转基因植物生产药用蛋白的研究进展2006

现代生物医学进展 Prolwess in Modern Biomedicine 2006 Vo1．6 N0．9 ·73· 转基因植物生产药用蛋白的研究进展 康 杰芳 王拮 之 (陕西师范大学生命科学学院，药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室 陕西 西安 710062) 摘要：利用转基因植物作为生物反应器生产具有重要价值的多肽和蛋白质，包括抗体、疫苗、药用蛋白等较之其他生产系统 具有很多优越性，已成为当前植物医药基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 和药物生物技术领域中的研究热点，本文着重就这一领域近年采国内外的研究 现状、发展趋势以及 目前存在的问题及对策进行综述。 关键词：转基因植物；药用蛋白；生物反应器 中图分类号 IQ946．1 文献标识码iA Progress in Transgenic Plants Producing Pharmaceutical Proteins KANG胁 一fang，WANG Zhe—zhl (College ofLife Science~，Shaanxi Normal University， laboratory ofMinistry ofEducation for Medicinal Plant Resource and Natural Phan'naceatical Chemistry，Xi’∞，Shaanxi 710062，China ABSTRACT：Th e 8ppllcation oftransgenic plants as bioreactors in the production of highly valued medical polypeptides and proteins，such as antibodies，vaccines and pharlllaeeulJcal proteins，has nmny advantages over other production systems，and has become a hot polnt in the plant genetic engineefing and pharmaceutical biotechnology in recent years．The progresa，existing problems and the new strategies in this field were re— viewed in tiffs article． Key words：Transgenic plants；Pharmaceutical protein；Bioreactor 近年来随着生物技术的迅猛发展，植物生物技术、医学和 制药工业紧密结合 ，开创了医药产业的新起点，利用转基因植 物作为生物反应器生产具有重要经济价值的异源蛋白(特别 是药用蛋白)，正在成为当前该领域中研究最活跃、产业发展 最迅速 、效益最显著的热点之一，它为人类提供了一个更加安 全和廉价的生产体系。 1 转基因植物生产药用蛋白的优点 转基因植物是指运用重组 DNA技术将外源基因整合于受 体植物基因组，改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转 基因植物作为生产药用蛋白的生物反应器，具有常规的微生 物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统不可 比拟的潜在 优越性：如生产成本较低；利于大规模工业化生产；表达产物 可糖基化、酰胺化、磷酸化；精确的切割、折叠及亚基的正确装 配等翻译后加工过程；表达产物具有与高等动物细胞一样的 免疫原性和生物活性L】 ；安全性好，不存在对人体健康有害的 病原体等。 2 转基因植物生产药用蛋白的表达系统 植物基因工程生产药用蛋白的过程一般包括 目的基因的 克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、受体细胞 的组织培养和植株再生、转化植株栽培、目标产品的分离纯化 及纯度鉴定等，其中载体表达系统主要有两种 ：稳定的整合表 达系统和瞬时表达系统。 