类胡萝卜素生物合成的分子生物学研究

成的分子生物学研究 100094) 惠伯棣 钟 粟 朱 蕾 欧阳清波 曾 悦 关■ 词 类胡萝 素 生物 合成 Abstract This review summarized recent progress in the molecular biology of carotenoid biosynthesis in vivo． Some experimental techniques applied in those studies were also outlined ][6ey words carotenoid；biosynthesis 综 妻 T。 S201 ∞ 述 类胡萝 卜素生物合成的化学过程在几十年前就 已 被 系 统 的 研 究 ， 但 对 于 其 分 子 生 物 学 方 面 的 研 究 只 是 在 近 十 几 年 才 得 到 发 展 。 在 过 去 十 年 中 ，在 这 一 领 域 内 的工 作 已 取 得 了飞 速 的进 展 。迄 今 为止 ，主 要 的 研 究 成 果 主 要 集 中 在 两 方 面 ：基 因 和 基 因 产 物 。 1 类胡萝 卜素生物合成基因和基因产物的命名 在 高 等 植 物 和 微 生 物 中 ，多 个 类 胡 萝 卜素 合 成 基 因 已被 克 隆 。 ~c#t-，多 个 基 因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 产 物 (多 为 合 成 酶 )已 被 分 离 和 鉴 定 。 但 是 ，这 些 基 因 及 其 产 物 的 命 名 系 统 仍 在 发 展 中 。在 微 生 物 中 ，类 胡 萝 卜素 合 成 基 因 和 基 因产 物 的命 名 是 根 据 其 干 名 “Crt” 衍 生 出来 的 。 “Crt”为 斜 体 时 代 表 基 因 ，“Crt”为 正 体 时 代 表 基 因 产 物 。 每 个 基 因 和 基 因 产 物 的 名 称 是 在 干 名 “Crt” 后 加 后 缀 (通 常 为 大 写 字 母 )而 构 成 的 。 在 高 等 植 物 中 ，类 胡 萝 卜素 合 成 基 因 和 基 因 产 物 的命 名 通 常 是 由基 因产 物 (酶 )所 催 化 的反 应 衍 生 而 来 。 斜 体 字 代 表 基 因 ，正 体 字 代 表 基 因 产 物 。 因 此 ，有 时 合 成 途 径 中 催 化 同 一 反 应 的 酶 和 基 因 可 能 有 两 个 名 字 。例 如 ， 催 化 八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 反 应 的 酶 在 微 生 物 中 被 命 名 为 CrtI，而 在 高 等 植 物 中被 命 名 为 PDS。 2 类胡萝 卜素生物合成基因和基因产物 在 过 去 十 几 年 中 ，关 于 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 的 收稿 日期 ：20o2一l2一l9 作者简介：惠伯棣，男．博士。 分 子 生 物 学 研 究 主 要 集 中 在 基 因 克 隆 和 各 种 酶 的 分 离 和 鉴 定 工 作 上 。 显 然 ，这 一 努 力 将 持 续 下 去 ，直 到 所 有 的 有 关 基 因 全 部 被 克 隆 出 来 。 许 多 文 献 均 报 道 了 这 方 面 的 工 作 和 成 果 【 ，6．261。 表 l列 出 了部 分 已知 的 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 基 因 和 基 因产 物 。 在 上 述 克 隆 工 作 中 ，四 种 技 术 发 挥 了 重 要 的 作 用 ：异 源 分 子 杂 交 、差 cDNA 筛 选 、转 座 子 标 记 以 及 利 用 纯 化 酶 的 抗 体 对 cDNA 库 进 行 筛 选 。 3 微生物 很 多 原 核 生 物 (包 括 ：光 合 及 非 光 合 细 菌 、藻 类 和 真 菌 )都 可 合 成 类 胡 萝 卜素 。Rhodobacter species 是 一 种 厌 氧 光 合 细 菌 。 它 在 体 内可 以 合 成 类 胡 萝 卜 素 。 已 经 观 察 到 ，类 胡 萝 卜素 在 Rhodobacter species 中 的 生 物 合 成 一 般 可 达 到 链 孢 红 素 的 水 平 。