_突触核蛋白在大鼠脊髓的表达

_突触核蛋白在大鼠脊髓的表达 首 都 医 科 大 学 学 报 O c t. 2009 2009年 10月 第 30卷 第 5期 Vo .l 30 No. 5 Jou rna l of Cap ita l M ed ica l U n ive rsity [ do i: 10. 3969 / j. issn. 1006 27795. 2009. 05. 003] ? PD 的収病机制不早期诊断 ? α2突触核蛋白在大鼠脊髓的表达 112 1 1 1 3 昕 殷娟娟 Gio rgio V ivaqua李 刘光伟 李尧华 于 顺 ( 1. 首都医科大学宣武医院老年病研究所神经生物学研究室 ,神经发性病教育部重点 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 ; ) 2. 罗马大学人体解剖学系不 D an ie l Bove t研究中心 (ααα)α【摘要 】 目的 研究 2突触核蛋白 2Synuc le in,2Syn在正常大鼠脊髓中的表达 。方法 利用 2 种抗 2Syn单抗 3D5 和 2 E3 αα()进行克疫组化染色 ,观察 2Syn在脊髓的表达和分布 ;用克疫荧光双标方法观察 2Syn不神经肽 Y N PY共存的情况 。用 L uxo l ααfa st b lue染色鉴别有髓不无髓神经纤维 。结果 2Syn主要存在于脊髓灰质神经元核及灰质无髓神经纤维中 。富含 2Syn的神 αα 经纤维主要分布在脊髓灰质的第 ?、?层 ,而 2Syn核阳性神经元主要分布在第 ?、?、?、?层 ; 后根第 ?、?层一小部分 2Syn αα阳性纤维不 N PY共存 ;前角细胞核呈 2Syn阳性神经元胞质中存在 N PY,而其他部位的 2Syn核阳性神经元胞质中无 N PY。结 α论 2Syn存在于大鼠脊髓灰质的神经元核及无髓神经纤维中 ,部分阳性神经纤维和神经元胞体呈 N PY克疫阳性反应 。 α 【关键词 】 2突触核蛋白 ; 脊髓 ; 神经元 ; 大鼠 【中图分类号 】 Q 189 αImm un o loca l iza t ion of2Syn uc le in in the Ra t Sp ina l C ord 1 2 1 1 1 1 3Y IN J uan2juan, Gio rgio V ivaqua, L I X in, L IU Guang2we i, L I Yao2hua, YU Shun ( 1. D epa rtm en t of N eu robiology, B eijing Institu te of Geria trics, X uanw u H ospita l, C apita l M ed ica l U n iversity, Key L abora tory for N eu rodegenera tive D iseases of M in istry of Educa tion; 2. D epa rtm en t of H um an A na tom y and R esea rch Cen ter“D an iel B ovet”, )S apienza U n iversity, Itily αα() 【A BSTRAC T】 O b jec t ive To p rovide a system a tic m ap of2synuc le in 2Synloca liza tion in the no rm a l ra t sp ina l co rd. M e thod s αα( ) Two hom e2m ade monoc lona l an tibod ie s 2E3 and 3D5 aga in st2Syn we re imm umoh istochem ica lly u sed to revea l the loca liza tion of2Syn in the sp ina l co rd. L uxo l Fa st B lue sta in ing wa s app lied to iden tify the unm ye lina ted ne rve fib re s. Doub le imm unofluo re scence wa s u sed to αα( ) ob se rve the co2loca liza tion of 2Syn w ith neu rop ep tide Y N PY . Re su lts 2Syn wa s loca lized in the neu rona l nuc le i and the unm ye lina ted ne rve fibe rs w ith in the gray m a tte r. In bo th 2E32and 3D5 2sta ined sec tion s, in ten se ly sta ined ne rve fibe rs we re ob se rved in lam inae ? and ?. Howeve r, the imm unopo sitive neu rona l nuc le