作者简介：康杰芳．(1971一)．女，在读博士 主要从事生物技术的研究 (收稿日期：2OO6—06—26 接受日期 ：2OO6—07—30) 2 1 稳定的整合表达系统 外源基因导人宿主细胞并整合到宿主基因组中，且能够 稳定表达 目的蛋白的转基因植株称为稳定表达系统。例如用 根癌农杆菌介导外源 DNA或直接导人法将外源基因导人植物 受体细胞 ，并整合在核 DNA上，该表达系统的优越性在于易获 得大量稳定表达和生产多价复合疫苗的植株，可通过特异性 表达启动子使抗原基因在器官或组织中特异性表达。Ponstein 等l2 J将来源于A·niger植酸酶 phyA基因转移到油菜籽中，用种 子特异性启动子 CmA控制 phyA，并在植酸酶成熟肽前加上十 字花科信号肽序列，结果发现 95％的油菜籽实中检测到了植 酸酶的活性 ，此酶对胃蛋白酶具有抗性。 2．2 瞬时表达系统 瞬时表达系统是利用可在植物中自行复制的植物病毒为 载体表达异源蛋 白。植物病毒具有广寄主性，能够感染多种 植物，且基因组小，易于进行遗传操作。以植物病毒为载体将 目的基因插入病毒基因组中，并置于强启动子的控制下 ，然后 用重组病毒感染植物，外源基因则随病毒的复制而高水平表 达(接种后 1—2周)，从已感染病毒的叶片中提取病毒蛋白， 酶解后即可获得 目标蛋白，一般病毒蛋白可以占到感染病毒 叶片总蛋白含量的 50％。外源蛋白产生的形式或是独立的多 肽，或与病毒基因产物融合。大多数植物病毒可借助快速的 机械接种感染植物，适合于大规模的商业化生产，利用这类方 法有望获得高产量的药用蛋白，实现生产蛋白质的“绿色工 厂”。目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋 白表达载体，包括花椰菜花 叶病毒 (CaMV)、烟草 花叶病毒 (1 )和豇豆花叶病毒(CPMV)等，其中超过 150多种的蛋白 多肽在 1Mv载体中成功表达。 维普资讯 http://www.cqvip.com · 74· 现代生物医学进展 Prolmss in Modern Biomedicine 2006 Vo1．6 No．9 3 转基因植物生产药用蛋白的应用研究 最早的转基因植物药物是 1988年比利时 PGS公司在烟草 中研制出的一种神经肽。1989年美国 Scripps研究所分别克隆 抗体的重链和轻链基因并转入烟草中，然后使两种转基因烟 草杂交，在子代烟草叶片中产生了大量的抗体蛋白，开创了利 用转基因植物生产药用蛋白的新时代。目前，世界范围内估 计已有 100多种药用蛋白质和多肽在植物中得到成功表达，它 主要集中在疫苗、抗体及其片段、细胞因子及生物活性肽。 3．1 转基因植物在疫苗中的应用研究 转基因植物疫苗(transgenic plant vaccine)或植物疫苗(plant — based vaccine)是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结 合，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。动物实验表 明，转基因植物疫苗具有口服免疫原性，可以直接食用，所表 达的抗原递呈到动物肠道淋巴相关组织(gut—associated lym． plold tissues，GALT)，能被其表面特异受体特别是 M细胞所识 别，产生粘膜和体液免疫反应‘3 J。转基因植物表达 的抗原蛋 白经纯化后仍保留免疫学活性，注射入动物体内能产生特异 性抗体。已报道的转基 因植物疫苗大致可分为 4类：即细菌 疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗、其他疫苗等(见表 1)。 表 1 转基因植物生产的疫苗 Tab1e1 The vaccines produced bytransgeiaic plants 目前，转基因植物疫苗以其独具的特色 一可食(饲)性正 在成为当前基因工程疫苗研究的热点之一。植物细胞壁作为 天然的生物胶囊可使疫苗不会被酶破坏，通过机体肠道粘膜 分泌 IgA，激发特异性免疫应答，使人体获得持久的抗病能力。 番茄、胡萝 卜、香蕉等食用植物被认为是理想的疫苗传递系 统，通过食用这些植物果实来达到防病的 El的。