Marrs等 人 在 对 Rhodobacter species中 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 进 行 研 究 的 过 程 中 ， 首 次 将 分 子 生 物 学 方 法 引 入 到 类 胡 萝 卜素 的生 物 合 成研 究 中 91。 Marrs等 人 在 对 Rhodobacter capsulatus的研 究 中 ，类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 酶 的 基 因 首 先 被 克 隆 和 筛 选 出 来 。 这 一 进 展 开 辟 了 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 研 究 的 新 前 景 ，标 志 着 一 个 时 代 的 开始 [24~-1。即使 在 现 在 ，许 多 生 物 合成 的 分 子 生 物 学 研 究 仍 然 是 在 Rhodobacter species和 相 关 的 光 合 细 菌 中 进 行 的 。 图 l列 出 了 所 有 已 知 的 在 Rhodobacter species中 的 art基 因 及 其 表 达 产 物 。 已经 证 明 ，类 胡 萝 卜素 在 体 内按 照 类 异 戊 二 烯 途 径 进 行 生 物 合 成 。显 然 ，在 GGDP形 成 以前 的 初 期 阶 段 ，许 多 在 类 异 戊 二 烯 途 径 中 与 合 成 反 应 有 关 的 基 因都 参 与 了 类 胡 萝 卜素 的 生 物 合成 。然 而 ，对 合 成 初 期 的 基 因 研 究 很 多 都 集 中 在 GGDP合 成 酶 基 因 上 。GGDP合 成 酶 基 因 已在 多种 真 核 生 物 中进 行 了克 隆 和 测 序 的 研 究 ，如 Rhodobacter capsulatus、Erwin species 『41和 Neurospora crassa。 被 克 隆 的 基 因 包 括 CrtE、gds、idsA 和 al-3。 编 码 八 氢 番 茄 红 素 合 成 酶 的 crtB 基 因 也 已 在 Rhodobacter species 中 得 到 鉴 定 『41， 并 在 维普资讯 http://www.cqvip.com 表 1 一些 类胡 萝 卜素生物 合成 基因 和基 因产物 酶功能 基 因 生物 Formation of GGDP GGDP synthase Form ation of hytoene／dehydrosqualene Phytoene synthase Dehydrosqualene synthase Form ation of B—carotene／diaponeurosporene Phytoene desaturase(CrtI—type) Phytoene desaturase(CrtP—type) Dehydrosqualene desaturase X-Carotene desaturase Lyeopene cyclase(CrtY—type) Lycopene cyclase(CrtL-type) crtE idsA 一 3 GGDpS crtB 一 2 SyJ y2 crtM crtl 一 J PDH cnP pDs crtN crtQ crtY crtL Form ation of acyclic xanthophylls Hydroxyneurosporene synthase crtC Hydroxyneurosporene desaturase crtD Hydroxyneurosporene——O——methyltransferase crtF Spheroidene monooxygenase crtA Form ation of cyclic xanthophylls and xanthophyll glycosides B—Carotene hydroxylase cnZ Zeaxanthin glucosylase crtX B—C—4一oxygenase crtW Capsanthin—capsorubin synthase CCS Various eubacteria Archaebacterium (5．