豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中的表达(可编辑)

豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中的表达(可编辑) 豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中的表达 犬学 了大罄 一一 硕士学位论文 题目亘壁渣拴醒基固查墨酸扛萱主的塞鲨 作者 岜菱 完成日期鲤年』月一日 专.乳酸菌表达系统中的载体 ,食品级系统的定义和特点??.“. .乳酸杆菌基因表达系统特点.乳酸菌基因表达系统展望””?“” 参考文献??” 致谢?”??” 图形目录 图 载体物理图谱... 图 ?载体物理图谱??...?..图载体物理图谱? 图乳酸杆菌乳糖突变菌株和溶栓酶基浏工程菌构建流程图??” 图 和的产物? 图质粒/的验证 图质粒和的构建示意图图 平板的鉴定结果??.....??” 图乳酸杆菌乳糖缺陷突变株的验证??...图豆豉溶栓酶基因整合型表达质粒 的构建... 图质粒的酶切鉴定... 图 整合豆豉溶栓酶基因的鉴定 图豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中表达产物的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ? 图乳酸杆菌复制型表达质粒构建示意图 图乳酸杆菌乳糖操纵子结构示意图 表格目录 表实验用菌株和质粒.... 文献综述 表用于基因表达的乳酸菌 表乳酸菌糖诱导表达系统阳川大学硕.【:学位论文 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在张义正导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得四川大学或其 他 教育机构的学位或证 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 而使用过的材料。与我一起工作的同志对本研究所做 的 仕何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川大学读书期间在张义正导师指导下取得的,论 文成果归四川大学所有,特此声明。 涨文如 导 师: 硕士生:唷祆 年月四川人学颀学位论文 豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中的表达 专业: 生物化学与分子生物学 硕士生:肖薇 指导教:张义正教授 摘要 乳酸菌 ,是食品微生物的重要成员. 由于它对人和动物健康有益,因此它在食品及医药工程领域具有重要 应用前景。乳酸菌中存在大量染色体外的遗传物质,为其克隆载体系 统的发展提供了极好的材料。近多年来,随着乳酸菌内源性质粒的 去除和电穿孔技术的建立以及乳酸菌中表达信号的分离,已建立和发 展了一系列具有不同用途的乳酸菌载体和受体系统。这些载体包括克 隆载体、整合载体及表达载体,而食品级基因表达载体的研究则是近 年来该领域的前沿和热点。食品级表达载体利用食品级的选择标记替 代了传统的抗生素抗性选择标记,这就避免了将抗生素抗性基因投放 到环境中或入和动物体内。因此,乳酸菌食品级载体的研究与开发具 有重要意义。 本研究以基因为选择标记,构建了乳酸杆菌食品级表达系统。 并进而实现了豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中的表达。首先以 为出发载体,构建了含有 乳糖操纵子 和片段的整合型表达载体。利用聚合酶消 位点,构建了基因编码区移码 除中基因的 中。通过与 突变的质粒,并将其电导入. 厶 乳糖操纵子之间的同源双交换,筛选到了基 因突变的受体菌株 ,并经和表型所 验证。利用乳酸杆菌乳糖操纵子基因启动子构建了自主复制型载体 。将豆豉溶栓酶不同肽段编码序列分别插入到整合型载 共构建了个豆豉溶拴酶基因的表达质粒。 体和复制型表达载体中, ,将重组表达质粒含豆豉溶栓酶成熟肽编码序列电转 化 后,筛选到所需的菌株。分析结果显示,大学硕士学位论文 豆豉溶栓酶基因已经整合到. 染色体中,?表型也得 到恢复。表明.中基因的功能能被质粒 上的基因互补。.经.%孚糖过夜 诱导后,.电泳显示成功表达了大小的豆豉溶栓酶蛋 白。 基因表 关键词乳酸杆菌基因突变体豆豉溶栓酶基因 达四川大学硕:学位论文 : : :. . ,.. 也 . ,,. :、 . , ? , 班 . , . . . .‘ . .. . 型坐查兰堡圭兰些堡壅 ??一.. . .?唱 工.甜“. ..% . 』。