对于那些不 宜直接食用的植物疫苗来说 ，注射疫苗的可行性研究则是转 基因植物疫苗的另一主要研究方向。转基因植物疫苗不仅保 持了重组蛋白的理化特性和生物活性 ，而且改变了传统的生 产方式和接种手段，疫苗重组蛋白基因可长期贮存在种子中， 无需经过加工提纯和冷藏保存 ，大幅度降低了疫苗的生产成 本，具有潜在的巨大社会意义和经济效益。 3．2 转基因植物在抗体及其片段中的应用研究 “植物抗体”(plantibody)是指人或动物抗体基因或基因片 段在转基因植物中表达的免疫性产物，它的一大优势是能将 全长重链和轻链组装成带有 Fc区域的全抗体[3oJ，这些抗体能 功能性地识别抗原并结合抗原 ，而大肠杆菌能组装的最大抗 体片段为单价 Fab片段，酵母表达体系则由于酵母对多肽的 糖基化作用与哺乳动物细胞的修饰情况不同而影响了抗体的 ACDC(依赖抗体的补体介导的细胞毒性)效力。自1989年美 国医学生物学家 I-liatt等首次证明转基因植物中可以生产功能 性抗体以来 ，已有不同类型的抗体如 IgG、IgA、IgG／IgA嵌合抗 体、Fab和 scFv等抗体功能片段在烟草、马铃薯、玉米、大豆、水 稻、小麦或拟南芥的叶片、根、块茎和种子等器官中表达 ，其中 一 些已运用于人和动物(表 2)。Ma等‘3lJ用烟草表达识别变 异链球菌细胞表面蛋白的植物抗体分泌型二聚体 IgA／G(slgA ／G)，用于治疗龋病，防止变异链球菌定居 口腔，El前已被作为 牙膏的一种成分，进入二期临床试验。 表2 转基因植物生产的抗体 Table 2 Th e antibodies produced bytransgenic plant~ 3．3 转基因植物在蛋白质多肽药物中的应用研究 El前 ，转基因植物或重组病毒在植物中表达可以生产的 药用蛋白有人胰岛素、免疫球蛋白、红细胞生长素、干扰素、尿 激酶 、人生长激素脑啡肽、人表皮生长因子、人红细胞生成素、 粒细胞 一巨噬细胞集落刺激因子、人血红蛋白等[37—31(表 3)。 维普资讯 http://www.cqvip.com 现代生物医学进展 Prok,ress in Modern Biomedicine 2006 Vo1．6 No．9 ·75· 葡萄糖脑苷脂酶(hGC)是治疗遗传病高歇斯症(Gausher dis— ease)的特效药，是当今世界最昂贵的药物之一，美国 Vi晒曲 Polytechnic Institute(VPI)已把克隆出 hGC的基因经改造后成功 地导人烟草并得到表达，一株转基因植株的产酶量相当于 2000—8000个胎盘生产出的药物[37 J。抗生物素蛋 白(avidin) 是一种应用广泛的诊断试剂 ，Hood等[39J在转基因玉米中成功 表达了重组抗生物素蛋白，其表达量 占总可溶性蛋白的2％， 与从鸡蛋清中提取的比较具有相同的功效，而成本却降低了 10倍 ，现在已经成为 Sigma—Aldrich的商品。水蛭素是迄今发 现的最强的凝血酶天然抑制剂，用于治疗血栓的形成。现在 已经在油菜、烟草、拟南芥中表达成功 ，为了降低提取和纯化 成本 ，加拿大学者将种子的油脂体作为在植物中表达蛋白的 载体 ，然后利用油脂体 中所含的油脂蛋 白的亲脂性简化下游 的纯化过程 引。这一方法使得水蛭素在植物成熟收获时才具 有活性 ，也限制了它在环境中的暴露。 表3 转基因植物生产的蛋白质多肽 Table 3 Tile polypeptides and proteins produced bytrao~-enieIdants 蛋白质多肽 植物种类 用途 人葡萄檐脑背』J}}酶 烟草 治疗高歇斯症 人血消白蛋自 马铃薯、烟草 治疗肝硬化 人血红蛋白 烟草 血液代用品 人表皮生长因子 烟草 烧伤修复 人粒细胞 一巨噬细胞 烟草 治疗中性粒细胞减少症 人一B干扰索 烟草 治疗乙、丙型肝炎 A．a-1抗胰蛋白酶 烟草 泛 是 人乳汁蛋白 马铃薯 乳汁蛋白 水蛭索 油菜、拟南芥 凝血酶抑制剂 a天花粉蛋白 栝搂 治疗艾滋病 3．4 生长因子在转基因植物中的表达及其应用 生长因子是～类刺激细胞增殖的多肽类物质，它通过与 特异的、高亲和性的细胞膜上的受体结合而起作用。生长因 子存在于血小板和各种不同的成体和胚胎组织中。生长因子 受体普遍存在，许多细胞表面同时存在一种以上的生长因子 受体。生长因子受体具有蛋白激酶活性，当生长因子作用于 细胞时，通过一系列的信号转导，最终引起细胞内有关增殖基 因的表达，从而发挥其刺激作用。