转录后加工

转录后加工 多数转录的初始产物无生物活性，在生物体内进行加工处理后才具有生物活性。 转录后加工（post-transcriptional modification）（ post-transcriptional processing）: 是指将各种前体RNA分子加工转变成有功能的、成熟的各种RNA(mRNA、rRNA或tRNA等) 的过程。 加工的三种形式是： ? 减少部分片段：如切除5?端前导序列，3?端尾巴和中部的内含子； ? 增加部分片段：5?加帽，3?加ploy(A)和通过编辑加入一些碱基； ?修饰：对某些碱基进行甲基化等 tRNA rRNA 一、原核生物 tRNA 和 rRNA 的加工 1. tRNA加工 原核生物tRNA初始转录本有三种： （1）多数为串连在一起的多顺反子（polycistron） （2）少数为单顺反子 （3）由tRNA和rRNA串连组成 原核生物有两种类型的tRNA基因： ?型：具CCA序列，tRNA 的CCA下游仍有一段序列，需在酶的作用下切除 ?型：无CCA序列，tRNA需在酶的作用下添加CCA序列 216 Indicates endonucleolytic cut Indicates exonucleolytic trimming tRNA nucleotidyl transferase The tRNA 3? end is generated by cutting and trimming followed by addition of CCA; the 5? end is generated by cutting. （1）RNaseP (由蛋白质和RNA组成的复合体)可切除E.coli前体tRNA 5?的前导序列（41nt）。该酶不识别特 殊的序列，而是识别二级结构——发夹所组成的tRNA。 （2）去尾，形成3?－OH末端。由内切酶和外切酶共同参与。 （3）修饰：在前体的一些专一部位的碱基需要通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用进行修饰 成为特殊的碱基 217 2. rRNA的加工 在E.coli中rRNA有7个转录单位，每个转录单位含有16S、23S、5S rRNA 及一个或几个tRNA，rRNA前体的加工由RNase ?负责。 218 （二）真核生物 tRNA 和 rRNA的加工 1. tRNA的加工：真核tRNA的基因与原核不同： , 真核的前体分子 tRNA数目多、单顺反子、成簇排列、有基因间隔区，例如 爪蟾 tRNA基因数目＞200 拷贝，酵母约有400个tRNA基因，是一种重复序列； , 真核的前体分子 tRNA中含有内含子。 , 其加工过程要剪接内含子，都要加CCA 219 Phe base The intron in yeast tRNApairs with the anticodon to change the structure of the anticodon arm. Pairing between an excluded base in the stem and the intron loop in the precursor may be required for splicing. 酵母tRNA前体的体外剪接： 在未处理前电泳只出现一条，带加入核酸内切酶出现两条带： Splicing of yeast tRNA in vitro can be followed by assyung the RNA precursor and products by gel electrophoresis. Splicing of tRNA requires separate nuclease and ligase activities. The exon-intron boundaries are cleaved by the nuclease to generate 2’,3’-cyclic phosphate and 5’-termini. The cyclic tRNA phosphate is opened to generate 3’-OH and 2’-phosphate groups.The 5’-OH is phosphorylated. After releasing the intron, the tRNA half molecules fold into a tRNA-like structure that now has a 3’-OH, 5’-P break. This is sealed by a ligase. 220 真核tRNA内含子的切除和其他内含子的切除是不同的： 没有交界序列，没有内部引导序列; 切除是依赖于蛋白质的RNase; 不是转酯反应； 其剪切原则上是依赖于对tRNA共同的二级结构的识别。 