下载

0下载券

加入VIP
  • 专属下载券
  • 上传内容扩展
  • 资料优先审核
  • 免费资料无限下载

上传资料

关闭

关闭

关闭

封号提示

内容

首页 中医论文开题报告

中医论文开题报告.doc

中医论文开题报告

赵琼凌
2019-01-22 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《中医论文开题报告doc》,可适用于医药卫生领域

湖北中医药大学级硕士生开题报告百合知母汤抗抑郁细胞内信号转导通路的机制研究研究生姓名:***导师姓名、职称:****教授学 科 专 业:基础医学院          研 究 方 向:方剂的配伍规律及临床运用  年月目录一、研究目的与意义·········································、研究目的··············································、研究意义··············································二、研究现状·············································、百合病的研究现状········································、抑郁症的研究现状········································、百合知母汤的研究现状·····································三、研究思路与立题依据·····································、研究思路··············································、立题依据··············································四、研究内容及目标··········································五、拟解决的关键问题········································六、研究方案·············································、实验动物··············································、药物制备··············································、CUMS抑郁症模型大鼠制备····································、行为学指标的测量········································、尼氏染色··············································、生化指标的检测··········································七、技术路线图·············································八、可行性分析·············································九、课题创新性·············································十、预期结果·············································十一、课题经费预算·········································参考文献·················································一研究目的与意义研究目的百合病最早见于张仲景的《金匮要略》属中医情志病范畴。《金匮﹒百合狐惑阴属阳毒病证治》篇将“百合病”描述为:“意欲食复不能食常默然欲卧不能卧欲行不行饮食或有美时或有不用闻食臭时如寒无寒如热无热口苦小便赤诸药不能治得药则剧吐利如有神灵者身形如和其脉微数。”从百合病的临床表现看与抑郁症的诊断标准有较多的相似之处。所以现代不少医家都将中医的百合病归属于抑郁症,,。百合知母汤为治疗百合病的经典方药之一由百合和知母两味药组成。百合宁心安神润肺止咳知母清热泻火滋阴润燥。百合甘寒清润而不腻知母苦寒降火而不燥。百合偏于补知母偏于泻。二药伍用一润一清一补一泻共奏润肺清热宁心安神之效。主治阴虚或温热病后余热末清以致头昏、心烦不安、失眠等症以及情志不遂以致精神恍惚、不能自制等症。故本课题旨在通过体动物实验揭示百合知母汤抗抑郁可能的细胞内信号转导机制。研究意义抑郁症是常见的危害人类身心健康一类精神疾病以显著而持久的情感或心境低落为主要特征在WHO的一项流行病学调査中发现全世界约有的人一生中曾有过抑郁体验。随着现代社会的生活压力逐渐增高、工作节奏加快人们处于应激状态中的机会增多抑郁症的发病率更逐年上升,越来越多的患者正遭受抑郁症的折磨给家庭及社会造成了严重的经济负担。因此加强抑郁症的防治寻找安全、有效的治疗方法具有非常重要的社会和经济意义。   抑郁症发病机制复杂诱因繁多针对某一单一环节的药物难以取得满意的疗效许多抗抑郁西药存在抗抑郁谱窄、起效慢、药价高、依从性差、副作用大及易复发等不足。传统的中医学中蕴含着丰富的心身医学思想其“形神合一论”“天人合一论”就包含了广义的心身医学思想。因此国内外越来越重视传统中草药及复方抗抑郁的研究开展了广泛而深入的实验研究积累了丰富的经验且实验研究成果在临床运用中也取得了良好的疗效为中医学和现代心身医学的融合、发展提供了新的契机。