i we re on ly found in 3D52sta ined sec tion s, wh ich we re loca lized w ith in αthe gray m a tte r, e sp ec ia lly in lam inae ?, ?, ?, ?. Doub le imm unofluo re scen t sta in ing showed tha t som e of the2Syn2imm uno reac tive () fibe rs and te rm ina ls in lam inae ? and ? sta ined a lso fo r neu rop ep tide Y N PYin the do rsa l ho rn s, whe rea s in the an te rio r ho rn s, a few ααmo to r neu ron s exp re ssing 2Syn in the nuc le i had cytop la sm ic N PY. C on c lu s ion 2Syn is loca lized in the neu rona l nuc le i and the αunm aye lina ted ne rve fibe rs w ith in the gray m a tte r of the sp ina l co rd. Som e of the2Syn2po sitive neu ron s and fibe rs a re N PY2po sitive. α 【KEY W O RD S】 2synuc le in; sp ina l co rd; neu ron; ra t α(αα),对路易体是由于黑质多巴胺能神经元的丢失造成的 2突触核蛋白 2Synuc le in,2Syn是一个由 140 [ 4 ]α个氨基酸构成的酸性蛋白质 ,在中枢及外周神经系统 病的研究 収现 ,2Syn参不 PD 的病理过程开始于低 [ 1 ] 中含量丰富 。该蛋白在 PD 的収病过程中起着重要 位脑干的神经核团以及嗅球 。而最近对临床上没有収 [ 2 ] 的作用 。它是 PD 特征性病理改发 ———路易小体或 现症状的 PD 病人的尸检表明 ,脊髓中紧靠着延髓和嗅 [ 5 ] [ 3 ] α球的自主神经核是最常见和最早叐侵犯的部位 。 已路易神经索的主要组成成分 ,然而 ,2Syn 如何参不 α帕金森病的病理过程却不十分清楚 。 PD 的主要症状知 2Syn病理改发可以収生在中枢和周围神 经系统的部分区域 ,但是为何这些区域中的某些特定( ) 基金 项 目 : 国 家 高 技 术 研 究 収 展 计 划 863 计 划 重 大 项 目 ( ) ( ) 神经元最先叐到侵犯仍然不清楚 。为了探讨这一机 2006AA02A408 、国家自然科学基金 30570646 , 30430280 、北京市自 ( ) 然科学基 金 7022011 资 助 项 目 , Suppo rted by N a tiona l H igh2tech R e2 α制 ,本研究需要了解神经系统中 2Syn 的分布及其表 ( ) sea rch D eve lopm en t P lan 2006AA02A408 , N a tiona l N a tu ra l Sc ience ( ) Founda tion of Ch ina 30570646 , 30430280 , N a tu ral Sc ience Founda tion of 达部位 。目前 ,许多研究使用不同的抗体检测人类和 ( )B e ijing 7022011 [ 6 27 ] α 其他哺乳动物脑中 2Syn 的细胞定位和分布 , 但3 Co rrespond ing au tho r, E2m a il: yu shun103 @ yahoo. com. cn α)2 克疫荧光双标 :将脊髓切片不一抗在 4 ?条件是尚无文献报道 2Syn 在脊髓中的表达和分布 。本 αα ( ) 研究使用 2种新型抗 2Syn的单兊隆抗体研究 2Syn下反应过夜 ,一抗分别为 3D 5 1 ?2 000 +神经肽 Y ()( ) ( ) N PY抗体 1 ?7 000 , 2 E3 1 ?2 000 + N PY 抗 体 在正常大鼠脊髓中的表达和分布 。 ( ) ( 1 ?7 000 ,然后不生物素标记的山羊抗鼠 IgG 1 ?1 材料和方法 )1 000 室温反应 2 h,最后不亲和素结合的 Cy3 以及 1. 1 实验材料 F ITC标记的山羊抗小鼠的 IgG室温反应 1 h。荧光标 ) 记结果用荧光共聚焦显微镜观察 。 1实验动物 :健康成年 W ista r大鼠 ,雄性 ,体质量约 ) 3 W e ste rn b lo tting 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 : 将大鼠脊髓匀浆后 , 用 250～300 g,购自军事医学科学院实验动物研究中心 。 )αBCA 法测定蛋白浓度 , 15 %的 SD S2PA GE 电泳分离蛋 2 主要试剂 :抗 2Syn单兊隆抗体 2 E3和 3D 5由 白质 ,半干法将蛋白质转移至 PVD F 膜 。 PVD F 膜不 本室制备 ;神经肽 Y抗体购自 San ta C ruz公司 ; 生物 ( )一抗 3D 5 1 ?500 , 2 E3 1 ?1 000 于 4 ?反应过夜 ,然后 素标记山羊抗小鼠 IgG和辣根过氧化物酶标记的山 ( )不辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 1 ?5 000 羊抗小鼠 IgG以及 F ITC标记的山羊抗兔 IgG, ABC过 氧化酶复合物购自 V ec to r公司 ;亲和素标记的 Cy3 购 室温反应 1 h, ECL 试剂盒检测 。 自 Sigm a公司 ;其他试剂均为分析纯 。 2 结果 1. 2 方法 α2. 1 2S yn 存在于大鼠脊髓中 )1克疫组织化学 : W ista r大鼠麻醉后 ,用 4 %的多 αα聚甲醛固定 , 叏脊髓做冰 冻切 片 , 将切 片 不抗 2Syn 克疫组化结果显示 ,2Syn主要存在于脊髓灰质部 ( )α单兊隆抗体 3D 5和 2 E3 1 ?10 000 于 4 ?反应过夜 , 分 ,很少位于白质 。为了更好的展示 2Syn在脊髓中的 ( ) 然后不生物素标记的山羊抗鼠 IgG 1 ?1 000 室温反 分布 ,本研究根据 Rexed的脊髓解剖学分层 ,观察了脊 ( α)应 2 h,再不 ABC过氧化酶复合物 1 ?2 000 室温反应 髓颈部到骶部不同分层 2Syn的表达 。结果显示 ,脊髓 α 第?、?层 2Syn表达最多 ,尤其是在脊髓的侧索和后根 ; 1 h, DAB 显色 ,显微镜下观察结果 。 αL uxo l Fa st B lue染色 :将切片依次放入乙醇 ?氯仿 腰髓部分的第 ?层和第 ?层 2Syn也有分布 。然而 ,在 α脊髓的第 ?层到第 ?层以及第 ?、?层 2Syn 表达很 溶液 , 95 % 乙 醇 溶 液 , 0. 1 % L uxo l Fa st B lue 液 中 α56 ?过夜 ,次日依次放入 95 % 、70 %乙醇溶液和双蒸 少 。在脊髓胸段和腰段的第 ?层 2Syn 主要分布在中 水中 ,用 0. 05 %碳酸锂溶液和 70 %乙醇溶液分化 ,镜 间外侧核的神经纤维和末梢 。在使用 3D5染色的切片 α下观察脊髓灰 、白质分界是否清晰 ,最后用 C re syl V io2 中 ,可见 2Syn核阳性神经元主要分布在第 ?、?、?、 () ?层 ,但在第 ?层的分布比其他层多 图 1, 2。le t复染 ,显微镜下观察结果 。 α图 1 3D 5 和 2 E3 显示 2S yn 在大鼠颈髓和胸髓中的分布 αF ig. 1 A n a tom ic a l d is trib u tio n o f2S yn in ra ts ’ c e rv ic a l a nd tho ra c ic re g io n s o f the sp in a l co rd re ve a le d by 2 E3 a nd 3D 5 a n tibo d ie s A , B : Cervica l region s stained by 3D5; C , D : Ce rvica l region s sta ined by 2 E3; E 2G: Tho rac ic region s sta ined by μμ() () 3D5; H 2J : Tho rac ic region s stained by 2 E3; Sca le bars = 500 m A , C, E, H , 100 m B , D , F, G, I, J . 首 都 医 科 大 学 学 报 第 30卷 586 α图 2 3D 5 和 2 E3 显示 2S yn 在大鼠腰髓和骶髓中的分布 αF ig. 2 A n a tom ic a l d is trib u tio n o f2S yn in ra ts ’ lum ba r a nd sa c ra l re g io n s o f the sp ina l co rd re ve a le d by 2 E3 a nd 3D 5 a n tibo d ie s A , B : L um bar region s sta ined by 3D5; C , D : L um ba r region s sta ined by 2 E3; E 2G: Sac ra l region s sta ined by μμ() () 3D5; H 2J : Sac ra l region s sta ined by 2 E3; Sca le ba rs = 500 m A , C, E, H , 100 m B , D , F, G, I, J . α使用 L uxo l Fa st B lue 对脊髓髓鞘进行染色 ,如图 抗 2Syn单兊隆抗体 3D5 和 2 E3 均可在相对分子质 α 3 所示 ,脊髓切片中灰质几乎不着色 ,白质呈蓝色 ,2 量为 19 000 附 近 检 测 到 一 阳 性 条 带 , 进 一 步 说 明 α() Syn阳性的神经纤维大部分是无髓神经纤维 。 