驯川大学硕士学位论文 引言 乳酸菌 是一类在食品中应用最广泛 的重要工业菌株,它包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。 这类菌种在防治食物腐败、提高免疫力以及改善风味等方面有重要作 用。与大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌相比,乳酸菌分子遗传学的研究 起步较晚,对其基因转录和翻译的调控及蛋白质分泌的机制还不甚了 解。最近多年来,乳酸菌分子生物学研究取得长足进步。随着乳酸 菌各类表达调控元件的分离,相继发展了一批适用于乳酸菌的克隆载 体、表达载体、整合载体,而乳酸菌食品级高效表达系统的构建及应 用则是该领域研究的前沿和热点阁。食品级载体应用食品级的选择标 记代替了传统的选择标记,避免了抗生素的转移所带来的生物安全性 问题。用于乳酸菌食品级表达系统的选择性标记基因主要有类川:糖 类利用标记基因、营养缺陷型标记和编码细菌素抗性或免疫性的标 记。 乳酸菌食品级基因表达系统必须具备如下基本条件:载体必 须是食品级的,不得含有非食品级功能性片段。例如载体 产 含有一个埘瑾因 基因是约氏乳酸杆菌 生的 的免疫基因,将含有‘矿,基因的质粒转化 到发酵乳杆菌后,可用加入 的培养基选择转化 子。表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物, 如乳酸球菌、乳酸杆菌及其它已在食品工业中得到长期而广泛应用的 菌株。此外,食品级系统的宿主菌在生产状况下,在食品中和进入人的 肠胃及消化道后必须是足够稳定的。诱导物必须是食品级的,如 乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳链菌肽等可被人食用的物质。目前,乳 糖操纵子是研究得最为清楚的乳球菌操纵子,已从分子水平上阐明了 乳糖利用的控制机制。它的启动子不受乳糖分解代谢物阻遏, 而受自我调节的阻遏物控制。乳糖的诱导作用是通过乳糖分解 代谢的中间物塔格糖磷酸激活阻遏物实现的。已用启 动子【删和启动子与费氏弧菌荧光素酶基因进行融合【, 经体内生物发光测定而得到证实。目前,已成功建立多种可在乳酸菌 列大学硕上学位论文 中使用的食品级标记基因,所有这些标记基因都来源于乳酸菌或在食 品中有长期安全使用史的细菌。把这些标记基因整合到乳酸菌来源的 多拷贝质粒中,可建立起食品级载体。目前已在这样的系统中表达了 多种基因,其表达产物对工业和医药业具有重要的意义.例如:在 .中成功表达了来自解淀粉芽孢杆菌的一淀粉酶基因,其酶活 上 达到.几,为淀粉酶到乙醇的转化研究莫定了基础。在.也 成功表达了基因【。人绒毛膜促性腺激素是人滋养细胞分泌的 妊娠特有激素,其作用是维持并刺激黄体产生孕酮,促进脱膜细胞发 育成熟,因此,人绒毛膜促性腺激素可作为避孕疫苗的抗原靶,人绒 毛膜促性腺激素疫苗是第个进入临床试验的避孕疫苗,其中 ’印度构建的.疫苗以进入临床期试验。然而,即 使是.疫苗,仅能使约%的受试妇女抗体水平达到避孕阀 值,因此,还需寻找更好的免疫方法及免疫途径来提高避孕疫苗的抗 生育效力。乳酸杆菌是哺乳动物肠道、阴道粘膜的常驻寄生菌,在局 部发挥拮抗病原菌的作用】。利用乳酸杆菌作为疫苗载体,携带表 达流感病毒溶血素与一葡萄糖苷酶融合蛋白,通过粘膜免疫动物, 可诱发抗感染免疫吲。由于妊娠主要在生殖道粘膜部位,根据共同粘 膜免疫机制,用表达避孕疫苗的乳酸杆菌在呼吸道、消化道、阴道免 疫,将会在生殖道粘膜诱导产生高滴度的抗体而发挥抗生育作用。 血栓性疾病是当前危害人类健康,导致死亡率最高的病因之一,如 心肌梗塞、脑血管血栓形成、脑栓塞、肺栓塞等。血栓类疾病如急性 心肌梗塞 ,、脑血栓及静脉血栓塞 等。而且血栓形成又是许多疾病发病机 制中涉及的重要病理过程,如肾小球肾炎、糖尿病小血管病变、严重 烧伤中局部病变的恶化、视网膜静脉血栓形成等【】,因此血栓类疾病 已成为致死率极高的疾病之一。目前治疗血栓病的主要方法就是溶栓 疗法,即注射溶栓剂使血管再通,这种方法的优点是治疗后周内死 亡率较低。因此研究高效的溶栓药物在临床上具有重要意义。现今临 床上已正式批准使用和试用的溶栓剂有:组织型纤溶酶激活剂、 四川人学硕士学位论文 尿激酶原、重组、对一甲氧苯甲酚纤溶酶原链激酶激 组合突 活剂复合物、重组型葡萄球菌激酶汛、和. 变体等。目前国际上正在致力于开发第代溶栓剂,它包 括、.。、和等基因工程产品以及正 在研制的新型溶栓剂如纳豆激酶、豆豉溶栓酶等。它们基本具备: 下 特点:溶栓能力强,出血副作用小,在血液中的半衰期长,总使用剂 量少,治疗费用低等。本实验室目前已经在枯草杆菌、大肠杆菌闱 以及毕赤酵母【】中成功表达了豆豉溶栓酶基因,并且张仁怀博士通过 动物实验已经证明了此酶口服后是安全的,并且对血栓性疾病具有一 定作用。