利用噬菌体防治对虾弧菌病的研究

养殖技术 CMt咖一汛gJechn0幻gy 利用噬茵体 对虾弧茵病的研究 周鲜娇1邱德全2 (1．湛江师范学院生命科学与技术学院，广东，湛江524048：2．广东海洋大学水产学院，广东，湛江524025) 摘 要：用副溶血弧菌人工感染凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，以口服和直接浸泡副溶血弧菌 噬茵体两种方式处理对虾，9天内，实验组对虾的死亡率较弧茵对照组低66．7％，实验组对虾的组织器官中 和实验水体中的弧菌含量均远低于弧茵对照组。实验结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明：口服和直接浸泡副溶血弧菌噬菌体方式 均可有效防治对虾弧茵病。 关键词：凡纳滨对虾噬菌体副溶血弧菌弧菌病 近年来，由弧菌尤其是副溶血弧菌，鳗弧菌和溶藻弧菌所引发的弧菌病对对虾养殖业的危害日益严 重。应用抗生素治疗弧菌病虽有一定效果，但会导致耐药菌株的出现以及养殖水体的污染和养殖品种的 品质下降等问题。基于此，人们已经开始探索关于水产动物病菌病的新型治疗方法，如噬菌体治疗。李 太武等用河流弧菌II的噬菌体对皱纹盘鲍脓疱病进行了生物防治的研究。Park等发现给鱼喂食含特异性 噬菌体的食物能有效地清除Pseudomonasplecoglossicida细菌。同样，Nakai等给鱼类口服针对 Lactococcusgarvieae的噬菌体，发现含此噬菌体的食物对实验性感染鱼类有保护作用。在此，本文应 用噬菌体的口服和浸泡两种方式来研究噬菌体对对虾弧菌病的防治，以期为开发该噬菌体作为一种防治 对虾弧菌病的微生物制剂在水产养殖领域的实际应用中提供理论依据。 1材料与方法 1．1实验材料 1．1．1对虾 健康凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，体长10～12cm，取自湛江东海岛奄里虾塘，暂养于广东 海洋大学水产动物病害控制实验室II，海水盐度10，温度28～30℃，pH7．7～8．2。 1．1．2菌株 副溶血弧菌(Vivrioparahaemolyticus)，由广东海洋大学水产动物病害控制实验室II所保存。 1．1．3噬菌体 副溶血弧菌噬菌体，由广东海洋大学病害控制实验室II所保存。 1．1．4培养基 LB固体培养基，LB半固体培养基，LB液体培养基，TcBs琼脂 1．2实验方法 1．2．1噬菌体的制备和纯化 厶口、、／防 万方数据 养殖技术 C“zfHrfng．儿c死nDfDg)， 用双层平板法挑出噬菌体单斑后进行扩大培养。将所得的裂解液以11000r／min(4℃)离心30min，取上清 液，在上清液中分别加入胰DNAI酶与胰RNA酶至终浓度各为1ug／mL，室温放置30min。加入固体氯化钠至 终浓度为1mol／L，冰浴1h后加入固体聚乙二醇(PEG6000)至终浓度10％w／V，放置于4℃冰箱过夜。 11000r／min(4℃)离心20min，回收沉淀，加入灭菌的PBS(0．01m01／L，pH7．0)重悬噬菌体沉淀，加入等体 积的氯仿，上下反复震荡30s，3000r／加in(4℃)离心15min，分离有机相和水相，回收含噬菌体的水相， 用灭菌的0．22um滤膜过滤回收的水相，留滤液，保存于4℃冰箱中，备用。 1．2．2含噬菌体饲料的制备 将饲料(湛江粤海饲料公司)粉碎，过60目筛，按每克饲料加入噬菌体1×109pfu搅拌均匀后，重新压 成颗粒料，37℃于风箱内烘干，命名为PF饲料，4℃保存备用。 1．2．3弧菌的计数 1．2．3．1养殖水体中弧菌的计数 在100ml水样中加入l：2000(吐温一80)1mL，混匀，稀释后涂TCBS琼脂平板计算弧菌数量。 1．2．3．2对虾各个组织中弧菌的计数 将对虾先用吸水纸擦干表面，再用75％酒精擦试表面，然后分离各个组织器官，称重，将其放于灭菌 匀浆器中，加2ml灭菌PBs(0．01m01／L，pH7．o)匀浆，再用灭菌PBS适当稀释后涂TcBs琼脂平板计算弧菌数 量。 1．2．