不同蜜环菌菌株酯酶同工酶及过氧化物同工酶的研究

研究与探言寸 (中国医学科学院一中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100094) 王秋颖 郭顺星 樊锦艳 (北京市食品工业研究所，北京 100075) 吴 惧 许永红 ■ ■ 研竞不局来薄蟹环菌苗椿的琦毫同工毫置过氧化精同工 尊田谱 的变化规律 ；采用不连续鲁直板囊 丙蚌酰腱鬟腱 电办法；同一茵椿在不同的培养天美同工尊谱带的备美 不闻．但鼻有一定美t矗考率(RD抽同的j．带贯穿于整 十培养时间。不同蜜环茸茸糠鼻有各自特征性谱带。姑果 表明．同工尊谱带的多少厦活性与茸盐的生产速度置代 谢 的强弱点正相关。 j毫■一 生环曹 罔工酶 电诹 Albetrmct The change eg【e a8e end perexidase isozymes of differant ^ ∞ m 如 g【rains WaS studied using discontlnuOus 怕 n aI slab polypropylene aoryI amide geI eletropheresis The patterns and ac~iviies of 培0zv -eg in the 8arrle rajn exibited some difference at different culture days．but some of i8ozyme bends with same Rf value were visible in whole CU~Ure period． Each strain had its peculiar ben ds It s concluded Ihe number of 博0zⅥTle Denos and enzyme actw,ty were proportmnaI to the gro~ng e of mycelia as wslI as its metalool activity 鲫 wards ^qn口r 脚 ik isozyme：electrephoresis 中圈分类号：TS201 2 文献标识玛：A 文 章 编 号 ：1002-0306(2002)02-0038．-~ 幢蕾 日期 {2001-12—04 作者1I介：王敏辅(1963一)．士，拜宽员，研究方向：曹粪药特。 蜜 环 菌 刑脚d a me／．~ea('Vah1．FI)】是 一 种 美 味 食 药兼 用 真菌 ，据 中国 医学科 学 院 药物 研究 所 进 行 的 药理 实验 证 明 ，蜜 环菌 的发 酵 物与 天麻 有 类 似 的 药 理 作用 ，具 有镇 静 、抗 惊 厥 、增 强 耐 缺 氧 能 力 及增 强 肌体 免疫 功能 等作用 。因此 ，人们应 用 现代 生物技 术 将 蜜环 菌 发酵 培 养 ．已将 蜜环 菌 制成 各种 制 剂 ，用 于 医疗 ，效果 显 著 。 同时蜜 环 菌 又是一 种 促进 天 麻 、 猪 苓 生长 的重 要 菌根 真 菌 。兰科 名 贵药 用 植 物 天麻 的块 茎靠 蜜 环菌 侵 入为 其提 供 营养 ，天麻 才 能 正常 生 长 发育 ，蜜环 菌侵 入母 体 天麻 ，经过 一 定生 长期 后 ，母 体 天麻 烂掉 ，但 成倍 于母 体 的 天麻 却 繁殖 起 来 ；大型 药用 真 菌猪 苓 菌核 的生 产 发育 也 必须 由蜜 环 菌侵 入提 供 营养 。蜜环 菌菌 株 的选 育 是非 常 必要 的 ，我 们 在进行 了不 同 蜜环 菌菌 株生 物 学特 性 及 菌 丝多 糖 含量 的研 究 基 础上 ，对 不 同来 源 的蜜 环 菌 菌 株进 行 了酯 酶 同工 酶 及 过 氧化 物 同工 酶 的研 究 ．