乳酸菌食品级基因表达系统中的载体、受体及诱导物均为食 品级,可直接制成口服制剂,免去一般基因工程菌所需的繁琐、复杂的 后提取 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 ,为基因工程生产安全、廉价的生物制品开辟新途径。又 因乳酸菌可粘附在肠道表面持续作用,因此实现豆豉溶栓酶基因在乳 酸杆菌中的表达有重要的意义。 四川大学硕:学位论文 材料与方法 .菌种和质粒 本研究所使用的细菌菌株和质粒载体见表,载体、、 图谱见图一图 袭实验用菌株和质粒 菌种和质粒 曹种 ? 最 ? 基因克隆 本实验室 ’帅 他 】 甜 野生型菌株 基因表达 质粒 突变体的构建 .,州,咖 . 克隆载体 .,‘ 自主复制克隆载体 ..晦 提供豆豉溶栓酶熟 本实验室 ., 肽的的编码序列 提供豆豉溶检酶成 熟肽和前肽的编码 本实验宣 .,。 序列 提供豆豉溶栓酶成 熟肽、前肽和信号肽 本实验室 ., ‘的编码序列 四川大学硕士学位论文 ..质粒载体 ... :. ‘‘用于缺失突变株的构建,含有. 的复制起点,具有多克隆位点区,其物理图谱见图。 图:载体图谱 ...研究中所用质粒载体?是一种高效克隆产物 的专用载体,用于克隆扩增得到的产物,购自宝生物 公司,其物理图谱见图。 删 翱 跚钉 朋 砌? 』 翩??一 ? 矗州 ? 枷 硫 日 翩 ? 艟 哺? ?? 。拿鹫霉%肇吐垒驾拳骂害鸳毒叫譬星骂;丝驾 肌啪盯?四箕舶耵盯抓泓镰耵盯?供?铫翻枞 ?下垤嗡相啦 ???口? 口? 一??口协口口口,? ‘?曲 黼鞠略 载体的物理图谱 图: 四川人学硕士学位论文 ... :. ‘‘?,江乞穿梭载体图 为终止子,为复制子,其物理图谱见图。 图 载体图谱 .培养基汹 .. 培养基 胰蛋白胨 酵母粉 用/调到. 固体培养基在相应的液体培养基中加入.%琼脂粉 四川大学硕:.学位论文 .. 培养基 胰蛋白胨 ? 酵母粉 . 用 /调整到.?. ×” . . . . .. 培养基 / .. 培养基 蛋白胨 . 酵母粉 . 吐温. . . . 乙酸钠 . 葡萄糖 . 柠檬酸三铵 牛肉膏 . .. . .. 溴甲酚紫 . 酵母粉 . 乳糖 . 蛋白胨 四川大学硕二学位论文 .溶液和缓冲液【】 ..溶液 . %,/.,/ ..溶液 % ..溶液? / . ..缓冲液 / .,/ . .. 缓冲液 ? 中,加浓盐酸调节值后,加 将溶解于 ’ 定容至. .. 裂解缓冲液 裂解缓冲液.%,// . ..溶菌液 . / ? .,%聚乙二醇,/溶菌 酶 ../蔗糖,/ ,/ ..分子克隆工具酶及重要生化试剂 限制性内切酶、、蛋白酶、连接酶、聚 聚合酶购自公司。 合酶、酶购自公司, 其它试剂为国产分析纯 ..聚丙烯酰胺凝胶电泳用各种相关溶液阁 ,一亚甲双丙烯酰 %丙烯酰胺凝胶贮液:丙烯酰胺, 胺.. 。 .:.拓碱溶解于水中,用的 。 盐酸调.,定容到,再加.叫川人学硕士学位论文 ?/ 碱溶解于水中,用的 .:. 。 盐酸调.,定容到,再加. 样品缓冲液: ,?巯基 ?/., 乙醇,.%溴酚兰,甘油,加蒸馏水定容到。 电极缓冲液:. 碱,.甘氨酸,. , 固定液:%甲醇,%冰醋酸 染色液:.%/考马斯亮蓝.,%甲醇,%冰醋酸 脱色液:%冰醋酸,%甲醇 .实验方法 以下各种操作技术,除特别注明出处外,均采用本实验室 ’ 已经 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化的研究方法. .乳酸杆菌的提取方法【 将培养过夜的细菌约’,/离心,用. . 洗次,离心收集菌体。用溶菌液 重新悬浮,于静置。离心收集菌体,加入裂解缓冲液 重新悬浮,溶液交得粘稠、透明。再加入 /的蛋白酶 于?静置。用等体积酚/氯仿抽提,倍体积无水乙醇 /, 沉淀,%乙醇洗涤,用适当的溶解。 ..大肠杆菌的转化 ...高频转化法 该法适于室温低于?时进行。 接环.受体菌于 中,振荡培养. 。取 .培养物于中,振荡培养.,使约 为.。培养物在冰上放置,倒入预冷的离心管中, 收集菌体。加入 已在冰上预冷的缓冲液. 离心 / , / 髑 / , ,. / ,, 离心。加入 .,混匀,冰上放置 使其终浓度为%。在冰上 缓冲液,轻轻混匀,加入/ 放置 ,将感受态细胞分装于管中,每管.. 。把细胞大学硕上学位论文 浸于液氮中至少 。取出细胞,使之在冰水浴中融化,取/ 细胞与已在冰水中预冷的/【‘混匀,冰上放置。? 熟冲击,在冰上放置. ,加入. ,混匀,?振 荡培养。 离心,倒去约.上清液,将细胞和 余下的上清液混匀后涂在含适当抗生素的平板上,?培养过夜。 ...标准转化法 该法适于室温高于?时进行。 受体菌于培养基中,振荡培养过夜。取培养 接种一环. 于培养基中,振荡培养.. 液转种于 此时? 约为..左右。置冰水浴上 ,, ,弃 离心 上清液。于菌体中加入 预冷的溶液 ,/ ,/ ,/ .