4噬菌体在对虾组织器官中的分布情况 实验分2个实验组，每组用虾16条，A组：投喂正常饲料，即对照组；B组：投喂PF饲料，副溶血弧菌 浸泡感染对虾，使养殖水体中弧菌终浓度为2．5×107cfu／mL。所有实验组投饵1小时后及时吸污，在24h 时采样检测。采用双层平板法测定对虾每克组织器官中所含噬菌体的数量。每组设一个重复。 1．2．5噬菌体对对虾弧菌病的防治 实验分4个实验组，每组用虾16条，A组：投喂正常饲料，即对照组；B组：投喂正常饲料。用副溶血 弧菌浸泡感染对虾，养殖水体中弧菌终浓度为2．5×107cfu／mL，即弧菌对照组；C组：投喂正常饵料，用 副溶血弧菌浸泡感染对虾一天后再用噬菌体浸泡，养殖水体中弧菌终浓度为2．5×107cfu／mL，噬菌体的 终浓度为1．0×106pfu／mL；D组：用副溶血弧菌浸泡感染对虾～天后再投喂PF饲料，养殖水体中弧菌终浓 度为2．5×107cfu／mL。在第1、3、5、7、9d时取样。统计对虾的死亡率和对虾每克组织器官中和实验水 体中的弧菌数量。每组设一个重复。 1．2．6数据处理 采用t检验。 2实验结果 2．1噬菌体在对虾组织器官中的分布情况表l显示A组对虾体内没有噬菌体，B组对虾的鳃、肠道、肌肉和 肝胰腺中检测到噬菌体。 表l 噬菌体在对虾组织中的分布情况 注：表中A组：投喂正常饲料，即对照组，B组：投喂PF饲料，用副溶血弧菌浸泡感染对虾。 26啦尊水燕+}“∽，na}《；l、|{(ji。；{¨ghsilcr{8sN()．i。2007 万方数据 养殖技术 C“zf“rfng^c忍nDfDgy 2．2噬菌体对对虾弧菌病的防治 2．2．1对虾的死亡统计结果 9天内，A组对虾的死亡率为0，B组对虾的死亡率达18．75％，C组和D组对虾的死亡率分别6．25％和6．25％， 均比B组低66．7％，该结果表明口服和浸泡噬菌体对感染弧菌的对虾有一定的保护作用。 不同实验组的对虾的死亡率统计 注：表中A组：投喂正常饲料，即对照组；B组：投喂正常饲料， 正常饵料，用副溶血弧菌浸泡感染对虾同时用噬菌体浸泡：D组： 用副溶血弧菌浸泡感染对虾，即弧菌对照组；c组：投喂 投喂PF饲料，用副溶血弧菌浸泡感染对虾。 2．2．2对虾各个组织器官和养殖水体中弧菌的含量 B组对虾各个组织器官中的弧菌含量最高，其弧菌含量比A组高卜3个数量级，经t检验后差异性显著 (t<0．05)，B组对虾的弧菌含量比C组和D组高卜2个数量级，差异显著(t<0．05)。B组养殖水体中弧菌含量 高达107cfu／mL，与A组差异显著(t<0．05)：B组分别与c组和D组相比较，经t检验后差异性显著(t<0．05)。 此结果说明口服和浸泡噬菌体均可显著降低对虾体内和养殖水体中的弧菌数量，从而能有效地防治对虾 弧菌病。具体数据见(表3)。 3讨论 24小时内副溶血弧菌噬菌体在对虾的鳃、肠道、肌肉和肝胰腺中被检测到，这说明短时期内噬菌体能 够存在于对虾体内，这对对虾体内弧菌的清除起到一定积极的作用，但由于对虾体内环境复杂，所以噬 菌体是否能长时期在对虾体内存活，这还有待进一步的研究。’ 9天内，与弧菌对照组相比较，噬菌体的两种处理方式均可使实验水体的弧菌含量低2—3个数量级；对 虾各组织器官的弧菌含量低卜2个数量级；对虾的死亡率低66．7％。此结果表明噬菌体对副溶血弧菌具有 强烈的捕杀作用，噬菌体通过清除副溶血弧菌从而抑制了弧菌的增殖，大大减少了养殖水体中和对虾体 内的弧菌对对虾的侵袭，这既有利于染病对虾及时恢复健康，又减少了健康对虾染病的机率。但当实验 组水体中的弧菌含量减少到103cfu／mL时，水中弧菌含量基本不下降，其原因主要是因为噬菌体浸染具有 高度的特异性，这一现象也说明噬菌体防治细菌病无法像抗生素一样广谱抗菌，这也是噬菌体治疗细菌 病的一大缺陷所在，但若能找到宽谱噬菌体或者多种病原菌的噬菌体，且这些噬菌体能够共存，那么在 水产养殖业方面，用噬菌体替代抗生素来防治有害病菌病将会应运而生。 表3 对虾各个组织器官中弧菌的含量(cfu／g)和实验水体中弧菌的含量(cfu／mL) ，|尊水舞JourllalofBe{．i{ngF{sheriesNo．1，20()727 万方数据 l 1．23×1047．21×1053。66×1052．42×105 3 1．