烷基糖苷与生物膜的相互作用及其溶血活性

烷基糖苷与生物膜的相互作用及其溶血活性 研 津 梅 2 2 300122) (天津市界面与胶体科学研究所，天津市 i ^ c 丁 摘 要 ：考察了十二烷基葡糖苷和十六烷基葡糖苷的溶血活性 发现由脂肪和糖缩台而成的糖苷物比橐 氧乙烯类非离子表面活性剂对生物膜有更高的吸附和渗透能力。这种相互作用导致生物膜增溶和渗透性改变 ， 井诱导血红蛋白释出。烷基培苷诱导的溶血过程极快 ，几乎搜有明显诱导期。在十六烷基糖 苷胺团从球就向棒 状转变浓度区还出现了第二溶血过程．无毒而高溶血活性的烷基糖 苷可能用于制药和化妆品工业改变药物动 力学蓄 鎏 遒 表面。盘1 叁 f 拓， 关簟调：竺茎堕重生塑 l一翌 至兰 咿0 1‘ I J J ， Abslract{M止 ani t L ation on haemo]ysls active of[aury]g]uc ide and hexedeey]glucoside．Discow ering that the g]ucoside condensed by[atty and sugar have higher adsorption and permeahi[ity．This interacthan lead to increasing hiomemhrane disso]ve a change of permeability and a haemog[ohin release．Haeroo[ysis process induced by a]kyl g]ucoside is very hst without ahvious induction period．These is second haLmoLysis pr~ ess in the con~entation丑r from spherica[mieette幻 atlck m[ce1]e of hexadecyt g]ucoside．Alkyl g】ucoside without poi— son and with high haemelysis active can he used to change the dynamics process of effective mat r and raise the skin absorption m the medicine and cosmetic hadustry Keywords：glueo~ide，hiomenbrane．heemolysis active 1 引言 表面活性剂与生物膜的相互作用使其诱 导的溶血历程不同于渗透溶血历程。这种特 殊作用决定它们在制药工业中的应用价值， 因之已有不少研究。一些 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 指出表面活性 剂的溶血活性取决于疏水基和亲水基的性 质[ 。离子型表面活性剂的电性及其化合 价同红血球表面电荷联结相关，因而影响十 分显著[“ 。对聚氧乙烯类非离子表面活性剂 则发现它们的临界胶团浓度(cmc)和亲水亲 油平衡(HLB)与溶血活性间存在粗略相关 性0 ]，膜脂主要成分胆 固醇的非离子衍生 物性能也有详尽考察[ ]。糖苷类也是生命 过程中有重要作用的物质，而烷基葡糖苷作 为一种新兴的表面活性搅在溶血活性方面尚 未见报导。本文考察了两种典型糖苷——月 桂基葡糖苷和棕榈基葡糖苷的溶血活性 ，并 与氧乙烯类非离子和磺酸盐型阴离子作了对 比。 2 实验 2．1 物质 十二烷基葡颓苷(1)和十六烷基葡糖苷 (I)用 直 接 法 合 成_I 。 I含 C APG 92．73 ，平均聚 合度 2．35，平均 分子量 567．5，十二醇 6．46 ，游离糖 O．81 }I含 C APG95．79 ，平均聚合度 2．74，平均分 子量687．0，十六醇3．63 ，蝣离糖 0．58 。 其它物质均为试剂级，水为去离子后双 蒸处理，红血球悬浮液从新鲜兔血制取。血液 用生理盐水稀释并在 i000 g下离心 20分 钟，再 用缓 冲液 洗涤离 心两 次，然后配 成 10 V，V红血球悬浮液。用显微计数器测定 b 维普资讯 http://www.cqvip.com 浓度为 4．3×10 细胞／era 2．2 方法 等体积的表面活性剂溶液和红血球悬浮 液在 37土1℃恒温水浴 中振荡反应，改变浓 度和溶血作用时间。结束时离心提取上层清 液，在 510mm 测定所释放血红蛋 白的吸收 度。以1O v／v Triton X一100溶液的溶血作 用为参照值 。 表面活性剂的临界胶团浓度和吸附量用 滴体积法和Gibbs方程确定。HLB由Griffin 实验测定。 2．