中医心身医学研究工作逐渐起步心身医学的中医药防治研究工作在病因病机及临床诊断方面也取得一定的进展。随着分子生物学的发展抗抑郁药物抗抑郁作用机制已由细胞外单胺递质途径逐步转向细胞内信号转导机制而目前针对百合知母汤抗抑郁作用机制的研究大都局限在行为学观测、脑内神经递质和神经内分泌等方面。本研究采用大鼠慢性应激结合孤养抑郁模型对百合知母汤的抗抑郁作用及其细胞内作用机制进行研究以期为其进一步的新药开发研究和临床应用提供实验基础。二研究现状百合病的研究现状百合病的起源百合病始见于张仲景《金匮要略·百合狐惑阴阳毒病证治第三》篇:百合病者百脉一宗悉致其病也。意欲食复不能食常默然欲卧不能卧欲行不能行饮食或有美时或有不用闻食臭时如寒无寒如热无热口苦小便赤诸药不能治得药则剧吐利如有神灵者身形如和其脉微数。这段文字概括了百合病的主要症状是精神、饮食、睡眠、行为、语言、感觉的失调与西医学抑郁症的主要症状有颇多相似之处。“百脉一宗者分之则为百脉合之则为一宗”因人体百脉同出一源源病则百脉合病周身受累因此而得名百合病。百合病的病因病机百合病的病因病机为伤寒热病之后余热伤阴或情志不遂郁热伤阴导致心肺阴虚内热百脉失养而成。病机特点是心肺阴虚内热心神失养以神志改变为主要临床特点。心肺阴虚余邪未尽则出现口苦、小便赤、脉微数。该组症状是百合病的主要客观体征。百脉遍布周身百脉失和则行动感觉变异如“欲卧不能卧欲行不能行”“意欲食复不能食饮食或有美时或有不用闻食嗅时”“如寒无寒如热无热”等。神志失和则现“如有神灵者”“常默默”。百合病的治疗法则百合病以心肺阴虚为基本病机以滋养心肺、润燥安神为治疗法则。可“随证治之”分为以下几型:①正治法:“百合病不经吐、下、发汗病形如初者百合地黄汤主之。”百合病未经误治日虽久而病形如初者以滋养心肺阴血清热安神为法以百合地黄汤主之。取百合润养心肺清气分虚热生地滋养心血清血分虚热泉水煎药取清热助阴血热从小便下行之功。诸药合用心肺得养气血同治阴复热清百脉和调病症自除。②误汗后:“百合病发汗后者百合知母汤主之。”百合病误用汗法汗后阴液受伤心肺阴虚加重燥热尤甚除具备百合病的基本症状外尚可出现津伤燥热的心烦、少寐、口干或渴、午后潮热、小便短少等症候。治宜养阴清热、润澡除烦用百合知母汤主治。③误下后的滑石代赭汤(百合、滑石、代赭石)。④误吐后的百合鸡子汤(百合、鸡子黄)。⑤久病变渴的外用百合洗方(百合)。如内服外洗仍口渴不解方用栝蒌牡蛎散(栝蒌根、牡蛎)。⑥久病变发热的百合滑石散(百合、滑石)。抑郁症的研究现状抑郁症的起源抑郁症是一种情感性精神障碍临床上以情绪低落、思维迟缓和精神运动性抑制为特征其它症状包括丧失自尊、不恰当的内疚感、死亡和自杀念头、注意力集中程度降低以及睡眠和食欲减退还可能伴有各种躯体症状。抑郁症是一种最普通的精神疾病。我国对情感性精神障碍进行流行病学调查年:终生患病率约为。我国对抑郁症的识别率低,临床漏诊率达。一般内科医生对包括抑郁症在内的心理障碍的识别率只有,约只有的抑郁症病人才能接受正规治疗。有专家认为我国抑郁症的发病率应为随着人口的逐步老龄化抑郁症在岁以上人群中的发病率将高达~。年WHO全球调查发现,抑郁症的现症患病率现症患病率为,终生患病率为。约的人一生中曾有过至少一次抑郁体验。《年世界卫生报告》指出抑郁症目前已成为世界第四大疾患到年抑郁症可能成为仅次于心脏病的第二大疾病抑郁症正在成为一个严重的全球问题。抑郁症的发病抑郁症的病因十分复杂一般认为病因可能与遗传、人格特征、心因因素有关。其发病机制也处于假说阶段主要包括单胺递质学说、神经内分泌学说、信号通路学说。单胺假说作为抑郁症研究的重点认为单胺类神经递质(如轻色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等)的失衡可导致抑郁的发生。大量研究亦显示抑郁症与遗传、神经、心理等因素诱发的中枢羟色胺(HT)、去甲肾上腺(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)等单胺类神经递质含量降低及其受体功能下降有关。有研究表明抑郁模型大鼠下丘脑、纹状体、海马内HT、NE及DA及其代谢产物、合成前体的含量明显降低。这也支持了经典的单胺递质学说。①HT:抑郁症的发病机制涉及突触间隙HT水平及HT受体亚型功能的失调。HT功能活动降低,则患者心情抑郁、食欲减退、运动活动减少。Coppent等于年首先提出HT与抑郁症有关,认为抑郁症是由中枢神经系统HT释放减少,突触间隙的含量下降而引起的。近年来,研究发现了很多经色胺的受体亚型,使得HT递质系统与抑都症发病的关系越来越受到关注。②NE:大量研究证明脑内NE的绝对或相对缺乏会引起情绪低落、心境抑郁。Schildkraut于年首先提出抑郁症的发生是由于脑中NE不足所致,中枢神经系统中NE含量不足则发生抑郁症NE的缺乏可能是由于内源性的生成释放异常或由于NE系统慢性刺激所致的继发性粍竭。Bmnello等指出,自从发现一些药物通过改变NE代谢既能导致抑郁症又能缓解抑郁症,NE在抑郁症中所起的作用越来越受到关注。③DA:年Randrup首先提出,抑郁症的发病可能与DA有关。后来Maj等研究者证实,几乎所有长期抗抑郁治疗的患者都会增加DA诱导的奖赏反应。年Willner等提出抑郁症存在DA功能的降低,尤其是伴随有精神运动迟滞的患者。对抑郁症自杀者尸检结果提示,抑郁症自杀患者尾状核和伏核的DA代谢率降低。