ac／doca／darius) Archaebacterium fM thermoautotrophicum) Fungus( Crass Various higher plants Various eubacteria(including cyanobacteria) Fungus( Crass Various higher plants Various higher plants Eubacterium A ureus) Various eubacteria(excluding cyanobacteria) Fungus f Crassa) Fungus(C Nicotianae1 Various cyanobacteria Various higher plants Eubacterium (s．A ureus) Cyanobacterium nabaena sp．Strain PCC712o) Eubaeteria(Erwinia sp．、 Cyanobacterium (Synechococcus sp．Strain PCC7942) Eubacterium ．capsulatus) Eubacterium (Rhodobacter sp．) Eubacterium ．capsulatus) Eubacterium ．capsulatus) 综 Eubacteria(Erwinia sn 1 Eubacteria(E inia spvj- 述 Eubacteria ．aurantiacum,A lcaligenes尸c-J) Bell pepper fC annuum) 拢 牛 儿焦 磷酸 (GGDP) CI1 八 氢番茄 红素 (Phytoene) r 六氢 番茄 红素 (Phytoene) 链 孢 红素 (Neurosporene) C 羟基 链孢 红素 (Hydroxyneurosporene) t F：O一甲基 化 Crt D：3，4一去饱 和 t D：3，4-去饱 和 Crt F：O一甲基 化 球 型烯 (Spheroidene) CI1 球 型烯酮 (Spheroidenone) C，Crt K A 图 l Rhodobacter species中 Crt基 因及其 表达 产物 Synechococcus PCC7942 中被 克 隆 ，还 在 Escherlchia coli中 被 成 功 地 表 达 。 在 Neurospora crassa中 ， 一2 代 替 crtB 编码 八 氢 番 茄 红 素 合 酶 。 编 码 CrtI型 八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 酶 的 基 因 已 在 Erwinia uredovora It3]、Erwinia herbicolat4]、M yxococc xanthus、Rhodobacter capsulatus [51、Rhodobacter sphaeroides和 Neurospora crass 5l中 得 到 鉴 定 。 这 些 生 物 可 以 从 八 氢 番 茄 红 素 通 过 3-4次 连 续 的 去 饱 和 作 用 生 成 链 孢 红 素 或 番 茄 红 素 。 在 藻 青 菌 中 ，CrtI型 八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 酶 被 CrtP型 酶 取 代 。 CrtP型 酶 在 结 构 与 功 能 上 都 与 CrtI型 八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 酶 不 同 ，它 可 催 化 2个 去 饱 和 作 用 ，从 而 将 八 氢 番 茄 红 素 转 变 成 ‘一胡 萝 卜素 151。 在 含 有 CrtP型 酶 的 生 物 (如 ：A 0e胞 species Strain PCC7120)中 ，由 Crt尸 催 化 产 生 的 ‘一胡 萝 1-素 ，经 ‘一胡 萝 1-素 去 饱 和 酶 (即 CrtQ)的催 化 ，通 过 2次 进 一 步 的 去 饱 和 作 用 ，变 成 番 茄 红 素Ⅲ。CrtQ基 因也 已从 这 类 生 物 中 鉴 定 出 来llI。 两 种 编 码 催 化 形 成 B 环 的 酶 的 基 因 CrtY 和 CrtL 已 分 别 从 Erwinia species和 藻 青 菌 中 鉴 定 出 来 。 并 且 ，CrtY 在 Escherichia coli中 成 功 地 得 到 表 达 。 由 这 2种 基 因 编 码 的 酶 的 一 级 结 构 不 同 ，但 可 催 化 相 同 的 环 化 反 应 ， 使 番 茄 红 素 形 成 B一胡 萝 卜素 iii．ioq。 Cunningham 等 人 也 从 Synechococcus PCC7942 中克 隆 出 编 码 番 茄 红 素 环 化 酶 的 基 因 ， 并 在 Escherichia coli中 表 达 了 此 基 因 ll 0l。 