小鼠丙酮酸脱氢酶E1酶联免疫分析ELISA
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用
产品编号:E0776m
预期应用
ELISA法定量测定小鼠血清、血浆或其它相关液体中丙酮酸脱氢酶-E1含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中丙酮酸脱氢酶-E1水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入丙酮酸脱氢酶-E1抗原、生物素化的抗小鼠丙酮酸脱氢酶-E1抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的丙酮酸脱氢酶-E1呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板:一块(96孔)
标准品(冻干品):2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，
然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 nmol/L，做系列倍比稀释后，分别稀释成100
nmol/L，50 nmol/L ，25 nmol/L，12.5 nmol/L，6.25 nmol/L，3.12 nmol/L，1.56 nmol/L，其
原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 nmol/L，临用前15分钟内配
制。
如配制50 nmol/L标准品:取0.5ml 100 nmol/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的
Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
2. 样品稀释液:1×20ml/瓶。
3. 检测稀释液A:1×10ml/瓶。
4. 检测稀释液B:1×10ml/瓶。
5. 检测溶液A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先
计算好的每次实验所需的总量配制(每孔100ul)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul
检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 6. 检测溶液B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B1:100稀释。稀释方法同检测
溶液A。
7. 底物溶液:1×10ml/瓶。
8. 浓洗涤液:1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
9. 终止液:1×10ml/瓶(2N HSO4)。 2
标本的采集及保存
1(血清:标本请于室温放置2小时或4?过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20?保存，但应避免反复冻融。
2(血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8? C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20?保存，但应避免反复冻融。
注:标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准
品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，
轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37?反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100ul(取1ul检测溶液A加99ul
检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制)，37?,60分钟。 3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。 4. 每孔加检测溶液B工作液(同检测A工作液) 100ul，37?，60分钟。 5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干。 6. 依序每孔加底物溶液90ul，37?避光显色(30分钟内,此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明
显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止)。
7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。终止液的加入顺序应尽量与底
物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。 在加终止液后15分钟以内进行
检测。
注:
1( 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。
测量时先用此孔调OD值至零。
2(为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。 3. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8?保存。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B
工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液或
检测溶液B工作液。
4. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水 纸，酶标板朝下用力拍几次;将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需 要，重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性
本试剂盒可同时检测重组或天然的小鼠丙酮酸脱氢酶-E1，且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算
以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1( 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
2( 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 3( 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
4( 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。 5(在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。 6(底物请避光保存。
检测范围:
1.56 nmol/L -100 nmol/L
说明
1(试剂盒保存:-20?(较长时间不用时);2-8?(频繁使用时)。 2(有效期:6个月
3(浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
4(刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影
响。
5(中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
本文档为【小鼠丙酮酸脱氢酶E1酶联免疫分析ELISA】，请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑，
图片更改请在作品中右键图片并更换，文字修改请直接点击文字进行修改，也可以新增和删除文档中的内容。
该文档来自用户分享，如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服，我们会及时删除。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生，若发现您的权利被侵害，请联系客服邮件isharekefu@iask.cn，我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权，请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传，仅限个人学习分享使用，禁止用于任何广告和商用目的。
浙公网安备 33021202002483