洗涤 , 菌体次,离心收集菌体,加入 ,制成菌悬液。冰浴 加入/二甲亚枫,在冰浴上轻轻转动 ,加入 .巯基乙醇,于冰浴上轻轻转动 ,轻 ,再加入 轻混匀后置于冰浴上 ,即得感受态细胞。在预冷的管中加 入。?,置于冰浴上,加入?感受态细胞,混匀,冰浴 上静置 ,?水浴中热冲击,于冰浴上放置 。加入 ,, ,倒去 培养基,?摇床培养 离心 约. 上清液,将细胞和余下的上清液混匀后涂在含适当抗生素 的平板上,培养过夜。 ..乳酸杆菌电转化方法.矧 挑取单个菌落于液体培养基中,于过夜静置培养,第 天转种%于 中,待.时于冰上放置,使其 用冰预冷的等体积 洗菌体遍, 停止生长。离心收集菌体, 最终悬浮于/体积的电转化缓冲液中。将 感受态细胞和 质粒轻轻混匀后转移至.的电转化杯中,冰上静置后, , 使用电转化仪,电转化条件. 。电击完毕后 迅速加入倍体积的培养基,于?静置培养后,涂布于含相 四川大学硕学位论文 应抗生素的平板进行筛选。于?静置培养以后可见菌落。 ..质粒的提取 ...质粒的大批量提取 接环含质粒的.细胞于 液体培养基中,?振荡培 养. ,, 离心,弃上清液。加入溶液充分 混合,置于室温下 ,加入 溶液. ,%,轻 轻混匀,冰浴 ,加入. 溶液,混匀,冰浴 。 ,取上清液,加入.?无水乙醇,于.?静置 离心 ,弃上清液。沉淀干燥后溶于 , 离心 ?.中,加入和/,保温 。转入个管中,用等体积的苯酚,苯酚:氯仿:,氯仿:异 戊醇:各抽提次。加入/体积的和倍体积的无水 ,于?静置 ,, ,弃上清,用% 乙醇 离心 乙醇洗沉淀次,待干燥后溶于‖或中。 ...质粒的小批量提取 取. 用上述方法培养的菌液于管中,, 离心 ,弃上清液。加入.溶液,充分混合,静置,加入. 溶液?,混匀,置于冰上,加入.溶液?,混匀后置 于冰上 。, ,取上清液,加入倍体积的无 离心 水乙醇,混匀后于.?静置 。, ,弃上清 离心 液,待沉淀干燥后溶于?或中。 .. 电泳 待检测样品的分析和大小测定采用.%琼脂糖凝胶电泳。取 适量的样品与×上样缓冲液混合,小心地加入琼脂糖凝胶点样孔 中。接通电源,在大约. /的恒压下电泳至溴酚蓝染料离凝胶底部 /?/处,切断电源,将凝胶置于溴乙锭水溶液?/中染色. ,取出凝胶直接在紫外灯下观察。若需测定片段的大小或浓度, 用.凝胶图像分析系统照像。四川人学硕上学位论文 .. 物纯化 产物纯化步骤依照试剂盒供应商提供的方法: 在反应液中加入叽的 。伟备管置于 离心管中,将混合液移入制备管,,离一心,将滤液再加 入备管,重复离心次。弃滤液,将制备管置回原离心 管中,加入“的舭,离一。弃滤液,将 置回原离心管中,加入叩已加无水乙醇的 ,于 离心后重复洗涤次。,离一。将制各管置 于另一洁净的.腐心管,在膜中央加入却去离子水,室温静 置,,离一以洗脱。将得到的溶液置于 处理,除去可能混杂的酶。.?保存。 ..所用引物和的条件 :’塑&鲤 鲥钮’’ :’鱼堑:墼受鲤 鲤?’脚 :’ 凸玉避鱼瑙?鳗叁?酸’ :’匦丑趋三 ,棚’ 灼 :’’’’’; : ’戌珊.’ : ’’ ’ :’埏卫嚣盗,凹孢 : 鱼坠 ?塑竖 :’ 位点 劬 /; 分别用于扩增乳糖操纵子的片 段和片段;和用于克隆乳酸 杆菌乳糖操纵子启动子片段。/用于乳酸杆菌 四川大学硕士学位论文 乳糖缺失突变株的鉴定;/用于扩增豆豉溶栓酶基因成熟肽序列, 以上反应均用高保真酶进行,并以总为模板。 反应条件如下:?预变性分钟,延伸个循环?变性 ,?复性 ?延伸。产物用%琼脂糖凝胶电 泳鉴定。 .. 片段与载体的连接 依照连接酶供应商推荐的方法。 ..质粒限制酶酶切反应与插入片段大小检测 质粒限制酶单双酶切反应采用限制酶供应商推荐的方法,插入 片段大小的检测采用常规琼脂糖凝胶电泳,并在凝胶分析系统上观 察拍照。 .. 序列测定 由生物技术有限公司进行。 ..乳酸杆菌的诱导表达 挑选单菌落接种于培养基含腭/红霉素中,分 菌液 别加入乳糖和葡萄糖至终浓度为%,?培养。取 , ,离心 ,收集菌体。加 和 的 %, ×样品缓冲液/ ?,.,/ .%溴酚蓝,%甘油重悬菌体,沸水中煮后进行. 电泳。分离胶浓度为%,浓缩胶浓度为.%,电泳完毕后用考马 斯亮蓝.染色。 用 裂解缓冲液 /.,.将菌体重悬,冰 浴,超声破碎细胞,使蛋白释放。,离心,上清即为澄 清的细胞粗提物。取样.口进行.电泳鉴定。 .. .凝胶制备方法【 按下表配方制备.凝胶,加样。先恒流电泳至分 离胶,再调为恒流到电泳结束。。 四川大学碗二:学位论文 组分 %分离胶坠 .%浓缩胶必 丙烯酰胺贮液 .? . . , ×?/。. ? .. ×’?/。. . . %过硫酸铵 . . 恸. . 将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定. 倾去固定液,以考马斯亮蓝染色液染色。 倾去染色液,加入脱色液,缓慢摇动脱色.