已 经 证 明 ，Erwinia species可 生 物 合 成 类 胡 萝 1- 素 ，其 最 终 产 物 为 玉 米 黄 类 。 在 Erwinia herbicola 中 ，编 码 催 化 B一胡 萝 卜素 羟 基 化 反 应 酶 的 基 因 C 维普资讯 http://www.cqvip.com 综 述 1O8 已被 鉴 定【‘61。尽 管 多 数 类 胡 萝 卜素 合 成 系 统 可 合 成 环 状 类 胡 萝 卜素 ，但 某 些 细 菌 (如 Rhodobacter species) 只 积 累 非 环 化 的 叶 黄 素 。 在 Rhodobacter capsulatus 中 ，非 环 化 叶 黄 素 的 形 成 起 始 于 链 孢 红 素 的 羟 基 化 。 参 与 链 孢 红 素 羟 基 化 的 基 因 如 CrtC、 tD、CrtD 和 C F 已从 Rhodobacter capsulatus中 被 克 隆 并 鉴 定 出 来 【 。 关 于 crt基 因 以 及 这 些 基 因 编 码 的 能 催 化 形 成 GGDP、 八 氢 番 茄 红 素 、13一胡 萝 卜素 和 叶 黄 素 的 酶 的 详 细 情 况 可 见 有 关 报 道 【‘,2．3．261。 4 高等植物 在 高 等 植 物 中 ，对 3个 生 物 合 成 反 应 的 研 究 进 行 的 比 较 多 ，即 GGDP 合 成 、八 氢 番 茄 红 素 的 合 成 以 及 八 氢 番 茄 红 素 的去 饱 和 作 用 。 对 相 应 的 3 种 酶 以 及 编 码 这 些 酶 的 基 因 进 行 的 研 究 也 比 较 彻 底 ，包 括 ：GGDP 合 成 酶 (GGDPs)及 其 基 因 、八 氢 番 茄 红 素 合 成 酶 (PSY) 及 其 基 因 和 八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 酶 (PDS)及 其 基 因 。 在 高 等 植 物 中 ，GGDP合 成 酶 是 一 种 多 功 能 异 戊 烯 转 移 酶 ，它 可 催 化 形 成 GDP、FDP 和 GGDP。 GGDP 合 成 酶 已 通 过 亲 和 层 析 从 Cap sicum annuum 果 实 组 织 细 胞 的 质 体 中 纯 化 出 来 。 编 码 此 酶 的 基 因 也 已 被 鉴 定 【 。 此 外 ，Bartley 和 Scolnik 也 从 Arabidopsis aliana中 克 隆 出编 码 GGDP合 成 酶 的基 因[61。 编 码 八 氢 番 茄 红 素 合 成 酶 (PsYs) 的 基 因 已在 A rabidopsis thaliana [61、Capsic um annuum 、 Lycopersicon esculentum 和 Zea mays[61中 得 到 鉴 定 。PTOM5是 一 个 cDNA 克 隆 ，最 初 被 鉴 定 为 促 进 果 实 成 熟 的 基 因 【 ， 而 后 又 被 确 定 为 在 Lycopersicon esculentum 的 果 实 中 编 码 PsY 的 基 因 l。 此 基 因 明 显 地 表 现 出 与 从 Erwinia species 和 Rhodobacter species中 获 得 的 CrtB 的 同 源 性 『41。 Misawa 等 人 在 Escherichia coli．中 进 行 了 该 基 因 的 表 达 。 随 后 ．人 们 在 番 茄 叶 子 中 发 现 并 鉴 定 了 另 一 种 编 码 PSY 的 基 因 。目前 ，在 果 实 中 鉴 定 的 与 f，roM5有 关 基 因 被 称 为 PSY1，在 叶 子 中 发 现 的 PSY 被 称 为 PSY2。 在 高 等 植 物 中 ，八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 酶 (PDS)可 催 化 引 入 双 键 的 反 应 ，并 通 过 2个 去 饱 和 作 用 为 八 氢 番 茄 红 素 提 供 共 轭 双 键 结 构 ， 以 便 形 成 8一胡 萝 卜 素 旧。编 码 PDS 的 基 因 已 从 G．Max，L．Esculentum 和 C Annuum 中被 克 隆 出来【 51。目前 已有 文 献 报 道 了编 码 8一胡 萝 卜素 去 饱 和 酶 (ZDS)基 因 的 鉴 定 。 