The 3’ and 5’ cleavages in S. cerevisiae pre-tRNA are catalyzed by different subunits of the endonuclease. Another subunit may determine location of the cleavage sites by measuring distance from the mature structure. The Al base pair is also important. 2.真核rRNA的加工 真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因串联在一起形成一个转录本，初级转录本为45S前体，5S RNA与它们分开转录，这和原核的rRNA基因不同。真核rRNA基因中没有内含子。 在转录时或转录后有110个甲基化酶立即结合到转录本上：保持到rRNA加工成熟。18S RNA结合39个甲基化酶（胞质中加上4个），28S RNA结合74个甲基化酶， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明甲基化用于标明转录本的加工区域 Mature eukaryotic rRNAs are generated by cleavage and trimming events from a primary transcript. 221 A snoRNA base pairs with a region of rRNA that is to be methylated. 二、前体mRNA的加工 （一）原核前体mRNA的加工 原核生物的mRNA一般不经过加工，由于转录和翻译偶联，中间没有加工的时间。少数情况：多顺反 子mRNA先被内切酶切成较小的单位再作为翻译的模板。 （二）真核mRNA的加工 真核mRNA的加工一般要经过四个步骤：mRNA的5?端加帽；mRNA的3?端多聚腺苷酸化（加尾）；切除内含子；修饰（对某些碱基进行甲基化） 1. mRNA的5'加帽 成熟的真核生物并没有游离的5?端，只有所谓的帽子结构，该结构是通过转录加工加上去的。 222 mRNA的5?加帽是一个多步加工过程，第一步是鸟苷转移酶（guanylyl transferase）将一个鸟苷酸加在5’ RNA的前端，产生5’-5’对接的磷酸二酯键。第二步由鸟嘌呤甲基转移酶（guanine methyl transferase）将一个甲基基团加到嘌呤环的7位氮原子使5„帽子鸟嘌呤转变为7-甲基鸟嘌呤。 真核生物的帽子结构有三类 Type 0 cap: m7GpppX Type?cap: m7GpppXm Type?cap: m7GpppXmYm mRNA 5'加帽的功能主要表现在4个方面： 1）保护mRNA5?端不被降解 细胞内存在许多RNA酶（RNase），它们可攻击游离的RNA分子。 RNA酶的降解从5'端起始， 当在mRNA的5'端加上m7GpppG帽子后，带有3个连接磷酸的5'帽可阻止RNase切割。 2）为核糖体识别mRNA提供信号，提高翻译效率 真核生物mRNA必须通过5'帽结合蛋白才能接触核糖 体，起始翻译。缺少加帽的mRNA由于不能被5'帽结合蛋白识别，其翻译效率比加帽的mRNA低二十倍。 3）作为进出细胞核的识别标记。凡由Pol II转录的RNA均在5'端加帽，包括snRNA，这是RNA分子进出细胞核的识别标记。大多数snRNA转录后在细胞核中接收5'端单甲基m7G加帽，然后转移到细胞质与 223 snRNP蛋白结合。在细胞质中snRNA 5'帽需再修饰成为三甲基带帽结构m2，2，7G，随后重新返回细胞核参与mRNA的剪接加工。U6 snRNA由PolII转录，在其5'端保留的三磷酸基团无帽子结构，因而不能输出细胞 核。某些突变型中被输送到细胞质中的snRNA由于不能合成三甲基带帽结构，不能返回细胞核。 4） 提高mRNA的剪接效率。5'帽结合蛋白涉及第一个内含子剪接复合物的形成，直接影响mRNA的剪接效率 2.加尾（mRNA 的3?端多聚腺苷酸化）： 几乎所有真核生物成熟的mRNA末端都有一串约250个腺嘌呤核苷酸尾巴。它们并非模板DNA编码，而是在转录完成后由poly (A) 多聚酶合成。加尾位置不在转录物的最末端，而是在接近末端的内部位点。在 切除mRNA 3'末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。 真核生物mRNA poly (A)长度并非固定不变。细胞核中的poly (A)长度平均为210?20 nt，细胞质poly (A )长度190?20 nt。输送到细胞质中的mRNA其poly (A)可由RNase切短，但又能经细胞质poly（A）酶重新加长，保持有限的长度。细胞质中mRNA的poly (A)长度总的趋势是逐渐变短，直到丢失大部分或全部poly（A），此时mRNA的寿命亦接近终点。 新合成的mRNA的3'-端含两个明显的加尾信号。第一个加尾信号位于poly (A)上游约10,20个核苷酸处。其一致顺序为5',AAUAAA,3'。该加尾信号中最多的变异发生在第二个碱基，其它位置的碱基代换将使Poly (A)加尾效率急剧下降。