目前,抑郁症的神经内分泌机制研究中,下丘脑一垂体一肾上腺轴(HPA轴)功能亢进是较为公认的发病机制之一。大量研究显示,抑郁症患者的HPA轴功能亢进,血浆促肾上腺皮质激素释放激素CHR、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(CORT)浓度明显升高,而且这种功能亢进是依赖性的,随着抑郁的恢复,HPA轴的功能也逐步恢复正常。Catalan等发现抑郁症患者下丘脑及下丘脑外的促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)浓度都升高,重度抑郁组比轻度与中度抑郁发作CRF血浓度更高,且CRF与皮质醇血浓度显著相关。在发病机制方面受体后信号通路及其第二信使系统在该病发病及治疗中的作用是当前研究的热点。以脑内cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)为交汇点的细胞内信号转导通路正受到越来越多的关注尤其是海马CREB的改变。早在年Nibuya等就报道抗抑郁治疗大鼠海马CA区、CA区和齿状回均可见CREBmRNA的表达增多。CREB可能是各种抗抑郁信号转导通路的交汇点。海马CREB的表达和活化受到多种信号分子和信号通路的影响:①腺苷酸环化酶环磷酸腺苷蛋白激酶A通路(ACcAMPPKA通路)是研究最早的抗抑郁通路。其主要过程是:胞外信号激活胞膜上G蛋白耦联受体→AC激活→胞内cAMP升高(降解cAMP的酶主要是磷酸二酯酶)→PKA激活→CREB磷酸化→调节基因转录→生物学效应。Li和Branski,等实验研究发现海马cAMP通路的激活对改善抑郁症状起积极作用。②酪氨酸激酶受体B丝裂原活化蛋白激酶核糖体S激酶通路(TrKBMAPKRSK通路)是一条和细胞生长、增殖、凋亡以及突触可塑性密切相关的信号通路。在各种MAPK通路中细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路与抑郁症关系最为密切。ERK通路激活的大致过程是:TrKB的激活→MAPK激酶激酶(MAPKKK,RAF)的激活→MAPK激酶(MAPKK,MEK)的激活→ERK的激活→RSK的激活→CREB磷酸化→调节基因转录→生物学效应。抑郁症患者的尸检报告显示脑内MAPK减少可能是严重抑郁症的病因之一。③Ca钙调蛋白钙调蛋白依赖的蛋白激酶通路(CaCaMCaMK通路)通路涉及多种离子通道、受体和酶其激活的主要过程是:胞浆内钙浓度升高→钙离子与CaM结合→激活CaMK→CREB磷酸化→调节基因转录→生物效应。王庆松等利用猫对大鼠造成急性捕食应激发现在捕食应激后大鼠海马细胞内CaM信号通路调控紊乱表现在细胞内Ca浓度明显升高CaCaM复合体增多CaMK的表达升高提示海马该信号转导通路在严重心理应激所致的行为异常中可能有重要意义。百合知母汤的研究现状百合的研究现状方中百合为百合科植物百合LiliumbrowniiFEBrownvarcolchesteriWils、卷丹LiliumlancifoliumThunb和细叶百合LiliumpumilumDC的肉质鳞茎。味甘性微寒。入心、肺经。本品气味稍缓甘中有收既能清心肺之余热而敛气养心、安神定魄用于治疗热性病后、余热末尽所引起的神思恍惚、烦躁失眠、莫名所苦的“百合病”又能润肺止咳用于治疗肺燥咳嗽或肺虚久咳或阴虚久咳、痰中带血等症。百合中主要含有酚酸甘油酯、苷类、生物碱及多糖另外还含有一些磷脂、蛋白质和无机元素。药理研究表明百合具有抗癌、止咳、耐缺氧与抗疲劳、提高机体细胞免疫功能等作用。知母的研究现状方中知母为百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge的根茎。味苦、甘性寒。入肺、胃、肾经。本品质润苦寒不燥、沉中有浮降中有升。上行能清肃肺气以泻肺火润肺燥、除烦热、止咳嗽用于治疗温热病邪在气分症见高热、烦躁、口渴、脉洪大者以及阴虚燥咳或肺热咳嗽诸症入于中善清胃火、除烦渴用于治疗消渴病之中消诸症行于下则能泻相火、滋肾燥用于治疗阴虚火旺、骨蒸潮热、盗汗等症。 知母主要含有皂苷、黄酮、双苯吡酮、木脂素等成分。现代研究表明知母具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、解热、抗炎、降低转氨酶等多种药理活性。百合知母汤的研究现状   百合知母汤有养阴清热、除烦润燥之效以润养心肺为大法治疗百合病误汗后津液受伤虚热较甚者。临床上运用百合知母汤治疗乳腺增生病、长期低热、消渴、喘证、盗汗、胃脘痛、失眠、抑郁等症。三研究思路与立题依据研究思路百合知母汤是《金匮要略》中治疗百合病的经典方剂。百合病的描述“百合病者百脉一宗悉致其病也欲卧不能卧欲行不能行……意欲食复不能食常默默如有神灵者……”主要归纳为情绪障碍、躯体不适与现代医学抑郁症的诊断标准有很大的相似性因此一般将百合病归属于抑郁症范畴。百合知母汤中的部分有效成分能通过提高抑郁症大鼠大脑皮层单胺递质、抑制HPA轴亢进、提高模型动物脑组织BDNF含量等途径发挥抗抑郁效应。CREB可能是各种抗抑郁信号转导通路的交汇点。抗抑郁药物(包括中药)或其它治疗措施可通过调节一种或几种通路最终激活CREB调节BDNF等基因表达影响神经元增殖、分化、成熟等可塑性改变发挥抗抑郁作用。参与调节CREB的各调节因子之间、通路之间存在复杂的交叉联系和相互作用共同维持着CREB活性的平衡。近年来研究提示:抑郁模型小鼠存在神经元蛋白和营养因子在海马的表达异常而这些变化可以被一些中药逆转。