中间换脱色液,脱色 到获得蓝色条带及干净的背景为宜.叫川人学顶.学位论文 .结果 .乳酸杆菌表达豆豉溶栓酶基因策略 乳酸杆菌表达豆豉溶栓酶基因策略如图所示,首先从乳酸杆菌 总中克隆了乳糖操纵子上和片段,利用印和 将基因进行移码突变后,将其克隆罩;上, 中, 和连接后构建成质粒将其导入 筛选到了乳糖缺失突变株。随后将这未移码突变的片段和 片段克隆到质粒载体上,构建成整合型载体分别将 含有豆豉溶栓酶基因不同肽段的基因片段:成熟肽编码斟、 前肽和成熟肽编码区、信号肽、前肽和成熟肽编码区 ’ 克隆至整合型载体上,构建成表达质粒、 和.。表达质粒、 和转化入突变株后,质粒上的能和。互补,通过平板 显色就可以筛选到转化子,这样就成功构建了不含有任何抗性乳酸杆菌 食品级表达系统。克隆和片段的目的是为了增加整合频率,将 不同肽段的豆豉溶栓酶基因片段插入到两个片段之间是为了在乳糖操纵 子之间整合进入一个新的结构基因。在整个构建过程中需要注意的整合 型载体上的和片段以及插入片段的向位须和乳糖操纵 子上结构基因和向位保持一致。 为了表达出有活性豆豉溶栓酶基因并且和整合型载体的表达结果 进行比较,本研究也同时构建了含有不同豆豉溶栓酶片段的复制型表 达载体。首先克隆了乳糖启动子。并将其连接到穿梭载体 上,构建成质粒载体。随后分别将含有豆豉溶栓酶基因不 同肽段的基因片段克隆至.上,构建成表达质粒 .、.、.。为了达到和整合型 载体相同的效果,本研究拟以基因替代复制型表达质粒上的抗生 素抗性基因,随后共转化乳糖缺失突变株,利用基因的互补关系, 构建成食品级表达系统】。四川大学硕二二学位论文 图乳酸杆菌乳糖突变菌株和溶栓酶基因工程菌构建流程图四川大学硕上学 位论文 .乳酸杆菌表达系统的建立 乳酸杆菌表达系统的建立包括稳定突变株和表达载体的构建 ..乳酸杆菌乳糖缺陷型突变株的构建 ...质粒的构建 分别利用引物/和/丑以. 为模板 用高保真酶克隆和片段图。回收基因的产 酶切后,与经鳓和 物,将产物用 酶切的连接, 酶切后,用 补平, 构建成。经 连接后转化大肠杆菌,提取质粒筛选得到质粒。 位点的确已经被消 酶切结果显示和对照相比,上的 除,即原质粒上的基因片段已经被移码突变。 将基因片段回收后末端加后连接到载体上,转化大肠杆菌 和 酶切 ,筛选得到重组质粒.。用 和 双酶切的质粒 .,回收片段,与经过 连接后,构建得到质粒?。?质粒构建全过程如 图所示,的酶切鉴定如图所示。在.乳糖操纵子当中, 结构基因在.乳糖代谢中编码了磷酸..半乳糖苷酶,此酶在 .乳糖代谢中具有重要的作用。测序结果表明了克隆的片段的确为 序列,并且与公布的序列一致,这就从另外一方面保证了外源基 因表达的可靠性。 图质粒的验证 ./ ,.:,.,.的 ?如酶切,.的的酶切..的/ 图和的产物 的酶切,.质粒的验证,. : .的产物 的酶切,.的酶切,.的. .的产物 玎酶切,.质粒的 / 】心川大学硕:学位论文 图质粒和的构建示意图四川大学硬士学位论文 将导.在红霉素平扳上筛选到了株具有抗性的 乳酸杆菌菌株,命名为.将.在没有红霉素的液 体培养基中连续传代,将菌液稀释后涂布于培养基上,扰取单 菌落分别点种于有红霉素和没有红霉素的平板上,筛选到株红霉素 敏感性菌落.该结果提示,整合到染色体中的,很可能是发 生了第次同源重组,从染色体琢出的重组菌株.甩培养基 对譬表型进行了检测,结果表明。野生型的突变株能在日妇平 板上形成黄色菌落网,而突变株则仍然为白色的单菌落图.此 突变株命名为乳酸杆菌. 圈平板的鉴定结果 .野生型突变菌株 分别提取和菌株的总,用引物和硒 对染色体上焉帅位点消除结果进行鉴定.由于乳酸杆菌基因组 中的丑和基因中各含有个位点,因此将片段 用黝酶切后电泳,结果显示,野生型的基因片段应该 个片段,面突变型基因片段则只能 被切成、和 被切成和 个片段图.该结果与预期结果完全一 致.由此可以认为,中的突变基因已经置换了乳酸杆 菌中的野生型基因,该突变株.可以用作食品级受体菌.四川火学硕。学位论 文 圈乳酸杆菌乳糖缺陷突变株的验证 和道.野生型和突变型乳酸杆菌的产物,和道. :, 野生型和突变型乳酸杆菌产物的酶切鉴定 ..乳酸杆菌整合型表达载体构建与鉴定 为了表达外源基因,必须构建与乳酸杆菌配套的整合型表 达载体。按照图和图所设计的技术路线,用 和酶切 双酶切的质粒 ,回收片段,与经过口和 、 连接后,构建得到质粒,其多克隆位点区含有 、勋?、 个酶切位点以方便外源基因的插入。在 位点上游还含有结合序列,结合序列和 的第个之间的序列为个碱基。 .豆豉溶栓酶基因在.中的表达 ..溶栓酶基因重组质粒的构建与鉴定 为了在乳酸杆菌中大量表达出有生物学活性的豆豉溶栓酶,我们分 别将豆豉溶栓酶基因中的不同编码序列与载体重组,获得 个重组表达质粒图。对个重组质粒进行酶切鉴定,结果与预 期一致。图所示结果是其中个重组质粒的酶切分析结果。