生长因子被用于治疗创伤、 烧伤、骨折愈合、传染病防治及癌症等多种疾病。Gans等在转 基因烟草种子中表达了鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM — CSF)，基因表达和蛋白分析表明 GM—CSF具有种子特异 性，植物源 GM—CSF可引起免疫反应，它的生物活性与人的一 致。人白介素 一2(IL一2)、IL一4和人表皮生长因子(HEGF)、 促红细胞生成素(V20)等已在植物表达系统中得到了表达。 4 存在的问题及对策 虽然利用转基因植物生产药用蛋白的研究已取得了丰硕 的成果，但是要发展成为一个廉价 、高效 、大规模的成熟的生 物反应系统 ，还需解决一系列问题，同时植物生物反应器引起 的生物安全性问题也需要认真对待。 4．1 安全性问题 转基因植物引起的生物安全性问题主要包括转基因后引 发植物致病的可能性，基因漂流至相关物种的可能性 ，演变成 杂草的可能性以及对非靶生物和生态环境的影响。另外，转 基因植物中外源基因编码蛋白是否含有过敏源，是否会发生 转移，非目的基因如启动子，载体骨架序列和基因标记等方面 引起的安全性也引起了人们的广泛重视。 4．2 蛋白表达量低 如何提高药用蛋白在转基因植物中的产量已成为该项技 术的关键，研究表明可以通过以下几个方面来提高外源蛋 白 在植物体内的表达：(1)对密码子进行优化。采用定点诱变法 降低保守序列的 AT含量，增加植物偏爱密码子的含量 ，去除 原序列中影响 mRNA稳定的元件。(2)在构建载体过程中，使 外源基因带上合适的5’端先导序列和 3’端 u 区，如 5’端的 n序列、kozak序列和 3’的 poly(A)序列、切割序列和加工序列 等，以提高转基因表达效率和稳定性。(3)将外源基 因与植物 的特异蛋白基因及其调控序列连接，使重组蛋白在植物中的 表达具有器官或组织特异性以提高外源蛋白的表达量，同时 可以简化蛋白的提取纯化过程。(4)将核基质结合区(MAR) 序列置于目的基因的两侧，构建成 MAR—gene—MAR结构，在 转基因植物的染色质中形成独立的区域 ，而不受周围宿主染 色质顺式调控元件的影响，既可避免外源基因表达的位置效 应影响，又可提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水 平。 总之，如何提高外源蛋白在植物体内的表达量，直接影响 到植物生物产品的纯化等下游IJnq-成本和转基因植物药物的 商业化及产业化进程。虽然目前利用转基因植物生产药用蛋 白还存在诸多亟待解决的技术问题，但随着医药生物技术和 植物基因工程的有机结合和不断深入，转基因植物必将为药 用蛋白的生产提供一条安全 、廉价、高效的生物反应途径，加 快“分子药田”的实现。 参 考 文 献 [1] Daniell H，Streaffield SJ，WycoffK．Medicalmol~ularfmlifing~produe— tion of antibodi~，bicpharmaceuticals and edible vaccines in plants[J]． TrendsPIant Sci，2001，6：219～226 [2] P~'tstein AS，Bade JB，Verwoerd TC，et a1．Stable expression of Phytase (ohyA)in cano|a(Brassica napus)seeds：towards a eonunerci~product [J]．Molecular Breeding，2OO2，10：31～44 [3] ArakawaT，ChongDK，Langridge WH，et a1．Efficacy ofafixxtplant— derived oral cholera toxin B~bunit~dccine[J]．Nature Biotechnology， 1998，16：292～297 [4] Tacket CO，Mason HS．A review of oral vaccination with transgenic veg． etables[J]．Microbes 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