当前致力于阐明信号通路、CREB、营养因子、神经再生之间是如何相互联系的以及细胞靶点、分子应答、行为反应的调节与抗抑郁之间错综复杂的关系。这将有助于我们以CREB为中心了解抑郁症的病理生理机制并在此基础上研发出疗效可靠、起效迅速、副作用小、经济实用的新药尤其是帮助我们更好地认识一些中药抗抑郁的可能机制更充分地利用祖国宝贵的中医药资源。细胞内信号转导通路是目前抗抑郁机制研究的重点和热点。可被多种不同的信号路径激活。环磷酸腺苷(cAMP)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、钙调蛋白激酶(CaMK)等条通路是目前认为与抗抑郁相关、最主要的信号通路这个主要上游通路最终都使CREB磷酸化进而调节其下游通路的基因表达完成神经元生化功能而CREB是上述种通路的交汇点。前期的研究证实:百合知母汤抗抑郁的机制与提高慢性不可预见性应激结合孤养抑郁(CUMS)模型大鼠海马组织HT含量、提高脑组织中CREB(cAMP反应元件结合蛋白)mRNA的表达有关(见)。有鉴于此我们提出假设:百合知母汤抗抑郁的信号机制可能与以上三种细胞内通路有关三个通路在抗抑郁机制中可能会有所偏重。围绕假设基于CREB磷酸化通路本课题拟将百合知母汤作用于CUMS大鼠运用ELISA、RTPCR、免疫组化、Western印记等方法检测大脑组织cAMP信号中cAMP和PKA、MAPK信号中TrKB和BDNF、CaMK信号中钙调蛋白(CaM)和CaMK等关键因子初步探讨百合知母汤抗抑郁的信号机制,筛选出该方抗抑郁的基因靶点。 立题依据中药复方具有成分多、作用环节多、靶点多的特点多环节之间具有协同效应。因此研究中药及其方剂的抗抑郁作用具有极大的挖掘潜力而且对解决日益增加的抑郁患者的痛苦有重大的社会意义。四研究内容及目标建立慢性不可预见性应激结合孤养大鼠抑郁(CUMS)模型通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)含量变化评价百合知母汤对抑郁症cAMP信号的干预作用通过检测用药前后模型动物大鼠络氨酸激酶受体B(TrKB)和脑源性神经营养因子(BDNF)含量变化评价百合知母汤对抑郁症MAPK信号的干预作用通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织中钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白激酶(CaMK)含量变化评价百合知母汤对抑郁症CaMK信号的干预作用五拟解决的关键问题通过检测cAMP、MAPK、CaMK三条信号转导路径上重要调节因子cAMP、PKA、TrKB、BDNF、CaM、CaMK用药前后的变化初步评估百合知母汤对以上三个信号转导路径的干预作用评价方剂抗抑郁的机制以便进一步筛选出方剂抗抑郁靶点。六实验研究方案实验动物SD雄性大鼠周龄体重g药物制备按照《金匮要略》中记载的方法:百合七枚(劈)(约g)知母三两(切)(约g)即百合:知母=:。取百合g知母g先以清水将百合浸泡小时当白沫出去其水再加清水ml武火煎开后改为文火得百合煎煮液ml再用清水ml先武火后文火得知母煎煮液ml将次煎煮液混合文火浓缩得煎煮液ml。按照比例配制足够数量百合知母汤煎煮液放入冰箱℃储存备用。临用时取出浓缩至合适体积。为确保实验结果的可比性所有实验都用同一批药材。所有药物的给药剂量根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算而来:大鼠(g)用药量=人(kg)日用剂量*。每只大鼠的给药体积为mlg。百合知母汤终浓度为gKgd(成人日用量g)氟西汀终浓度为mgkgd(成人日用量mg)各组按浓度给药天对照组给等体积的三蒸水。CUMS抑郁症模型大鼠制备除正常对照组外其余动物采用慢性轻度不可预见性温和刺激结合孤养(CUMS)的造模方法:各造模组大鼠均单笼饲养刺激因子包括禁食、禁水、℃冰水游泳、夹尾、晃尾、潮湿垫料和倾斜°、束缚应激、陌生物品、空笼刺激、噪音刺激、闪光刺激、水平震荡、昼夜颠倒等。每日随机给予到种刺激使大鼠不能预料刺激的发生以避免产生适应。每种刺激交叉累计使用次持续天造模成功后给药期间继续维持造模。建立慢性温和不可预见性应激结合孤养(CUMS)抑郁症大鼠模型,具体操作方法如下:()禁水:即小时不予供水。具体方法为,造模当天,上午:始,撤出大鼠笼内供水瓶,禁水小时后,于次日上午:正常供水。()禁食:即小时禁止进食。具体方法为,造模当天上午:始,清除鼠笼内所有鼠粮,剥夺进食小时后,禁食期间供水正常。禁食后给少量碎食,然后正常词养()昼夜颠倒:造模当天,上午:,将正常对照组大鼠转移至其它SPF级实验室后,关闭本实验室所有电源,模仿黑夜,至:准时打开实验室电源,模仿白昼,给大鼠制造昼夜颠倒的假象。()夹尾:用缠裹有胶布的塑料夹,夹持鼠尾根部,时长为min。()晃尾:提住大鼠尾巴中部以每秒钟次的频率,晃尾分钟,晃尾时力度要轻柔,避免牵拉大鼠尾尖部位,以防脱皮()冰水游泳:取一直径为cm玻璃缸,注入适量清水后加入适量冰块,调整水温至℃(根据天气情况,适当调整,以防冻伤),同时调整水液平面据器皿边缘约cm,然后将大鼠放入冰水中,强迫其游泳min。min后将大鼠榜出,先用干毛巾擦拭动物毛发,然后用吹风机吹干,避免感冒。每次冰水游泳结束后需捞干净游泳器皿内大鼠类便,避免对下一只鼠产生影响。()高速水平震荡:将动物放入空的鼠笼中进行人工振荡次秒有效节奏连续持续min或者水平晃动次秒持续分钟()噪音刺激:分贝噪音刺激h尽量选在白天大鼠休息的时候给予此种刺激。