洲川大学硕二学位 论文 图豆豉溶栓酶基因整合型表达质粒的构建 图质粒的酶切鉴定 /船“.,.,., 、 和埘 / 的 道分别是.的 酶切鉴定,:的验证四川人学硕士学位论文 . 转化子的筛选与鉴定 . 将质粒电转化乳酸杆菌中,在红霉素抗性平 板上筛选到株具有抗性的菌株。将此菌株点种于平板上检测 发现,表型已经得到了恢复。表明质粒上的基因已经成功的 替换了乳酸杆菌操纵子上功能丧失的基因。提取基因组 。并用引物和进行验证,结果显示约在处有条带, 而对照却没有条带图。将产物测序,结果显示的确为溶栓酶 基因。表明目的基因已经成功整合到了.的基因组中。 图 整合豆豉溶栓酶基因的鉴定 : .引物/的验证结果 ,引物/的验证结果.对照模板的验证 豆豉溶栓酶基因在.中稳定的表达 挑取单菌落接种于分别含有.%的乳糖和葡萄糖的培养基中 于?过夜静止诱导后,,,离心,用超声波破碎 细菌,利用.电泳检测,结果发现仅在乳糖诱导的沉淀中具 有的特异条带,而在乳糖诱导的上清和葡萄糖诱导的沉淀和上 清液中都没有检测到目的条带。由于乳酸杆菌乳糖操作子的在基因表 达调控方面的特点,在有乳糖的条件下可以启动基因的表达,而在加 入葡萄糖情况下则可以抑制基因的表达,,因此结果与预期结果 一致图。另外,提取过夜诱导后的细菌,利用检测凹川大学硕士学位论文 后发现仍然有条带,故可以判断豆豉溶栓酶基因在乳杆菌的基 因组中可以稳定的存在。 圈豆豉溶栓酶基因在乳酸杆菌中表达产物的分析 :蛋白质电泳,道:乳糖诱导培养物和细胞裂解物, 道:葡萄糖诱导培养物和细胞裂解物 . .乳酸菌复制型表达质粒的构建 为了比较豆豉溶栓酶基因插入不同类型表达载体后的表达结果,我 们还利用乳酸杆菌自主复制型载体构建了表达载体 .,然后再将豆豉溶栓酶的不同编码序列与此表达载体重 组,获得了个豆豉溶栓酶基因的表达质粒。对所获重组质粒进行酶 切分析,结果与预期一致,个质粒转化乳酸杆菌和表达工作仍在进 行中。 利用引物扩增乳酸杆菌乳糖操纵子启动子序列,其扩增的启动子 序列包括,并且在载体中引入了新的忱位点,使 和 位点的密码予之间的距离为个。扩增的启动子片段为 和勋 酶切后与经相同酶切的载体 。将乳糖启动予经 和 相连,构建成质粒载体.随后用 分别酶切质粒、和.回收含有豆豉溶栓 酶基因成活性的豆豉溶栓酶。熟肽、前肽和成熟肽以及信号肽、前肽?川人 学硕士学位论文 和成熟肽的片段与经&嘏取 酶切后的质粒:奎接, 构建成表达质粒?、和?图 。 图乳酸杆菌复制型表达质粒构建示意图四川人学硕士学位论文 讨论 乳酸杆菌转化方法 . 电穿孔法是利用瞬间脉冲电场作用于受体细胞,细胞膜局部被击 穿,产生暂时的小孔,从而将外源基因导入细胞。电转化的机制仍未 完全阐明,等证实电脉冲之前,和细胞随机地分布于电 极之间,电脉冲早期,和细胞被定向阳极运动;在电脉冲的后 期,分子撞向细胞的阳极面或末端,并且插入细胞的外膜或者 进一步进入细胞质间隙,随后在?孵育期间,通过内膜进 入细胞浆。因此电压脉冲有双重效应,即驱使快速向阳极运动 及向受体细胞表面渗透。电脉冲时间太短则不能使分子有效地 进入细胞,而电泳冲时间过长,细胞生存率降低,转化效率的提高将 被抵消。 电穿孔转化法已经被广泛地应用于动植物、微生物细胞的转化。 此方法操作简便,省时,转化率高,为没有适合的转化方法的细胞提 供了质粒转化的新途径。但它需要特殊的仪器设备,成本较高。一般 影响电转化效率的因素有细胞培养的时间、场强、质量浓度、 转化液的离子强度等。许多杆菌利用电激方法进行质粒转化都有了成 功的报道:如大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌、乳杆菌、分支杆菌、地衣 芽孢杆菌、短芽孢杆菌以及巨大芽孢杆菌等。 于报道了乳酸杆菌电转化方法,电转化频率可达到 。随后,也于年报 ...×转化子// 道了乳酸杆菌电转化方法,转化频率因所使用的菌种和质粒浓度的不 同而可以达至转化子/肛 值得注意的是在 的文章中指出质粒浓度达到即的时候转化频率最高,他由此推断增 加质粒浓度对乳酸杆菌的转化有重要的影响。 由于革兰氏阳性菌细 ,因此在随后的研究中,等人报道了在乳酸杆菌的感受 胞壁厚 态制备过程中,采用溶菌酶、甘氨酸【】、氨苄青霉素处理细胞壁可以 提高乳酸杆菌的转化效率,特别是采用氮苄青霉素处理时电转频率最 高的时候可达. ,并且电转化的重复性较之以前 转化子厶‘川人学坝.。学位论文 有明显的提高。 尽管已经有以上的报道,但本研究在进行乳酸菌电转化时,一直未 获得报道的转化效率且重复性较差,在实验过程中也发现了一些奇怪 的现象。例如,将转化后恢复培养的菌落涂布在含相应抗生素的平板 上,待菌落长出后于显微镜下观察,发现菌体由杆状变成了球状,这 种奇怪的现象目前还未有人提出解释,有可能是电转化过程中对细胞 壁的损伤造成的。