2Syn存在于大鼠脊髓中 图 4 。 W e ste rn b lo tting结果显示 ,在大鼠脊髓匀浆中用 图 3 脊髓的 L u xo l fa s t b lu e 染色 F ig. 3 L uxo l fa s t b lu e s ta in in g fo r m ye lin o f the sp in a l co rd The m ye lina ted area s app ear in ten se ly b lue. Comp arison of the se sec tion s w ith the 3D5 2and 2 E3 2sta ined α() sec tion s sugge sts tha t mo st of the imm uno reactive2Syn fibe rs a re unm ye lina ted A , B . B is the m ag2 μn ification of A. Sca le ba r: 500 m. α,脊髓第 ?、?层中有少量的共存神经末梢 ,的切片中 2. 2 2S yn 在脊髓中与神经肽 Y共存 但是在第 ?层中却未见到 ,然而在腹侧角 ,在少数细 克疫荧光双标结果显示 ,在 2 E3 标记的切片中 , α(胞核 2Syn阳性的运动神经元的胞质中存在 N PY 图 α脊髓的第 ?、?以及第 ?层 2Syn 阳性的神经纤维和 ) 8 , 9 , 10 。末梢 N PY 也 为 阳性 , 但 是在 脊髓 前 角 神 经 纤 维 中 , α() 2Syn似乎没有不 N PY共存 图 5 , 6 , 7 。在 3D5 标记 3 讨论 α利用 2种新型抗 2Syn 单抗进行克疫组织化学 α染色证明 ,2Syn主要存在于脊髓灰质神经元核及灰 α质无髓神经纤维中 。 2种抗体所显示的 2Syn克疫阳 α性结构不同 : 3D5 和 2 E3 均识别神经纤维中的 2Syn, α但 3D 5同时识别神经细胞核中的 2Syn。使用 R exed α的脊髓解剖学分层収现 ,2Syn 阳性神经纤维以脊髓 α后角 ?、?层最为丰富 ,而细胞核呈 2Syn 克疫阳性 反应的神经元主要分布在第 ?、?、?、?层 , 但以第 ?层最多 。 α 2Syn在脊髓灰 质 不同 分层 中的 分布 不 同可 为 PD 一些早期症状的原因提供线索 。 PD 患者通常都 图 4 用 3D 5 和 2 E3 对大鼠脊髓匀浆进行 [ 8 ] [ 9 ] 伴有疼痛 和一些自主神经功能障碍的症状 ,包括 W e s te rn b lo tting 分析结果 心动过缓 、便秘 、体位性低血压和内脏神经紊乱 ,而最 F ig. 4 W e s te rn b lo tting a n a ly s is o f sp in a l co rd u s in g [ 5 ] 3D 5 a nd 2 E3 a n tibo d ie s 近 的研 究 表 明 疼 痛 和 便 秘 可 以 作 为 PD収 病 的 标 L ane M is p ro te in mo lecu la r we igh t standa rd m a rke r. αL uxo l Fa st B lue不着色的无髓纤维 ,而这些纤主要是 志 。不上述结果一致 ,作者収现 2Syn 阳性神经纤维 首 都 医 科 大 学 学 报 第 30卷 588 α维往往不痛觉的传递有关 。此外 , N PY是一种不调节 Syn 核阳性神经元呈 N PY克疫阳性反 ?、?层的 2[ 10 ] α疼痛有关的神经肽 ,作者的研究结果提示 ,脊髓后 应 ,进一步提示 2Syn阳性神经纤维和神经元不痛觉 α角第 ?、?层的 2Syn 阳 性 神 经 纤 维 以 及 第 ?、?、 的调控有关 。 αα已知 2Syn 的高浓度或高表达是其聚合成细胞 Syn病理改发的尸检患者的脊髓第 ?层可以 存在 2 [ 11 ] α 内包涵体的重要原因 。不此观点相吻合 , 在脑中检 出2Syn阳 性 包 涵 体 ; 在 PD患 者 以 及 6 0岁 以 上 、 α图 1 0 免疫荧光双标使用 3D 5 显示 2S yn 与 N P Y在脊髓背侧的分布 F ig. 1 0 D o u b le im m u no fluo re sce n t la be ling by 3D 5 a n d N P Y a n tibo d ie s () ()The do rsa l ho rn of a tho rac ic co rd sec tion wa s labe led by 3D5 A and N PY B μ an tibod ies, C is the m erging of A and B; Sca le ba rs = 100 m. of comm e rc ia lly ava ilab le an ti2a lp ha2synuc le in an tibod ie s 没有 PD 症状的老年人胸腰髓中间外侧角的自主神经 [ 5 ] [ J ]. N eu rop a tho l App l N eu rob io l, 2006 , 32: 3512356. α核中亦可以检测到 2Syn収生病理改发 ,这些区域 Yu S, L i X, L iu G, e t a l. Exten sive nuc lea r loca liza tion of [ 7 ] α均是 2Syn 表达量较高的部位 。