()束缚刺激:将大鼠束缚于ml烧杯中h注意保持通气。()潮湿环境:将大鼠的垫料换以潮湿垫料持续刺激h。()异物刺激:往大鼠笼内放置金属条棒钝性玻璃器皿的异物予以刺激持续h。()空  笼:撤掉大鼠笼里面的垫料笼子里不放置任何物品持续h。()倾斜刺激,:该刺激因素通常在禁水后进行,应激动物本身饥渴,在倾斜的鼠笼中觅食觅水更为困难。()闪光刺激:LED频闪灯频闪频率次s持续刺激h。以上各种刺激的实施顺序遵循由弱(轻刺激,如昼夜颠倒、禁水禁食、潮湿环境)到强(重刺激,如冰水游泳,夹尾晃尾束缚刺激噪音闪光等刺激)的原则,以避免刺激之间的交互作用。每日采用种刺激,平均每种刺激被采用次,同种刺激不能连续出现,使动物不能预料刺激的发生。行为学指标的测量主要包括蔗糖水消耗率、体重变化率、敞箱实验、Morris水迷宫实验以及悬尾试验。体重变化率分别在实验的第d、d、d、、d、d、d、、d进行。动物体重变化率()=(当日测量的体重第天的体重)第天的体重。糖水消耗实验实验前期准备在安静的环境内训练动物适应含糖饮水:第一个h每笼同时放置两个完全相同的动物水瓶两瓶均为同等重量的蔗糖水第二个h一瓶为鹿糖水,一瓶为相同重量的纯净水。然后进入实验阶段禁水禁食h后,测定pmam小时内大鼠蔗糖水摄入量。糖水偏爱率=糖水消耗量(糖水消耗量清水消耗量)X。适养期间进行三次糖水偏爱筛选,将糖水偏爱率异常的大鼠剔除,不用于正式实验(三次糖水偏爱测试中均只喝自来水的大鼠为异常大鼠)。测定动物在实验第天、第天、第天、第天糖水偏爱率的变化。敞箱实验敞箱实验(OpenfieldTest)是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在陌生环境中某些行为的发生频率和持续时间来反应实验动物的自主行为与探究行为,以尿便次数反应其紧张度。敞箱实验(OpenfieldTest):木质敞箱,立方形,长、宽、高为cmxcmxcm,内侧壁、底面为黑色,底面用白线划分为面积相等的块正方形。室内安静环境下将大鼠放置于敞箱底面的中心方格内,人距离敞箱米之外,记录大鼠在min内活动频率。以穿越底面正方形块数为水平穿越格数(爪均进入方格才记数,为水平运动得分)、以两后肢直立的次数为竖立活动次数(两前爪腾空或攀附墙壁,为垂直运动得分),理毛次数以及大小便次数。每只动物只测次,测定完毕后彻底清洁敞箱再进行下一只观察。分别于实验前天、实验第天和最后天进行。Morris水迷宫实验该实验是对大鼠学习记忆能力的检测主要包括定位航行实验和空间搜索实验。实验用主要装置包括一个银灰色圆形水池(直径cm)一个白色平台(直径cm)一台跟踪摄像机以及与摄像机相连的计算机池内盛水且水温保持在℃。最后一次敞箱实验结束后第二天开始首先训练大鼠寻找平台平台置于水面下cm摄像机位于水池上方约cm能清晰摄取到大鼠的运动轨迹。将水池分为四个象限将大鼠从任意一个象限放入水中记录其找到平台的路径及时间前几次训练中若时间超过s则引导动物到平台并在平台上停留s。然后进行定位航行与空间搜索实验。定位航行实验:训练结束后的第一天保持平台位置不动将大鼠随机从一个象限放入水中开始记录大鼠的运动轨迹及找到平台的时间空间搜索实验:定位航行实验结束后将平台撤走将动物从原平台位置的对侧放入开始记录s内大鼠的运动轨迹及潜伏期与穿越平台次数。以此做为对空间记忆能力的检测指标。悬尾实验将实验动物通过固定动物尾端cm处使其头向下悬挂动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱从而提供了一个无可回避的压迫环境一段时间的实验后记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态的时间。动物表现出的这种典型的“不动状态”反映了一种被称之为“行为绝望状态”这种行为绝望模型与抑郁症类似而且对绝大多数抗抑郁药物敏感而且其药效与临床药效显著相关。尼氏染色正常的神经细胞都含有一定数量的尼氏小体它们主要分布于神经细胞的浆中形状有大有小如三角形有的为椭圆形。这些物质能被大部分的蓝色染料所染色这些染料如焦油坚牢紫(Cresyl fast violet)、亚甲蓝(methylene blue)、甲苯胺蓝(toluidine blue)、硫董(thionin)等将其染为蓝色。但是当神经细胞受伤后胞质内的尼氏体更可发生变化严重的可消失通过观察尼氏小体的数量可以探知神经元的受损或修复情况。各组大鼠分别于末次给药后麻醉,使大鼠仰卧位固定于实验台上,打开腹腔,掀起右肺,在靠近脊柱处找出下腔静脉和腹主动脉。用止血钳夹住腹主动脉和下腔静脉,接着打开胸腔,用针头经左心室插入升主动脉,后剪开右心耳,进行灌注。先用的生理盐水ml经心脏快速灌注冲洗,再用的低聚甲醛,OlmolL的磷酸缓冲液(PH)ml灌注。在灌注固定液过程中后期大鼠颈部、肩部和双前肢逐渐变硬。灌注后取大鼠全脑,低聚甲醛固定h。以松果体为标志物,向头侧横向切取段,每段厚mm。石蜡包埋,连续切片,片厚lOpin,切片,用于尼氏染色及后期的免疫组化。将脑片置于甲苯胺蓝(母液:甲苯胺蓝g无水乙醇ml。使用时按:比例与新鲜的NaCl溶液混合成工作液)或焦油紫(焦油紫g蒸馏水ml冰醋酸ml)中室温下染色min。在、、酒精中各脱色min二甲苯透明min中性树胶封片。显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进行计数。