Norris等 人 对 Arabidopsis，中八 氢 番 茄 红 素 的 去 饱 和 作 用 进 行 了 基 因 研 究 【 “。 “黄 金 大 米 ”的 研 制 是 近 年 来 在 禾 本 科 高 等 植 物 中 表 达 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 基 因 的 大 胆 尝 试 。 该 项 工 作 的 成 功 之 处 是 在 水 稻 中建 立 完 整 的 类 胡 萝 卜素 基 因 表 达 系 统 时 充 分 利 用 了水 稻 中 已 有 的类 异 戊 二 烯 合 成 系 统 。 5 类胡萝 卜素生物合成的调控 一 般 来 说 ， 类 胡 萝 卜素 在 体 内 的 生 物 合 成 是 通 过 基 因 和 环 境 因 素 (如 ：光 、氧 及 营 养 等 )多 级 调 控 的 。 许 多 文 章 都 论 述 了 不 同 种 生 物 中 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 的 调 控 l。 在 此 ，只 将 基 因调 控 及 合 成 抑 制 方 面 的 研 究 予 以 介 绍 。 5．1 基 因调控 高 等 植 物 光 和 组 织 的 多 种 突 变 可 影 响 其 中 的 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 ，并 可 能 会 产 生 多 种 表 型 ，包 括 在 叶 子 生 长 过 程 中 的 光 漂 白 和 其 它 变 化 。 许 多 人 已 对 Arabidopsis thaliana, Lycopersicon esculentum 和 Zea mays中 的 突 变 做 了 深 入 的 研 究 [91。 此 外 ，已 有 文 献 报 道 了 在 Hordeum vulgare、Cap sicum annuum 和 Helianthus a~nulA$中 的 突 变 。 除 了 突 变 之 外 ，高 等 植 物 中 类 胡 萝 卜素 的 生 物 合 成 也 受 到 植 物 生 长 和 个 体 发 育 的 调 控 ， 例 如 ，尸sy 和 PDS 在 Lycopersicon esculentum 的 叶 子 、 花 和 果 实 中 的 表 达 就 明 显 不 同 。 在 花 的 发 育 期 ， 这 两 种 基 因 的 表 达 产 物 会 比 开 花 前 多 10倍 【 。 与 高 等 植 物 相 比 ，微 生 物 中 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 的 基 因调 控 比较 简 单 。母 菌 株 通 过 各 种 处 理 (如 物 理 、化学 和 放 射 等 处 理 )即可 得 到 突 变 型 或 新 菌 株 。 5．2 合成 的抑制 对 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 抑 制 的 研 究 已 有 40年 的 历 史 。Bramley曾 对 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 的 抑 制 以 及 各 种 抑 制 剂 的 情 况 进 行 过 全 面 的 评 述 [81。 已 经 证 明 ，多 种 化 合 物 在 合 成 途 径 中 可 抑 制 各 种 反 应 ，主 要 是 八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 环 化 反 应 。 图 2阐 明 了 多 种 抑 制 剂 和 其 作 用 点 。 这 些 抑 制 剂 在 生 物 合 成 途 径 和 反 应 机 制 的 研 究 中 起 到 了重 要 的作 用 ，尼 古 丁 是 一 MVA 、L 一Target sIIe(‘) GGDP Target site(Bis—pheny1) derivatives and various bleaching herbicides Target site(Pyrichlor， dichlormato，etc．) cycliz 。n c、Lopen e Cyclic carotenoids 一‘‘ ⋯⋯‘ ‘V‘u⋯ ●J n of tro 。 d xyg uct e io n n 、L TLAarBget11s7it6e8(T2emtcyc1 a如， Xanthophylls — ‘一‘— 一一‘ ‘。’ 。 。 