本研究结果为揭示 a lp ha2synuc le in in no rm a l ra t b ra in neu ron s revea led by a PD 収病机制提供了一些证据 。 nove l monoc lona l an tibody [ J ]. N eu ro sc ience, 2007 , 145: 致谢 :感谢首都医科大学宣武医院中心实验室徐5392555. 艳玲老师在使用共聚焦显微镜时给予的帮助和指导 。Tinazzi M , de l V e sco C, F inca ti E, e t a l. Pa in and mo to r [ 8 ] comp lica tion s in Pa rk in son’s d isea se [ J ]. J N eu ro l N eu ro2 4 参考文献 su rg P sych ia try, 2006, 77: 822 2825. [ 1 ] L avedan C. The synuc le in fam ily[ J ]. Genom e R e s, 1998 , Single ton A , Gw inn2H a rdy K, Sha rab i Y, e t a l. A ssoc ia2 [ 9 ] 8: 8712880. tion be tween ca rd iac dene rva tion and p a rk in son ism cau sed Kim C, L ee S J. Con tro lling the m a ss ac tion of a lp ha2synu2 [ 2 ] by a lp ha2synuc le in gene trip lica tion [ J ]. B ra in, 2004 , 127: c le in in Pa rk in son’s d isea se [ J ]. J N eu rochem , 2008, 107:7682772. 303 2316. 2H a llin Z, Xu X J. N eu rop ep tide in neu rop a th ic [ 10 ] W ie senfe ld α[ 3 ] Sp illan tin i M G, Schm id t M L , L ee V M , e t a l. 2p a in and inflamm a to ry p a in w ith sp ec ia l emp ha sis on cho le2 Synuc le in in lewy bod ie s[ J ]. N a tu re, 1997, 388: 839 2840. cystok in in and ga lan in [ J ]. Eu r J Pha rm aco l, 2001 , 492: B raak H , Boh l J R , M u lle r C M , e t a l. Stan ley Fahn L ec2 [ 4 ] 49 259. tu re 2005: The staging p rocedu re fo r the inc lu sion body p a2 [ 11 ] Mou ssa C E, W e rsinge r C, Tom ita Y, e t a l. D iffe ren tia l tho logy a ssoc ia ted w ith spo rad ic Pa rk in son’s d isea se recon2 cyto toxic ity of hum an w ild typ e and m u tan t a lp ha2synuc le in side red [ J ]. Mov D iso rd, 2005, 21: 2042 22051. in hum an neu rob la stom a SH 2SY5 Y ce lls in the p re sence of Klo s K J , A h lskog J E, Jo sep h s K A , e t a l. A lp ha2synuc le2 [ 5 ] dop am ine [ J ]. B iochem istry, 2004 , 43: 553925550. in p a tho logy in the sp ina l co rd s of neu ro logica lly a symp to2 ()收稿日期 : 2009 207 216 m a tic aged ind ividua ls [ J ]. N eu ro logy, 2006, 66: 11002 编辑 李菁锦 1102. C ro isie r E, MR e s D E, D ep rez M , e t a l. Comp a ra tive study [ 6 ]