测量生化指标主要包括CREB、BDNFmRNA在大鼠海马内的表达免疫组化检测TrKB、ERK蛋白的表达免疫印迹法检查CaM、CaMKⅡ的表达。逆转录聚合酶链式反应法检测CREB、BDNFmRNA在大鼠海马内的表达首先匀浆:海马新鲜组织约mg,加入ml的TRIZOL试剂,用电动勾浆器进行勾浆两相分离:分装后样品于到℃孵育分钟。每ml的TRIZOL试剂勾浆的样品中加入ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体秒后,℃孵育到分钟。℃下g离心分钟。离心后混合液体将分为下层的红色紛氯仿相,中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中,水相的体积大约是勾浆时加入的TRIZO试剂的RNA沉淀:将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入mlTRIZOL试剂加ml的异丙醇混勾后℃孵育分钟后,于℃,g离心分钟RNA清洗:移去上清液,每mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少ml的乙醇,清洗RNA沉淀。振荡后,℃g离心分钟重新溶解RNA況淀:去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀分钟,切勿真空离心干燥注意RNA沉淀不要完全干燥,否则将大大降低RNA的可溶性部分溶解的RNA样品A比值将小于溶解RNA时,先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次,然后℃孵育分钟。莰得的RNA溶液保存于℃浓度测定:取少量液体用TE稀释(一般:稀释)后,读取其在紫外分光光度计nm和nm处的吸收值,A下读值为表示ugRNAml样品RNA浓度(ugml)=A×稀释倍数ugmlRNA纯度检测:RNA溶液的AA的比值范围应在之间在无核酸酶的离心管中配制反应液:RNAμg逆转录引物(um)μlRNasefreeHO使总体系为μl(反应液配制在冰上进行)。轻轻混匀,℃变性min立即置于冰上min后加入:RNAprimermixμl×RTReactionBufferμldNTP(mM)μlRiboLockRNaseInhibitorμlRevertAidReverseTranscriptaseμl。总体系μl℃孵育min后℃孵育min℃加热灭活min℃保存。设计相应的引物配制成合适浓度工作液RealtimePCR仪反应体系液配制:XallinOneTMqPCRMix(含ROX)μl引物(pmolμl)上下游各μlddHOμlcDNA(适度稀释)μl。总体系μl。反应条件:℃min,以下反复个循环℃,s℃s℃s。最后结果采用ΔΔCT法进行测量。免疫组化法检测TrKB、ERK的表达切片后,常规脱蜡至水过氧化氢孵育lOmin,可以灭活内源性酶的活性,蒸水冲洗,minx次微波热修复min,PBS冲洗,minx次滴加BSA封闭液,室温孵育min滴加一抗,HTiaR一抗稀释为:,PKA稀释为:,CREB稀释为:,°C过夜,PBS冲洗,minx次滴加二抗生物素标记的羊抗兔IgG,°C孵育min,PBS冲洗,minx次滴加三抗试剂SABC,°C孵育min,PBS冲洗,minx次DAB显色剂显色,室温下inin,蒸馈水冲洗,脱水,透明,封片最后DAB显色剂显色室温下min蒸馏水终止反应常规脱水、透明、封片显微镜下观察。每只动物取相同部位的张切片每张切片选取个视野在同一放大倍数、同一光强度下采用CMLAS彩色病理图像分析系统分别计算每张切片中海马组织TrKB、ERK表达的平均光密度。免疫印迹法测定钙调素(CaM)、钙调蛋白激酶(CaMKⅡ)蛋白表达变化取新鲜海马约mg置mlEP管中生理盐水冲洗两遍充分剪碎离心去上清。每管加4℃裂解液ml继续剪碎、混匀低温超声匀浆转离心min取上清备用。取上清μl加考马斯亮蓝μl去离子水μlnm处cm光径蒸馏水调零测各管OD值根据样品OD值调整蛋白浓度。样品煮沸min冷却后取μg上样电件(%浓缩胶:vmin%分离胶:vmin)NC膜转印(vmin)%脱脂奶粉TBST溶液封闭抗体摇床hTBS漂洗min次。一抗孵育(兔抗人CaM、CaMKⅡ多克隆抗体:稀释)℃过夜二抗孵育(辣根酶标记羊抗兔IgG:稀释)℃h扫描并分析结果条件设置为曝光minCCD自动获取图像同时以:稀释的小鼠抗大鼠betaactin单克隆抗体作为内参照各蛋白相对表达量以相应蛋白/betaactin灰度值表示。七技术路线图八可行性分析前期研究基础:本项目的前期工作已经成功复制了CUMS抑郁症动物模型证实了百合知母汤能增加抑郁症动物分钟穿格数、分钟直立次数、修饰次数、大便粒数等行为学指标能提高脑组织CREBmRNA的表达水平。为本课题的研究打下了坚实的基础。人员配备及实验设施基础:本课题思路清晰、目标明确。拟在湖北中医药大学湖北中医药大学“中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室”“国家中医药管理局中药药理三级实验室”实施实验室仪器设备和人员配备完善具备药理学、药物化学和分子生物学研究的相关设备与精密仪器能满足本申请项目使用需要。本课题所需的实验条件动物实验室均具备。本课题所涉及的主要技术和方法已初步掌握。实验所需试剂均可在国内够得。九课题创新性本课题首次系统地由宏观到微观地进行综合研究能从行为学水平→细胞形态水平→分子水平三个层次经行分析以期待比较完善地探索百合知母汤抗抑郁功效及其机理。