以 便 为 蜜环 菌优劣 的鉴定 提供 理论 依据 。 1 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1．1 实验材料 供试 蜜 环荫菌 株 蜜环 菌苗 株 A．由 中国医学 科 024产 酸 量 ：68．36g／L：第 四 轮 ：NAF一032产 酸 量 ： 73．05#L。 最 后得 到 的高产 菌株 为 NRRL395—032M，其 产 酸量为 73．05S／L。 2．8 菌种稳定性的测定 将 米 根 霉 NAF--O32在 PDA 斜 面 上 连 续 传 代 7 次 ，并 分 别 进 行摇 瓶 实 验 ，测定 其 产 酸 情 况 ，结 果 产 酸 量 分 别 为 73．10、彳2．68、73．50、73．24、72．95、73．25、 73．o0g／L 结 果表 明该 菌株具 有稳 定遗 传性能 。 3 结论 3．1本 实验 以 代谢控 制发 酵理 论 为依 据 ，利用 紫外 线 对 NRRL一395进行 诱 变 处理 ，然 后 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 利 用一 系列 的初 筛 平板筛 选得 到一 株 高产 L一乳 酸的 正 向突变 菌 株 NAF-032，其平 均产 酸 率为 73．05g／L，对糖 的转 化 率 为 68．4％ 。 3．2 建 立 了适 合 于产 酸丝 状米 根 霉 的 自然 分离 和诱 变 选 育 的玻 璃 营初筛 平 板 法 ，解决 了诱变 选 育过 程 中丝 状 真 菌蔓延 生 长 的问题 ，从 而大 大 降低 了选 育 的工作 量 。本实 验 达 到的产 酸 水平 与 文献 报道 的水 平 相 似 ，但 文献 中极 步 提及 具 体 的诱 变选 育 的方 法 和程 序及 原 理 ，本 文更 为详 尽地进 行 了说明 。 参 考文 献 (略 ) ． 维普资讯 http://www.cqvip.com 研究与探讨 表 1 不同蜜环菌菌株过氧化物同工酶谱带 Rf值比较 Vo1．23，No．2，2002 谱带 菌 株 A_ A： A4 A A-o A 0．105 0．105 0 105 0．154 0．154 0．153 0．154 0．210 0210 0210 n210 0，418 0 520 0 520 0．545 n582 0．582 0．594 0 594 0．615 0．637 0 637 0．692 0．692 0．718 718 0 748 0．748 0．825 0．825 0．839 n867 n866 0．9O5 0 92O n958 0084 0108 0108 0112 n135 0135 0153 0．189 0．210 0．210 0．392 0-412 0．541 0 559 0．559 0，594 n657 0615 0 105 0105 0108 0108 0．135 0135 n153 0 154 0．153 n153 0．189 0．189 n210 n210 0．541 0．545 0．541 0 547 0．554 0．559 0．594 n615 0．392 0 594 0615 O．642 n664 O．642 0．642 0．642 0．642 0．694 0．760 0．895 0．746 0．748 0．741 0 769 0．825 0 853 0 867 0 867 0．867 0．874 0．958 0．846 0 958 学 院药 用植 物研究所 真 菌室 提供 ，A 采 自安徽 ， 采 自陕 西 ．