35×1011．20×1066．27×1041．99×lOs 鲥 5 1．66×1041．19×1065．12×10t1．13×lOs 17 1．78×1042．67×1062．05×1049．48×10n ! !：!!荃1012．70×1066．16×1047．85×10a———————————————————————-=—二二二．：：：：：：：： ：：：：：：：： l 7．17×1041．90×1064．32×1059．13×105 1 1：!!兰1059．56×1054．89×1048．56×lo。 ———————————————————————-二二二二二二=_一一一：：：：：：：： ：：：：：：：： 1 8．67×1023．48×1051．89×1051．63×105 3 6．64×1025．53×1051．14×1053．19×104 肌肉 5 6．98×1029．85×1041．19×10t7．85×10。 7 1．98×1039．28×1012．94×1047．02×104 1 1：!!荃1031．19×1052．78×104l-23×104———————————————————————二二二二二■一—=：：：：：： ：：：：：：：： 1 1．40×1034．66×1054．74×1053．46×105 3 1．08×1039．63×1052．26×1054．13×105 肝胰腺 5 3．16×1031．10×1051．36×10。 2．09×104 7 1．57×1033．21×1057．96×1039．35×103 1 1：!!圣1032．73×1056．25×1038．80×103———————————————————————二二二二：：：：：：：：：：：：：：：： 1 O 1．29×104 O n 兰 o 2．70×1048．20×102 o ————————————————·—————二二二二二二一一=：：：：：：： ： 1 9．10×1031．OO×1071．36×1062．4l×106 3 3．23×1031．7l×1078．60×1052．18×106 水 5 4．50×1031．19×1077．79×1031．00×10t 7 2．78×1035．67×1062．60×1038．62×104 ： !：!!兰1032．70×1061．23×1034．89×loa———————————————————————=二二二=_一：：：：：：：： ：：：：：：：： 注：表中A组：投喂正常饲料，即对照组：B组：投喂正常饲料， 正常饵料，用副溶血弧菌浸泡感染对虾同时用噬菌体浸泡：D组： 28掣霉棼。茬．hiIrIlaIoff；oiJjnsFisjlerios并(J．1．2007 用副溶血弧菌浸泡感染对虾，即弧茵对照组；c组：投喂 投喂PF饲料，用副溶血弧菌浸泡感染对虾。 铲舻铲 l 1 l × × × 2 8 O 9 7 6 l 1 9舻旷铲 l l l × × × 9 2 8 7 6 7 4 4 5舻舻旷 l l l × × × O 6 3 2 3 0 9 3 8铲舻舻 1 1 l × × ×∞鹃舛 8 1 6 3 5 7 道肠 O O 0O o o瞅53舻旷印 I 1 l × × × O 8 7 2 5 6 1 2 2 O O O 3 5 7 窦心围 万方数据 利用噬菌体防治对虾弧菌病的研究 作者： 周鲜娇， 邱德全 作者单位： 周鲜娇(湛江师范学院生命科学与技术学院,广东,湛江,524048)， 邱德全(广东海洋大学水 产学院,广东,湛江,524025) 刊名： 北京水产 英文刊名： JOURNAL OF BEIJING FISHERIES 年，卷(期)： 2007(1) 被引用次数： 2次 引证文献(2条) 1.刘文珍 水产养殖中微生物的应用及研究进展[期刊论文]-水产科学 2010(1) 2.柏仕杰.邱德全.贺美 无菌人工养殖海水中副溶血弧菌噬菌体与宿主的消长动态[期刊论文]-广东海洋大学学报 2008(4) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_bjsc200701009.aspx