,而且采用门静脉和肝动脉双重灌洗,增加了病毒载体的浓度及与供肝的有效作用
时间,进一步提高了供肝转染的效率,另外,移植前的预处理可以减少病毒感染其他细胞或肝外组
织,不易激发机体对病毒的免疫反应,有助于延长目的基因的有效表达时间。腺相关病毒载体包装、
纯化技术的日益更新、成熟为我们的实验提供了有利的支持。本研究意在构建新型的携带 hIL-10 基
因的 rAAV 载体,并且采用夹闭灌洗和循环灌洗两种转染技术,在移植前的不同时间特异性地转染
整和作用于移植供体肝脏,肝脏中含有大量的树突状细胞,hIL-10 基因修饰供体器官的同时也转染
DC,而 hIL-10 基因可维持树突状细胞的幼稚状态,有助于移植后在受体内诱导嵌合状态,同时发挥
hIL-10 和树突状细胞的双重作用,以期降低排斥反应、延长移植物存活并诱导免疫耐受,探讨基因
转染供体器官的最佳时间及有效方法,确定其诱导免疫耐受的有效性和安全性,这一技术的成熟和
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完善将有助于对降低器官移植排斥反应、诱导免疫耐受方法和机制的深入研究[18],也为将来在大动
物实验和临床应用的开展奠定实验基础。
参考文献:
1、Chang GJ,Liu T,Feng S,et al.Targeted gene therapy with CD40Ig to induce long-term acceptance of
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Orthotopic Liver Transplant Model in the Rat . Liver Transplantation, Vol8,
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4、Chang A,Blum M,Blair K et al. Prolonged anti-CD40 ligand therapy improves primate allograft cardiac
survival(abstr) . Transplant Proc , 1999,31:95.
5、邹小明,杨维良,袁友萍等. 重组人白介素 10 抑制肝移植后再灌注损伤和排斥反应的探讨.中华
外科杂志,2000,38(11):876.
6、Deng S,Ketchum RJ,Yang ZD,et al. IL-10 和 TGF-βgene transfer to rodent islets: effect on xenogenetic
islet graft survival in naive and B-cell deficient mice. Transplant Proc,1997,29:2207-2208.
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orthotopic liver transplantation. Gene Therapy,1999,6:816-822.
8、Ichim TE,Zhong R,Min WP. Prevention of allograft rejection by in vitro generated tolerogenic dendritic
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10、Starzl TE et al. Cell migration, chimerism, and graft acceptance. Lancet. 1992; 339:1579-1582.
11 、Xiao X, Li J, Samulski J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the
absence of helper adenovirus. J Virol. 1998. 72:2224-2232.
12、Zhou XH and Nicholas Muzyzca. In vitro packaging of adeno-associated virus DNA. J Virol.
1998.72:3241-3247.
13、伍志坚,吴小兵,侯云德.具有 AAV 载体包装功能的重组 HSV 的产生. 科学通报. 1999.44(5):
506-509.
14、邰升、张新宇、胡占良等.人白细胞介素-10 基因的克隆与逆转录病毒载体(MSCV-hIL-10)的构建.
生命科学研究:2003 年中国博士后生命科学学术研讨会暨院士论坛.2003.11:176-179.
15、邰升,陈大志,迟强等. 人 IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠混合淋巴细胞培养的影响. 中华新
医学,2002,3(6):492-494.
16、邰升,陈大志,迟强等. 人 IL-10 逆转录病毒载体的构建及对大鼠原位肝移植存活的影响. 中华肝胆
外科杂志,2003,9(2):91-94.
17、Zhen-Fan Yang, Xiao-Bing Wu, Tung-Yu Tsui et al. Recombinant Adeno-Associated Virus Vector: Is
it Ideal for Gene Deliuery in Liver Transplantation? Liver Transplantation ,2003,9(4): 411-420.
18、 Fandrich F, Ruhnke M, Dresske B, et al. Tolerance-inducing strategies in transplantation surgery-current
status and perspectives. Langenbecks Arch Surg. 2003 ,Sep; 18 [Epub ahead of print].