A 采 自福 建 ，A5采 自云 南 ．A 采 自 四川 ，A 采 自山西 ，A日采 自河 南 ．A 采 自韩 国 ，A 。采 自新 西 兰 ，A_ 采 自河 北 ； 培 养 基 菌 索 的 培养 采 用 麦 麸一葡 萄 糖 半 固体 培 养 基 ：麦 麸 50g，葡 萄 糖 20g，KH2Pq2g，Mgs041．5g， 琼脂 7E，水 1000ml。 1．2 样品的制备及电泳 1．2．1 样 品的制备 分别 为 25℃条件 下培 养 6d、13d 及 20d的蜜 环菌茵 索 。取各 待测菌 株菌 索适 量 ，分别 用 蒸 馏水 将茵 索 冲洗干净 ，吸去 菌 索表 面 的水 分 ，电 子天 平称重 。样 品加 液氨研磨 ，然 后按 1：4的 比例 加 入 Tris一柠 檬 酸样品缓 冲液 继续 研磨成 浆 。研磨 液 在 4℃ ，8000r／min离 心 15min，取 其 上 清 液 ，在 4℃ ， 1200~r／min再 次离心 10min．取 其 上清 液置 冰箱 内保 存 备用 。 1．2．2 电泳及 染 色 采用 不连续 垂 直 板 聚丙 烯酰 胺 凝胶 电泳 ，DYY型 稳压 稳流 电泳仪 过氧 化物 同工酶 ：样 品分离胶 浓度 7．O％ ．pH8．8； 样 品浓 缩胶 浓度 4．0％,pH6．8。电极缓 冲液 为 高离 子 强度 的 Tris-甘氨 酸 系统 ，pH8．3 。 酯酶 同工酶 ：样 品分 离胶 浓 度 7 0％ ，pH8．8；样 品 浓 缩胶 浓 度 4．O％ ．pH6．8。 电极 缓 冲液 为低 离子 强 度 的 T s一甘 氨 酸 系 统 ，pH8．3 。 点 样量 2o 1，0．2％的溴 酚蓝作 为 指示剂 ．在 4℃ 条 件 下 进行 电泳 ，开 始在 100V 恒压 下 进 行 ．待 指 示 剂前 沿进 入 分 离 胶 后 ．加 大 电压 至 恒 压 2OOV，指 示 剂前沿 距 胶底 端 0．5～1．0cm 时 ，停 止 电泳 。过 氧 化 物 同212酶 大 约需 5h，酯酶 同工 酶 大约 需 3～4h；拆 板 ，进 行 染色 。 过 氧 化 物 同工 酶 染 色 采 用 改 良联 苯 胺 染 色 系 统 ；酯 酶 同工 酶染 色 采用 醋 酸一 蔡 酯 和 坚牢 蓝 染 色 系统 。 将凝 胶用 蒸馏水 冲洗一 次 ，放 人上 述混 合好 的染 色液 中 ，37℃条件 下保 温振 荡 ，过 氧化 物 同工 酶 5～ 10mln，酶带显 出，立 即 去掉 染 色液 ，用 自来 水 冲洗 ，每 天按水 2-3次 ，2 d，酶 带 由蓝色全 部变 为棕色 。酯酶 同工酶 10-~60min褐色酶带 显示 清楚 ，去掉 染 色液 ．凝 胶板 用蒸 馏水 冲洗 干净 ，保存 在蒸馏 水 中 2 结果与分析 2．1 同一菌株在不同培养时间同工酶谱变化规律分析 对 培 养 6、13、20d的蜜 环 菌 进 行 酯 酶 同 工 酶 及 2 4 6 7 8 9m n：j¨ H " ∞ ∞ 拍盯勰扣 维普资讯 http://www.cqvip.com 过 氧 化 物 同工 酶酶谱 分 析 ，结果 表 明谱带 的多少 及 其 活性 与 菌丝 的生 长速度 即代谢 强度 成 正 比。 如 号 菌 株 在 其 培 养 的 lO～12d时 ，菌 丝 的 平 均 生 长 速 度 最 快 为 o．045-o．057b~m／s，此 时 该 菌 株 酶 带条 数 最 多 ，酶带 的颜 色最 深 ，过氧 化物 同工 酶酶 带 由培 养 6d 时 2条酶 带增 加 为培 养 13d时 的 5条 酶 带 ，而 且 酶 带 的颜 色 由浅 变深 、谱 带 变 宽 ；A 号 菌 株在 培 养 14d 时 ，菌丝 生 长的平 均速 度最 快 0．