3 仪器 722光栅分光光度计、离心机、显徽计数 装置和恒温装置 3 结果与讨论 溶血作用由下式定义 ： 溶 血 100(A—A。)／(A 一A。) (1) 式中，A是表面活性剂处理红血球悬浮液后 的吸收度，A。和 A 分别是用缓冲溶液 (生理 盐水 )和 Triton X一100溶液 处理后 的吸收 度。 图1是 APG溶血作用的时间过程。由图 可 见中链和长链 APG 均有很强的溶血活 性 在 1．4×10 表面活性剂分子／细胞情况 下。C APG经 7～8分钟 ，C APG经 9～10 分钟分别达到溶血平衡值，诱导期极短。通常 认为生物膜是球形蛋白和脂质二维排列的准 流体，表面活性剂诱导的溶血作用包括不同 的阶段：a．表面活性分子扩散吸附到细胞膜 表面．b．对脂类双层的渗透}c．由侧面渗滤形 成混合胶团Id．生物膜离解扩散_e_血红蛋白 渗滤析出。诱导期则反映表面活性分子在膜 表面吸附、渗透脂双层和对膜结构初始微拢 的历程 在以前的研究中表面活性剂溶血作 用与细胞浓度近似遵循一级反应动力学关 系[1 。根据 图1特征 ，我们也假定 APG诱导 4 蹬溶血过程是准一级反应，则有 ： 一 ： k．aN 【2) 式中 N『是 t时的细胞浓度，ka是表观反应 速率常数。对 t积分后可得 ： lu(N ／N ) 一k肚 (3) 存在诱导期 r，t>r时 In(N ／N。)=一h (t—r) (3a) r> t> 0时 In(N1／N。)：0 (3b) 用 log(N ／N。)对 t作图(图 2)，近似遵 循前假定一级动力学关系。反应过程为一直 线，其斜率代表表观反应速率常数 Ka而截 距表示诱导期 r 由图 2可求出c 。APG和 C1 6APG 的诱 导 期 分 别 为 1．85和 1．80 Emin]，Ka分别为 9．0×10”细胞／L·rain和 1．25×10“细胞／L·rain。不同寻常的是 c 6 APG出现了第二溶血反应，该反应历程发生 在 8O～120分钟之间 由动力学关系，溶血作用或与细胞膜的 相互作用均应是表面活性剂浓度的函数。图 3是浓度与溶血百分率的关系曲线 。表面活 性剂诱导溶血是一个复杂过程而有别于一般 疏水物表面的吸附，但在初始阶段则有类似 之处．表面活性分子在细胞膜表面定向吸附 是产生溶血作用的前提。由Thron方程： c。= a N+b (4) 式 中c 是 x 溶血率时表面活性剂总 浓度{a 和b。分别是该时表面活性剂在细胞 吸附值和游离浓度。随表面活性剂浓度的增 加，溶血作用迅速增加并达到一个平衡值 该 曲线的斜率是溶血活性的度量而与细胞浓度 无关。图中 C APG和 C APG的斜率要 比 作为参照的c12~ps大一些。但溶血过程是一 个非平衡过程 在--1ogC4~2 5浓度区域短 暂平衡之后，c APG和C 均出现了第二 溶血过程。由于是以 l0％Triton X一100溶血 作用作为参照系，溶血翠超过 100，显示超出 一 般的强溶血活性，是合理的。难以解释的是 维普资讯 http://www.cqvip.com 第二溶血过程与结构间的关系 由于 c z APG没有发现第二溶血过程，显然无法用球 形胶团向棒状胶团转变来解释。第一溶血平 衡点的顺序是 C APG>Cl z >c sAPG， cmc的顺序是 C1卿s>cl APG~C1 zAPG(C1 B APG的聚合度>c． APG)，两者也不相符。 图 1 烷基葡糖苷溶血作用的时间过程 图 2 烷基葡糖苷溶血反应特征 图 3 烷基葡糖昔浓度与培血百分率的关系 参照图 2，C APG在一段时间溶血平衡后又 出现第二溶血反应与此一致，应认为该行为 是由结构特征决定的 由图 3和方程(4)，可导出不产生溶血作 用表面活性剂最大吸附值 a。。C APG、c APG 和 c s的 a。值分别为 1．31X10 、 0．52×10 、0．31×10 分子／细胞。根据红血 球细胞约含有 5 X 10 个脂类分子的观点 。 在 a。状态下吸附在脂类分子上的 C zAPG、 C： APG和 c s分 子 的平 均 数 分 别 为 0．26，0．104和 0．061，也即脂类分子和表面 活性剂摩尔比分别为3．8、9．6和 16．4。而在 饱和吸附时三者平均数分别为 0．93，0．28和 0．38，摩尔比分别为 1．1，3．6和 2．6 用表面化学方法测得 c APG、C APG 和 c s吸附注分子占有面积分别是 43．1， 71．3和62．1A 由红血球细胞表面积约 1． 6×10 A 的模型口 ，在 C-zAPG溶血平衡时 若根据单分子模型计算，此时细胞与其释出 物表面积之和已比原细胞增加了 25 。说明 分布于膜内双层的板块有序结构区已部分解 体，血红蛋白释出，其连镇反应使原以疏水力 与蛋白相结合的脂类与糖类也开始释出，细 胞膜产生缺损。