图 2 类胡萝 卜素生物合成抑制剂的作用位点示意图 维普资讯 http://www.cqvip.com 个 典 型 的 例 子 。 它 可 在 各 种 微 生 物 中 抑 制 环 化 反 应 ， 从 而 导 致 番 茄 红 素 和 链 孢 红 素 在 体 内 的 积 累 ， 现 被 大 量 用 于 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 途 径 的研 究 中 。 类 胡 萝 卜素 的 生 物 合 成 对 许 多 生 物 (尤 其 是 光 合 生 物 )的 生 命 是 很 重 要 的 ，抑 制 类 胡 萝 卜素 的 生 物 合 成 可 能 导 致 生 物 体 的 死 亡 。在 高 等 植 物 的 光 合 组 织 中 ， 八 氢 番 茄 红 素 去 饱 和 反 应 的 抑 制 剂 可 导 致 组 织 失 去 颜 色 ，最 终 导 致 植 物 体 的 死 亡 。 因 此 ，这 些 抑 制 剂 亦 可 作 为 漂 白 除 草 剂 。 6 结论与展望 分 子 生 物 学 方 面 的 工 作 是 现 阶 段 类 胡 萝 卜素 生 物 合 成 研 究 领 域 中重 要 的组 成 部 分 。这 方 面 的 工 作 将 在 如 下 三 个 方 面 继 续 发 展 ： 6．1 克 隆 合 成 催 化 各 步 反 应 所 需 酶 的基 因 。 这 一 努 力 将 持 续 下 去 ，直 到 所 有 的 有 关 基 因都 被 克 隆 出来 。 6_2 基 因 的 表 达 是 今 后 工 作 的 重 点 之 一 ， 已 克 隆 出 来 的 基 因 在 不 同 的 生 物 模 型 中 的 表 达 是 技 术 成 果 应 用 的 关 键 。 这 一 努 力 会 导 致 一 些 极 具 经 济 效 益 的 产 业 化 成 果 。 6．3 基 因 表 达 的 产 物 一酶 也 是 今 后 研 究 的 重 点 之 一 ，包 括 酶 的 分 离 、纯 化 、制 备 以 及 功 能 鉴 定 等 。 我 们 希 望 中 国 的 研 究 人 员 能 在 上 述 几 个 方 面 加 强 基 础 研 究 ，获 得 较 有 经 济 价 值 的 成 果 ，为 国 民 经 济 的 发 展 做 出 贡 献 。 参考文献 1 Armstrong，G．A．Bacterio1．1994．176：4795 2 Arm strong，G．A．In Advances in Photosynthesis(Vo1．2) (Blankenship，R．E．；Madigan，M．T．and Bauer，4C．E．eds．1 K1uwer Academic Publishers．Dordrecht ， The Netherlands．1995 3 Armstrong，G．A．，Hearst，J．E．FASEB，1996(1 01：228 4 Arm strong，G．A．，Schmidt，A．，Sandmann，G．，Hearst ， E． Bi01．Chem．．1990．265：8329 5 Bartley， G． E．， Schmidhauser， T．J．， Yano~ky， C． and Scolnik，P．A．Bio1．Chem．．1990．265：16020 6 Bartley， G． E．， Scolnik，P．A．Annu ． Rev． Plant Physio1． Plant Mo1．Bio1．，1994，45：287 7 Bird，C．R．，Ray，J．A．，Fletcher，J．D．，Boniwell，J．M． Bird，A．S．Tuelieres，C．，Blain，I．，Bramley，P．M．，Schuch， W．BioTech．，1991(9)：635 8 Bramley，P．M．In Carotenoids in Photosynthesis(Young，A． and Britton，G．eds．)Chapman ＆ Hal1． ndon，1993．127 9 Buckner， B．， Kelson，T． L．， Robe~son， P． S．Plant Cel1． 1990(21：867 10．CunninIghaln，F．X．Jr．，Chamovitz，D．，Misawa，N．，Gantt， E．，Hirschberg，J．FEBS Lett，1993，328：1 30 l1 Cunningham， F．X．Jr．，Pogson，B．，Sun，Z．，McDonald， 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