0035b~m／s，此 时酶带 条数 最 多 ，其酯 酶 同工 酶 酶带 由培 养 6d时 2条 酶带 增加 为 培 养 13d时 的 4条 酶带 ，而 且 酶 带颜 色 由浅 变 深 。 各 菌 株 均在 一定 培养 时 间 内 同工酶 谱 带趋 于稳 定 ，如菌株 、A ，其 酯酶 同工 酶在 培养 13d至 20d 时 ，酶带 数基本 趋 于稳 定 ；菌 株 、 ，其 过 氧 化物 同 工酶 在培养 13d至 20d时 ，其 酶 带数基本 趋 于稳定 。 2_2 不同菌株同工酶谱分析 分 析 培养 6、13、20d各 蜜环 菌 株 酯 酶 同 工酶 及 过 氧化 物 同工酶 酶谱 ，结 果 可 以看 出各 菌 株之 间 除 共 有 的酶 带 外 ，均 具有 各 自特 征 性 谱带 ，如菌 株 A 、 A—A-o在培 养的第 6d和 13d时的 酶带条 数 和迁 移率 完 全一 致 ，但 在培 养第 20d时 出现 了特 征 性 酶带 ，特 别 是 A 号菌 株 。A 号 菌株 不论 是 酯 酶 同工 酶 ，还 是 过 氧化物 同工 酶 ，其特 征性 酶带 比较多 ，而且 酶带 总 条 数也 比其 它 菌株 少 ，这说 明 A6号 菌株 的遗传 特 性 与其 它菌株 差异 很大 。而 菌株 A A 不论 是培 养 6、 13d，还 是 培 养 20d的酯 酶 同工 酶 和 过 氧化 物 同工 酶 ．除酶带 深 浅 存在 一点 差 异外 ，其 酶带 条数 基 本 一 致 ，这说 明二 者遗传 特性 相近 ，具 有 相近 亲缘关 系 。 研究与探讨 3 讨论 3．1 蛋 白质是 生命 的重要 物质 基础 ，酶是生 物体 实 现 正常 代 谢 的必 要 条件 ，是 生 命活 动最 重 要 的 因素 It] 。 在对 A．～A 号 蜜环 菌菌株 进行其 酯 酶 同工酶 和过 氧 化 物 同工酶 研 究 时 ，A 、A9、A 。号 菌株 在培 养 的 第 13d时 ，酶 活性 最 强 ；在 将 各 菌株 依 据它 们 各 自的生 长速 度进 行 比较 ，即对 各菌 株 的代谢 最 旺盛时 期 的 代谢 产 物量 比较 ，对 选 育 出优 良的发 酵 菌 株有 一 定 参考 价值 。 3．2 对 同一 菌种 不 同菌株 之 间的 酯酶 同工 酶 和过 氧 化 物 同工 酶 酶 谱进 行测 定 ，为鉴 定 同一 菌种 不 同菌 株 之 间的差 异 性 提供 了重要 指 标 ．al。A 号 菌株 其过 氧 化 物 同工 酶 除培 养 6d时 一条 酶 带 的迁 移率 与 A： 号 菌 株 的一 条 酶 带 的迁 移 率一 致 以外 ，其余 酯酶 同 工 酶 酶谱 和过 氧 化物 同工 酶酶谱 的谱带 均 为 特征 性 谱带 ，因此 号菌 株与 其 它 1O个 菌株 具 有 较大 的 差异 ，很 可能 是 一株 变异 菌 株 。A．号菌 株 与 A 号 菌 株 ， 号 菌 株 、A 号菌 株 和 A 号 菌株 之 间 的差 异较 小 ，见 表 1。 参考文献 1 王秋颖，待嫦 堂．猪萃茵酯酶同工酶噩过氧化物 同工酶的研 究．中国药学杂志，1999，34(1】：9 2 何忠孝，张材正．电泳．北京 科学出版社 1999 3 陈讳群 张乏宁．十字花科上的连抱格属真茵同工酶凝肢电 泳分析．真茵学报 1994，13(4)：295 4 魏 艳教 周与 良．缸酵母属 同工酶酶谱 分析噩其分 类研究． 茵转 系统．1998，17(1)：63 维普资讯 http://www.cqvip.com