本课题选用了先进的指标并且采用蛋白水平和mRNA水平检测方法检测神经营养因子及相关细胞内信号转导通路中关键因子的变化以期探寻本方提高抑郁症大鼠脑组织CREBmRNA的表达水平的进一步信号转导机制。十预期结果成功完成大鼠抑郁症CUMS模型的建立构建良好的实验平台。探讨百合知母汤抗抑郁机制中三种信号转导系统发挥的作用筛选百合知母汤抗抑郁的靶点通路。预计在国内学术期刊上发表论文篇。科目总预算经费计算依据与说明一.研究经费   科研业务费  ()测试计算分析费酶联免疫吸附、分子生物学等指标的检测 ()能源动力费水电动力费用 ()会议费差旅费  ()出版物文献信息传播费论文发表版面费 ()其它(请注明)资料及查新 实验材料费  ()原材料试剂药品购置费实验动物检测试剂盒耗材二劳务费研究生劳务费及误餐费用三管理费按照规定提取合计     十一课题经费预算单位:万元               参考文献吴炫静抑郁症的中医辨证治疗研究D北京:中国中医科学院:孙旭海中医精神疾病分类与症状的古代医学文献整理研究D北京:中国中医科学院:吴崇胜抑郁症中医症候诊断标准研究D北京:北京中医药大学:NemeroffCBTheneurobiologyofdepressionJScientificAmerican:周学东陈兴宝抑郁症经济负担研究进展J上海医药():周庚生胡纪明中西医临床精神病学中国中医药出版社:汤久慧中医药抗抑郁实验研究现状J河南中医():张丽萍颜红侯冬芬心身医学中医研究进展J天津中医药大学学报():AndradeL,CaraveoduagaJJ,BerglundP,etalTheepidemiologyofmajordepressiveepisodes:resultsfromtheInternationalConsortiumofPsychiatricEpideraiology(ICPE)SurveysJInternationalJournalofMethodsinPsychiatricResearch,,:KesslerRCEpidemiologyofdepressionintheAsiapacificregionJAustralasianPsychiatry,,(suppl):KesslerRCEpidemiologyofwomenanddepressionJ,JournalofAffectiveDisorders',:严和骏,肖世富,陆余芬,等综合性医院就诊者的心理障碍J上海精神医学,,:余殿飞,谢铜华战胜人类第一心理杀手:抑郁症的早期认识和有效防治M北京:中国医药科技出版社,:JasinskaAJ,LowryCA,BurmeisterMSerotonintransportergene,stressandrapherapheinteractions:amolecularmechanismofdepressionJTrendsinneurosciences():TangSW,HelmesteD,LeonardBIsneurogenesisrelevantindepressionandinthemechanismofantidepressantdrugactionAcriticalreviewJ,Theworldjournalofbiologicalpsychiatry:theofficialjournaloftheWorldFederationofSocietiesofBiologicalPsychiatry():PitychoutisPM,DallaC,SiderisAC,TsonisPA,PapadopoulouDaifotiZHT(lA),HT(A),andHT(C)receptormRNAmodulationbyantidepressanttreatmentinthechronicmildstressmodelofdepression:sexdifferencesexposedJNeuroscienceMay:GuentherU,TheuerkaufNU,HuseD,BoettcherMF,WensingG,PutensenCSelectiveHT(A)RagomstrepinotanpreventsremifentanilinducedventilatoiydepressionandprolongsantinociceptionJAnesthesiology():张獲緩抑郁大昆不同脑区神经递质变化的研究北京,中国人民解放军军医进修学院,CoppenA,ShawDM,MallersonAChangesinhydroxytryptophanmetaboliamindeprressionBritSPsychiat:SchildkrautJJThecatecholaminehypothesisofaffectivedisorders:areviewofsupportingevidenceAmJPsychiatry,,:a)MarazzitiD,BaroniS,MasalaI,etalCorrelationbetweenPlateletalpha()AdrenoreceptorsandSymptomSeverityinMajorDepressionNeuropsychobiology,,:代英杰,范骏,孟昭义抑郁症的神经生化特征及进展中国临床康复,,():BrunelloN,MendlewiczJ,KasperS,etalTheroleofnoradrenalineandselectivenoradrenalinereuptakeinhibitionindepressionEurNeuropsychopharmacol,,():WillnerPDopamineanddepression:areviewofrecentevidenceIEmpiricalstudiesBrainRes,():BowdenC,TheodorouAE,CheethamSC,etalDopamineDandDreceptorbindingsitesinbrainsamplesfromdepressedsuicidesandcontrolsBrainRes,,():MathewSJ,MnajiHK,ChameyDSNoveldurgsandthemPeutictgaretsofrseveremooddisodrersJNeuorpsyehophamracology,,():AxelsonDADoraiswamyPM,BoykoOBetalInvivoassessmentofpituitaryVolumewithmagneticresonanceimagingandsystematicstereology:relationshiptodexamethasonesuppressiontestresultsinpatients,PsychiatryRes,(),NibuyaM,NestlerEJ,DumanRSChronicantidepressantadministrationincreasestheexpressionofcAMPresponseelement binding protein (CREB)in rat hippocampusJNeurosci():LiYF,HuangY,AmsdellSL,XiaoL,O’DonnellJM,ZhangHTAntidepressantandanxiolyticlikeeffectsofthephosphodiesterase(PDE)inhibitorrolipramonbehaviordependoncyclicAMPresponseelementbindingprotein(CREB)mediatedneurogenesisinthehippocampusNeuropsychopharmacology():BranskiP,PaluchaA,SzewczykB,WieronskaJM,PilcA,NowakGAntidepressantlikeactivity ofBrcAMP, aPKAactivator,intheforcedswimtestJNeuralTransm():DwivediY,RizaviHS,TeppenT,SasakiN,ChenH,ZhangH,RobertsRC,ConleyRR,PandeyGNAberrantextracellularsignalregulatedkinase(ERK)signalinginhippocampusofsuicidesubjectsNeuropsychopharmacology():WangQS(王庆松),WangZG,ZhuPF,JiangJXDysfunctionofCacalmodulindependentproteinkinasescascadesinhippocampiofpredatorstressmodelratsChinJPsychiatry(中华精神科杂志)():(Chinese,Englishabstract)吉宏武丁霄霖.百合皂苷的提取分离与结构初步鉴定.林产化学与工业():~ManalMShehata王璋.百合中水溶性非淀粉多糖的分离与提纯.无锡轻工业大学学报():~EisenreichovaEHaladovaMMucajiPetalAnewsteroidalsaponinfromthebulbsofLiliumcandidumLPharmazie():康利平马百平史天军等知母中的两种新呋甾皂苷药学学报():孟志云徐绥绪李文等知母中新的皂苷成分中国药物化学杂志():陈勤胡雅儿夏宗勤知母皂甙元对东莨菪碱所致学习记忆障碍和脑胆碱乙酰转移酶活力降低的影响中药材():高秀飞刘胜刘胜运用百合知母汤治疗乳腺病的经验辽宁中医杂志:孙霃平刘胜高秀飞百合知母甘麦大枣汤治疗乳腺增生病临证体会新中医:王有章史桂珍小柴胡汤、百合知母汤加减治疗长期低热例河南中医:刘渝生百合知母汤临床应用举隅实用中医药杂志():洪燕百合知母汤合甘麦大枣汤治失眠例疗效观察江西中医药():魏绪华汤庆军自拟百合汤加味治疗抑郁症例江苏中医药():WangZL(王中立),DaiJG,ChenL,HuangYF,ZhaoYNPreventiveeffectsofPanaxginsengonneurondamageinducedbyhypercortisolismChinJExpTradMedFormulae(中国实验方剂学杂志)():(Chinese,Englishabstract)张颖,黄世敬逆转录聚合酶链反应在中医药治疗抑郁症分子机制研究中的应用J时珍国医国药,():刘佳莉,苑玉和,陈乃宏抑郁症的治疗研究进展J中国药理学通报,():

用户评价(0)

关闭

新课改视野下建构高中语文教学实验成果报告(32KB)

抱歉,积分不足下载失败,请稍后再试!

提示

试读已结束,如需要继续阅读或者下载,敬请购买!

评分:

/30

VIP

在线
客服

免费
邮箱

爱问共享资料服务号

扫描关注领取更多福利