肽含量检测方法—三氯乙酸沉淀法（TCA-NSI）（可溶解小分子含氮物质定量测定） 检测项目 检测方法 三氯乙酸氮溶指数的测定 1．仪器设备1.实验室用样品粉碎机或研钵2.分析筛：孔径0.45mm（40目）3.分析天平：感量0.0001g4.消煮炉或电炉5.滴定管：酸式，10、25mL6.消煮管：250mL。7.凯氏烧瓶：250mL8．离心管9．凯氏蒸馏装置：半微量凯氏定氮装置10．锥形瓶：150、250mL11．容量瓶：100mL12．烧杯：250mL13．台式离心机：定时，调速，转速可达4000转/分14．普通磁力搅拌器15．移液管：25mL16．称样皿：17．电热式恒温烘箱：可控制温度为105±2℃2．试剂1.硫酸：化学纯，含量为98％，无氮；2．混合催化剂：0.4g五水硫酸铜，6g硫酸钾，均为化学纯，磨碎混匀；3．氢氧化钠：化学纯，40％水溶液（m/V）；4．硼酸（GB628）：化学纯，4％水溶液（m/V）；5．混合指示剂：甲基红0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合；6．盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB601制备；盐酸标准溶液：C（HCl）=0.02mol/L。1.67mL盐酸（GB622，分析纯），注入1000mL蒸馏水中7．硫酸铵：分析纯，干燥；8．三氯乙酸：分析纯，10％水溶液（m/V）。9．蔗糖（HG3-1001）：分析纯 三氯乙酸氮溶指数的测定 3．操作方法1.取称样皿一只，250mL烧杯一只，离心试管六只，洗净后置于烘箱中备用。2.粉碎研磨，全部过40目筛，取筛下物约5克置于称样皿中，在105℃的温度下烘干3h，取出，盖好称样皿盖，在干燥器中冷却30min，称重。再同样烘干1h,冷却，称重，直至两次重量之差小于0.002g为恒重。3.称取恒重后的样品m1克（注：样品约2至3克），置于烧杯中，加蒸馏水75mL，室温下电磁搅拌45分钟。将烧杯中溶液及沉淀摇匀，折入离心试管中，离心后收集上清液（1号上清液）。注：离心转速2500转/分钟，离心时间10分钟。4．取1号上清夜25mL，加入25mL10%的三氯乙酸溶液，混合后静置20分钟。将烧杯中溶液及沉淀摇匀，折入离心试管中，离心后收集上清液（2号上清液）。注：离心转速4000转/分钟，离心时间20分钟。5．取2号上清液25mL，小心移入干燥的500mL凯氏烧瓶中，加入混合催化剂6.4g，再加入12mL浓硫酸和数粒玻璃珠，摇匀，将凯氏烧瓶置于电炉上加热，开始小火，待样品焦化、泡沫消失后，再加强火力，直至呈透明的蓝绿色，然后继续加热，至少2h.。待试样消煮液冷却，加入20mL蒸馏水，转人100mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，做为试样分解液。安装好半微量蒸馏装置后，向接收瓶内加入20mL硼酸吸收液及2滴混合指示剂，并使冷凝管下端插入吸收液内，蒸汽发生器的水中应加入甲基红指示剂数滴，硫酸数滴，在蒸馏过程中保持此液为橙红色，否则需补加硫酸。准确移取试样分解液10mL注人蒸馏装置的反应室中，用少量蒸馏水冲洗进样入口，塞好入口玻璃塞，再加10mL氢氧化钠溶液，小心提起玻璃塞使之流入反应室，将玻璃塞塞好，且在入口处加入密封，防止漏气。蒸馏5min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面，再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。6．蒸馏后的吸收液立即用0.02mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。得消耗盐酸标液V1（mL），滴定的结果用空白实验校正。7．另称取样品m2克（约0.5至1克），用步骤5相同的方法定氮，得消耗盐酸标液V2（mL），滴定的结果用空白实验校正。 三氯乙酸氮溶指数的测定 四．计算公式1．三氯乙酸氮溶指数（TCA-NSI）按式（1）计算：TCA-NSI（%）=（（V1-V0）×m2×75）/（（V2-V0）×m1×12.5）×100……(1)式中：m1---测定可溶性氮时称取的试样质量，g;m2---测定总氮时称取的试样质量，g;V0---空白试验消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL;V1---测定可溶性氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL;V2---测定总氮时消耗的盐酸标准滴定溶液体积，mL;2．允许误差每个试样取两平行样进行测定，以算术平均值为结果。两次平行测定结果绝对差值不大于3%。 备注 产品检测前提条件：不含非蛋白氮、游离氨基酸《3%。得到三氯乙酸氮溶指数才精确。 质量部 技术总监 总经理 1．关于富力肽中小肽含量的确定：1．1检测方法：三氯乙酸氮溶指数（TCA—NSI）1．2原理：三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉定蛋白质和较长的肽段。随着酶解反应的进行，蛋白质的肽链逐渐被切成大小不等的片段，三氯乙酸氮溶指数提高。因此，三氯乙酸氮溶指数可以准确地反应蛋白质的酶解情况，溶解指数越高，表明小肽的含量越高。1．3方法：见标准。1．4富力肽中小肽含量的确定：采用上述方法进行检测，可以确定富力肽中的小肽含量。在富力肽的全部蛋白类物质中小肽的含量为≥65%。在富力肽的水溶性蛋白类物质中小肽的含量为≥98%。2．关于富力肽中小肽分子量谱的确定：2．1检测方法：基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI—TOF—MassSpectroscopy）2．2原理：质谱是肽和蛋白质分析的重要工具，这主要归功于一些软电离技术的应用，其中最具代表性的即基质辅助激光解吸附电离（MALDI）。该项技术由于方便、灵敏度高，已成为蛋白质酶解产物中肽段质量谱分析（PeptideMassFingerprinting）的最有效的工具。MALDI—TOF—MS采用有紫外吸收的小分子晶体为基质，将待测物与基质结合。然后用一定波长的激光照射，聚集的能量加热晶体，使基质晶体升华而将非挥发性的待测物释放到气相中。MALDI主要生成待测物的单电荷离子，送入TOF（TimeofFlight）分析仪，测得离子从起始谱到探测端的飞行时间，根据飞行时间的长短确定分子量的大小，从而得到一张完整的蛋白质酶解产物的肽段分子量图谱。2．3富力肽中小肽分子量的确定：MALDI—TOF—MS的检测结果表明，在富力肽的水溶性蛋白类物质中，富含2~6个氨基酸的小肽。肽段的分子量区间为：分子量（Dalton）摩尔百分含量0~1603%161~65087%651~10008%>10002%PAGE1
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