通过几次成功的实验发现,转化效率的确和感受态 细胞的体积和浓度、质粒的浓度以及电击后的恢复温度和都有 一定关系。若感受态细胞的浓度过高,则/数目过高,电击后 细胞的致死率过低,则有可能是影响电转化成功的重要因素。研究发 的混合物 现在.的电转化杯加入感受态细胞与 ‖,,对于复制型质粒可获得比较好的转化效果。 在. 此外也可以尝试原生质体转化法,因为原生质体转化法对大多数 微生物细胞都有效,方法较简单,转化率高,能满足大多数克隆的要 求,勿需特殊的仪器设备,所以被广泛使用。不同菌株原生质体形成 率差异较大,这与不同菌株细胞壁肽聚糖结构差异大有关。原生质体 转化法的基本步骤包括原生质体的制备、原生质体与的混合、 的吸收和细胞壁的再生等。主要的影响因素包括溶菌酶处理 时间和用量、细胞生长期、原生质体保存缓冲液和再生培养基的 成分等。原生质体形成率和再生率,用量和构象等因素都是影 响原生质体转化频率关键因素。 船于】年报道了乳酸杆菌的原生质体的制备方法,研究 中采用了、、等培养基。在原生质体制备方面,采用变 溶菌素和溶菌酶结合处理的方法要明显好于只用溶菌酶处理的方法。 在原生质体的再生方面主要采用了棉子糖作为稳定荆,采用乳糖、蔗 糖、替代棉子糖时,原生质体几乎不能再生,同时,变溶菌素和 溶菌酶处理时间的长短也对原生质体的再生频率具有较大影响。 可以 在年报道了乳酸杆菌的原生质体转化方法,弘 得到.个转化予。川人学硕士学位论文 .选择标记的种类及构建策略 乳酸菌是食品微生物中的重要成员,是对人和动物建康有益的益 生菌。乳酸茵的分子改良需要发展新的基因工具,包括质粒载体,选 择标记和转化 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 。这些基因工具都应达到食品级的标准,用于构建 重组子的所有基因成份应完全来自传统上用于食品发酵的微生物,这 ,。所以 些微生物一般认为是安全的 食品级载体必须由来自同源宿主或密切相关的微生物的 组成,并且由于红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因能转移到环境以及 内源微生物中,所以从食品安全性考虑。含抗生素抗性标记的微生物 不能应用予食品生产中。美国旱己禁止早在食品中使用此类标 记。 ..食品级选择标记的种类 ,乳酸茵的食品级克隆载体标记主要分为显性选择标。己和互 近年来 补选择标记。 显性选择标记是利用乳酸菌本身具有的特性进行标记,以乳链菌肽 .抗性基因、噬菌体抗性基因代替抗生素抗性基因作为选择标 记。显性选择标记提供了新的表型特征,并且不依靠宿主表达基因。 显性选择标记包括一、 【以及代谢糖类【抗性选择标记。 互补选择标记是利用质粒选择标记补充宿主染色体中的缺失突变, 从而恢复宿主原来的某种特性,并根据这一特性进行选择。互补标记 需要一个具有特异性缺失突变的初级载体,这一特异性缺失可通过标 记基因补充而恢复最初的表型特征。例如乳糖、胸苷营养 缺陷型,需要染色体编码性状的突变,随后由质粒标记基因编码此表 型特征,由此建立互补选择标记系统【踟。互补系统的个明显有利 之处就是在选择压力下进行工业发酵时能确保质粒的稳定性。互补选 氨苄青霉素互补选择标记。 择标记包括、及 ”】等提出的第三种新的策略是结合主体和互补系统的优 点并且依靠两个成分而建立的。第一个成分是一个携有完全由乳酸菌 基因构成的功能性复制子但没有选择标记的克隆载体。第二个成分是 伴生型质粒,它是一个以红霉素抗性基因为显性选择标记的复制缺失.川人 学硕士学位论文 性质粒。构建的伴生质粒只能在乳酸菌中复制,由于只有含有克隆载 体和伴生质粒的转化子才能在含有红霉素的平板上存活,伴生型质粒 能用于筛选已获得克隆载体的细胞。由于复制缺失性,伴生型质粒能 很容易在筛选步骤中从抗生素培养基中清除。这种载体系统在食品微 生物应用中有很大的潜力。 捌等的研究中,基因转移中涉及了两个质粒,随后通过 在 质粒消除,去掉非食品级选择标记。在无乳糖发酵表型特征的背景下, 一半乳糖苷酶活性的丢失可作为一个选择标记,而在乳糖发酵表型 特征背景中,能用平板影印法区别,和的克隆予。因此,他们以 质粒消除方式移去『。但是当质粒在单一菌株中组合相同 表型特征时,例如编码不矽噬菌体抗性机制的质粒组合或编码不同抗 生素抗性的质粒组合,证明临时标记质粒还是有用的。 ..食品级选择标记的构建策略 ...乳酸杆菌乳糖操纵子的特点例 在 . 中,目前研究最广的糖转运机制是乳糖特异的磷 酸转移系统,乳糖基因被定位为在乳酸杆菌染色体上的一个簇,这个 簇包括分别编码个抗终止蛋白,磷酸转移酶系统 中的乳糖特异元件和以及磷酸一一半乳糖苷酶。启动 子区域含有个 代谢响应元件,这个元件覆盖了.区,这 个区域具有个高度保守的序列,含有个核酸抗终止子序列&气 中操纵子的表达受 和个终止予结构。实际上,. 