C APG和 C 卿s在此显示出 较 c APG更强的溶血活性，在吸附面积与 红血球总表面积之 比分别少于 0．62和 0．73 时已有血红蛋自释出。在浓度进一步增加时 又出现第二溶血过程。此时若仍以单分子膜 模型计算总表面积 已分别增加了 14倍和 1O 倍，表示细胞膜已基本解体。结合图2，随浓 度或时间增加而产生第二溶血过程。作者推 测曲线平直部分显示了，表面活性剂自细胞 内部的渗滤过程 ，而第二溶血过程已非单一 表面作用 C APG溶血活性强于 C APG也表明 cmc较大的表面活性剂是 较强的溶 血活性 剂，也以前研究结果相一致。在分子膜上的吸 5 维普资讯 http://www.cqvip.com 附与渗滤再一显著特点就是与 HLB密切相 关。 在生物膜表面吸附和渗滤既取决于疏水 基又取决于亲水基的性质 ，两者的平衡 自然 也至关重要。以前的试验已证明过于亲水或 过于亲油的表面活性剂都不是好的溶血剂。 根据 生物膜 、疏水基和亲 水基 的种类，最适 HLB在 12 5～17．0范围。参照表 1．试验物 C APG和 C APG的 HLB分别为 13 5和 13．8，均有合适的亲水亲油平衡性能是两者 均有高溶血活性的原因之一。但 APG溶血 活性远高于相同 HLB范围的聚氧乙烯类非 离子表面活性物的文献值，甚至高浓度通常 作为参照系的 Triton x一1OO，显然是 由它们 的结构决定的 生物膜 由蛋白质、脂类和糖类 构成 在红血球中三者比例分别为 49，43和 8 。蛋白质的特征为水不溶性，脂类主要是 磷脂和胆甾醇。由脂肪和糖合成的 APG与 生物膜构成相近 ，可能是表现超乎寻常溶血 活性的重要原因。APG溶血反应速率常数与 生物膜 组成之一 胆 甾醇 的聚氧 乙烯 醚系 列n 相较显著为高，说明疏水基础和亲水基 的作用都十分关键 较长的棕榈基比月桂基 与胆甾醇和磷脂的物性更为接近 ，与疏水蛋 白也更易结合，故 C APG 的溶血活性又高 于 C APG。适宜的疏水基和亲水基类型及 两者 间合理平衡，使之不仅在生物膜较强吸 附而且较迅速的渗滤 ，导致强溶血活性以及 可能标志生物膜基本解离的第二溶血过程。 表 1 试验袖的袖化性质 ～ ＼ c APG C】‘APG l C】 crftc[mo／1] 2．4×10一 7．8×10一 I1．9×10一 P(0，0lm)[mN／m] 29 5‘ 32．8 1 35．8 r[10 rnl／cm ] 8．85 2 33 2 68 A[A。] 48．1 71．3 l 62．I HLB 18 5 13，8 l 9．4 4 结 论 与生物膜物性接近的亲水基与疏水基组 合及二者的适当平衡 ，是试验 C。：APG和 C。 APG表现出超乎寻常溶血活性的重要原因 结果表明由脂和糖组成的 APG是好的溶血 活性剂 与胆甾醇和磷脂物性更为接近的中 长链糖苷显示 出更强的吸附、渗滤和透过能 力并导致 了第二溶血过程。无毒低刺激的先 天优势、极短的诱导期、极快的溶血反应速率 和强度都展示 APG在改变药物动力学和增 强经皮吸收方面的重要用途 APG与生物膜 的强烈相互作用还关联着更多的生命问题如 物质转运、生物能转换、遗传信息传递、激素 作用、细胞免疫和识别等。更系统的研究将揭 示更多的物性规律 参 考 文 献 1 Helenlus A ，K．Simans，Biochim Biophys Acta 1975， 415，29． 2 Bor~all RW ，S．Hunt．Biochim Biophys Acta 1971，249， 265． 8 laslavsky 13．Y，N N Dssipov，S．V．RogoTAain，Biochim Biophys Acta 1978，51O，151l1979，556，814 4 Lowe P．J．，R Coleman，Bioehlm Biophys Acta 1981， 640．56 5 Kondo T．，Adv．Ccllok]Interface Sei 1976．67189 6 Ossipov N-N ，B．Y．Zaslavsky，S．V．Rogozhin．Colloid ＆Polymer Sci 1978．286，1105． 7 Kondo T ．M．Tomlzawa，J．Pharm．Sei．1968，57．1246． 8 Zaslavsky B．Y．t etal，Biochim Biophys Acta．1978， 50721 g Miyajirt~ K·T．Lee．M．Nakagaki，Chem．Pharm Bul1． I984，327，8670 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