2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。
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A、 研究主要内容
1. 大鼠原位肝移植模型建立(改进的缝合法)
我们在 Kamada 法建立大鼠原位肝移植模型的基础上加以改进,重新设计血管套接(cuff) 的结
构,同时改进了经典方法的游离顺序及吻合方式,缩短无肝期并大大提高了模型的成功率,建立稳
定的大鼠原位肝移植模型。
2. 构建 hIL-10 cDNA 质粒载体(pSNAV-hIL-10)
以人外周血单核细胞 RNA 为模板,经 RT-PCR 扩增获得 hIL-10 基因片段,将 hIL-10 目的基因
正向插入 pSNAV 多克隆位点,连接转化后,制备 pSNAV-hIL-10 重组质粒,采用酶切和测序两种方
法鉴定 pSNAV-hIL-10 重组质粒。
3. 构建携带 hIL-10 基因的重组腺相关病毒载体(rAAV- hIL-10 )并获得高滴度产毒细胞系
将获得具有完整表达盒的 rAAV 载体质粒转染 BHK-21 细胞,经 G418 选择培养后得到了
rAAV-hIL-10 的载体细胞株,细胞培养后生产 rAAV ,浓缩、纯化后获得高滴度的产毒细胞系。
4. 诱导可耐受供肝方法的研究
大鼠原位肝移植前选择不同时间分组采用夹闭灌洗或循环灌洗的方法转染 rAAV- hIL-10 和
rAAV-LacZ 至供体肝脏,进而确定最佳的目的基因转染时间和有效的转染方法。
5. rAAV- hIL-10 诱导免疫耐受的研究
通过大鼠存活时间、血清细胞因子检测、肝脏组织学和免疫组化检测、以及肝脏功能的改变,
探讨 rAAV- hIL-10 诱导免疫耐受的有效性和安全性。通过嵌合细胞的检测初步探讨 rAAV-hIL-10 诱
导免疫耐受的可能机制。
B、研究目标
构建携带 hIL-10 基因的重组腺相关病毒载体,并获得高滴度产毒细胞系,移植前不同时间不同
方法成功转染供体肝脏后,以期获得有效的细胞因子表达,确定基因转染的最佳时间及方法,同时
探索其诱导免疫耐受的有效性和安全性。
C、拟解决的关键问题:
(1) hIL-10 基因腺相关病毒载体的构建
(2) 高滴度产毒细胞系建立及滴度测定
(3) 最佳的基因转染时间
(4) 有效的供肝转染技术
3、采取的研究
方案
气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载
及可行性分析。
A、研究方法:
1、分子生物学技术:基因克隆、基因转染、细胞培养、RT-PCR
2、显微外科技术:动物模型建立
3、形态学研究方法:光镜与电镜、免疫组化
4、生化分析:肝功能测定、ELISA 检测
B、技术路线和实验方案
1、大鼠原位肝移植模型的建立
采用改进的缝合法,将静脉套管口改为略成角度的楔形,套管口径根据相应血管外径而定,
采用腹主动脉灌洗,8-0 丝线只缝合肝上下腔静脉的静脉壁,单人操作,建立 Wistar-SD 大鼠的稳定
原位肝移植模型。
2、人 IL-10 克隆与鉴定
采用人外周血单核细胞提取总 RNA,依 Gene Bank 检索人 IL-10 序列设计合成引物,克隆人
IL-10 基因片断并测序鉴定。
3、构建 pSNAV-hIL-10 重组质粒
IL-10 基因片断经双酶切后定向插入 pSNAV ,制备感受态细菌,连接产物转化后,碱裂解法
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小量提取重组质粒,经酶切和测序鉴定正确后,纯化并回收质粒。
4、 rAAV- hIL-10 病毒扩增与滴度测定
将获得具有完整表达盒的 rAAV 载体质粒转染 BHK-21 细胞,经 G418 选择培养后得到了
rAAV-hIL-10 的载体细胞株, BHK-21 细胞的倍增时间短,细胞易于培养,我们用表达 AAV2 Rep 和
Cap 的重组 HSV-1 感染携带 AAV 载体成分的细胞株,可实现 rAAV 的大规模生产。采用这样的生产
系统,每个细胞可产生 400~1000 TU 的 rAAV 。利用 AAV 能抵抗氯仿的特性,采用“氯仿处理―
PEG/NaCl 沉淀―氯仿抽提”的三步浓缩、纯化方法,获得高滴度的产毒细胞系。
5、采用夹闭法和循环法分别在不同时间 rAAV- hIL-10 转染供肝
分别于移植术前2周,1周,3天,1天,供体获取时灌洗转染供肝:组 1 UW液(空白
组)组 2 rAAV-LacZ 组(对照组)组 3 rAAV- hIL-10 组(耐受组)
6、 rAAV- hIL-10 的致耐受性与安全性
a、排斥反应程度:病理学评分法
b、大鼠免疫指标的观察:i. 大鼠存活期:观测大鼠营养及体重变化 ii. hIL-10 蛋白表达水平
检测:ELISA,Western-blot iii. 血清细胞因子检测:IL-2 、IFN-r、IL-10、TGF-β、Granzyme B 等 肝
脏组织学及免疫组化检测:CD4、CD8、CD80、CD86 等 v. hIL-10 基因表达水平检测:RT-PCR 法
c、移植肝脏功能改变:AST ALT LDH
7、嵌合性检测
a、免疫组化和流式细胞仪检测供、受体源性细胞
C、可行性分析:
1、本课题组在大鼠原位肝移植模型方面作了大量工作,可采用改进的三套袖法及缝合法成功构建大
鼠原位肝移植模型。
2、课题负责人博士期间成功克隆 hIL-10 基因片断并构建逆转录病毒载体(MSCV-hIL-10),hIL-10 生
化本质及基因表达研究十分清楚,重组腺相关病毒的生物学特性已被深入了解,其转染的长期稳定
性与安全性为本研究提供了理论基础,。
3、本实验室拥有良好的技术设备和优良的实验环境。
4、本课题负责人参与国家自然科学基金《钙调磷酸酶对环孢素 A 肾毒性的影响》(30170897) 和留学
归国人员基金《hIL-10 基因转染延长大鼠原位肝移植后存活的研究》(LC02C16),具有良好的实验基
础。
4、本项目的特色与创新之处。
(1)采用移植前 rAAV-hIL-10 基因靶向性转染肝脏,可望获得高效的细胞因子表达作用
(2)首次采用夹闭灌洗转染技术观察移植实验
(3)通过 rAAV-hIL-10 基因移植前供肝转染技术的量化研究,确定最佳的基因转染时间和方法,是
器官移植基因治疗的效果由质到量的转变
(4)基因治疗诱导免疫耐受为特异性免疫耐受诱导开辟新领域
5、年度研究
计划
项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载
及预期研究结果。
①年度研究计划及预测进展
2006 年 5 月-2006 年 11 月
1、人 IL-10 的基因克隆与鉴定
2、构建 hIL-10 cDNA 质粒载体(pSNAV-hIL-10)
2006 年 12 月-2007 年 5 月
1、 hIL-10 腺相关病毒病毒载体的构建(rAAV- hIL-10)
2、 hIL-10 腺相关病毒载体高滴度产毒细胞系建立
3、病毒滴度的测定
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A、 研究主要内容