到了个途径的调控,它们分别是:碳代谢的抑制和转录抗终 止子乳糖的诱导。这个诱导机制和//具有明显的不同,在. 中基因表达是被抑制子所调控,塔格糖一一磷酸可作为诱导剂。上述 的提到的乳糖操纵子的碳代谢抑制是有调控蛋白蛋白调 节。此外,抗终止子的活性是由葡萄糖进行负调控的。抗 终止子家族有个共同的区域,它们分别是一个结合区域和个 调控区域和 ,根据介导的模型,主 ?当脱磷酸化,同时?磷酸化的时 要以种方式存在; 候,以有活性的形式存在; ?当?和同时磷酸化四川人学坝:学位论文 的时候,以没有活性的形式存在;?当在葡萄糖存在时, 去磷酸化,以没有活性的形式存在。因此. 乳 糖操纵子是由乳糖高度诱导,同时当葡萄糖作为碳源的时候,操纵子 的活性可以完全关闭。根据这样的机制可以设计出表达异源蛋白的复 制型和整合型载体。. 操纵子结构如图所示: 陋 坦 图乳酸杆菌乳糖操纵子结构示意图 ...乳酸杆自弘选择标记的构建 如上所述,目前,在表达系统中已成功使用的食品标记有 、无义抑制基因、细菌素抗性或免疫基因等。是最早应用 于表达系统的个食品级选择标记,在应用时,一般需要破坏 或者缺失宿主菌株的基因:筛选具有表型的菌株,然后将 带有的表达载体转化‘菌株,恢复表型。 ..破坏或者缺失菌株的基因 破坏或者缺失菌株的基因一般程序是将丑基因进行缺失或者 移玛突变后导入乳酸杆菌中,使其秕.基因组上的同源片段发生 双交换。其过程如下:?川人学硕上学位论文 贝基因被环出后,菌株的表型应该是。 .值得注意或改进的地方 本实验对在乳酸杆菌中成功表达了豆豉溶栓酶基因,但是在纤维蛋 白平板上却没有检测到水解圈。分析原因很有可能是以下几种原因: ..缺少合适的分子伴侣 子伴侣【】是一类分布很广泛的蛋白质,其功能是介导其他蛋白质 分 的折叠装配。分子伴侣能阻止多肽链之间因正电疏水区短暂暴露而发 生的不正确作用。 本实验张仁怀脚】等人在进行豆豉溶栓酶基因表达研究时发现豆 豉溶栓酶基因的前肽对于此基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达有 重要影响。当没有此前肽存在时,豆豉溶栓酶基因在大肠杆菌和毕赤川人学 硕』二学位论文 酵母中的表达产物均没有活性。导致本研究的原因是否也在乳酸杆菌 中存在还不得而知。由于乳酸杆菌电转化的限制,故未能成功把包括 豆豉溶栓酶基因的前肽和信号肽的片段整合至染色体中,因此未能得 到完整的对比结果。下一步应该在完善乳酸杆菌电转化的条件后,将 豆豉溶栓酶基因的前肽和信号肽的片段整合至染色体中,以期得到有 活性的豆豉溶栓酶. ..外源基因表达产物的运输与定位 外源基因在中表达后,其产物蛋白质可溶解在细胞质中, 也可分泌到细胞外培养基中以及锚定到细胞壁表面。?】等 在 中成功地将破伤风毒素片段 定 位于上述的个区域布鲁斯病抗原帮 /也被成功地定位于工.细出的细胞质、细胞表面及 胞外培养基中.由于外源蛋白在中表达后可锚定到细胞表面, 也可分泌到胞外培养基中,且乳酸菌能在人或动物的肠胃中存活,所 以可作为一种活的、口服的疫苗应用于人体和动物的免疫闭。以转基 因菌株作活疫苗的研究将是分子生物学研究的一个重要 . 方面。 外源蛋白分泌到胞外培养基主要是通过信号肽引导分泌实现的.在表达外源基因时,通过信号肽来引导外源蛋白的分泌可简化产物的 、 表达后提纯例。在表达系统中已成功使用了内源信号肽 等和外源信号肽等引导外源蛋白的分泌表达.表 达同一种外源蛋白时,不同的信号肽【之问的分泌表达率有很 大的差别橱。在对./表达葡萄球菌核酸酶的研究中发现, 以内源信号肷与基因融合进行分泌表达,其分泌表达率可 达到%,而外源信号肽与基因融合表达的分泌表达率 只有%。信号肽在引导分泌蛋白进行跨膜运输时,成熟蛋白部分的 中的研究结果表明, .末端会对运输效率产生极大的影响。在 信号肽末端与成熟蛋白部分末端之间的电荷平衡可能会对分泌表 达率产生一定的影响,但是否会影响中外源蛋白的分泌表达尚不 清楚【们.叫川人学倾学位论文 相关的研究表明,在成熟蛋白一末端融合一段肽链并不影响蛋白 活性.同时发现,在成熟蛋白.端与信号肽之间融合段特定的肽 链,会对分泌表达率和产量产生极大的影响,酸性或中性的肽链以及 带负电或不带电的肽链能提高分泌表达率和产量,而碱性或带正电的 肽链则正好起相反的作用,例如,将段人工合成的含个氨基酸残基 的肽链】融合到成熟蛋白.端与信号肽之间。并在. 中分泌表达,发现分泌率提高了将近倍,而表达产量可提高到 倍左右。 因此也可以尝试克隆乳酸杆菌本身的信号肽基因片段与豆豉溶 栓酶基因的编码区融合以后,再将其整合至乳酸杆菌的染色体中后利 用乳糖诱导基因表达。本研究也构建了含有豆豉溶栓酶基因的复制型 载体,但是由于电转化条件的限制,至今仍未能将其导入到 ?剐中,下一步以期望完善电转化条件后,能将所构建的 表达质粒导入其中,以期得到有活性的豆豉溶栓酶。