第二个加尾信号位于5',AAUAAA,3'顺序下游约15-24 bp位置处，有一段富GU序列，紧随其后通常有一串富T的顺序： 5'-AAUAAA-----24 bp----GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT--3' 224 如果改变5‘,AAUAAA,3?位置，加尾位点改变。 缺失5‘,AAUAAA,3?顺序，则不发生加尾。 富GU序列和紧随其后的富T序列对正常的加尾不可缺一，如保留富GU顺序，除去富T顺序，加尾效 率仅及对照的30%。 如保留富T顺序，除去富GU顺序，加尾效率降至10%。同时缺失GU序列和富T 序列，即使保留5',AAUAAA,3'顺序也不能进行加尾。此外，GU/T序列与5',AAUAAA,3'顺序的相对位 置也很重要，如在5',AAUAAA,3'顺序的下游插入16 bp，加尾效率只有正常的10%。如在GU序列和富 T序列之间插入5 bp，加尾效率丧失70%。 225 mRNA的多聚腺苷酸化： mRNA的多聚腺苷酸化涉及两个步骤，首先必须在加尾的核苷酸位置切断RNA，然后在游离的3'末端进行多聚腺苷酸化。有许多蛋白质参与poly(A)的加尾事件。参与Poly(A)加尾的蛋白质称为切割与多聚腺苷酸 化专性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF），CPSF专一性与加尾信号5',AAUAAA,3'结合。另一个蛋白即切割激发因子CstF（cleavage stimulation factor, CstF）特异附着在富GU区。因此CPSF和CstF实际结合的位置处于切割与多聚腺苷酸化位点两侧。CPSF或CstF单个因子与信号顺序结合都是不稳 定的，只有两者同时附着在两个信号位置才保持稳定状态。此外还有另两个蛋白对RNA的切割必不可少，它们分别是切割因子I和II（cleavage factors I and II， CFI和CFII），可与RNA结合。poly（A）多聚酶，CFI和CFII与RNA结合的位置处于两个加尾信号之间。虽然切割与加尾是两个性质不同的事件，但实际进行时 几乎同时发生，实验设计很难将其分开。 严格说来切割信号和加尾信号是不相同的。前体mRNA切割的位置处于5',AAUAAA,3'下游15-25 nt之间，由切割酶专一性识别。poly（A）多聚酶只是利用已产生的3'游离末端将腺苷酸逐个连接，加尾信号实 际上是5',AAUAAA,3'以及下游一段不能少于8 nt的顺序。一旦mRNA前体被切断之后，多聚腺苷酸化立即 开始。多聚腺苷酸化可细分为两个阶段，首先依赖5',AAUAAA,3'信号和与之结合的CPSF缓慢合成约10个核苷酸，然后依赖已合成的寡聚腺苷酸迅速在其末端加上200或更多个腺苷酸。 Cleavage of the 3? end ofhistone mRNA may require a small RNA ? Histone mRNAs are not polyadenylated; their 3 ? ends are generated by a cleavage reaction that depends on the 226 structure of the mRNA. ? The cleavage reaction requires the SLBP to bind to a stem-loop structure, and the U7 snRNA to pair with an adjacent single-stranded region. poly（A）的功能 1) 增加mRNA的稳定性 将携带或缺少poly（A）的球蛋白mRNA注入到蛙卵中，结果发现，在6小时后缺少poly（A）的球蛋白mRNA不再进行翻译，而携带poly（A）的处理仍然正常合成球蛋白。最简单 的解释是，poly（A）有助于增加mRNA的稳定性 2) 提高mRNA翻译效率 mRNA的翻译需要PAB I（poly（A） binding protein I，poly（A）结合蛋白I）的蛋白参与，它们与poly（A）的结合可提高mRNA的翻译效率。如果在mRNA样品中加入过量的poly（A），可急剧降低蛋白质合成的数量。原因在于大量poly（A）与PAB I因子竟争性结合，使mRNA缺少必需的PAB I，因而不能有效翻译。此外适当延长poly（A）核苷酸数目可控制mRNA的翻译。活细胞中很少mRNA的poly（A）长度少于30 nt，低于这一长度mRNA不能翻译。 3) poly（A）可影响mRNA前体最后一个内含子的剪切，缺少poly（A）使剪接效率降低5-10倍。 RNA 转录后加工是产生各种成熟RNA分子的重要过程（图70），一个基因的外显子和内含子共同转录在一 条转录产物中，然后将内含子去除而把外显子连接起来形成成熟的RNA分子，这一过程称为RNA剪接（RNA splicing）。 227 内含子的去除及RNA的剪接基本有三种方式： 1.在高等真核生物，核RNA内含子的去除由剪接装置(splicing apparatus)完成，在外显子和内含子交界处和内 含子内部有可供识别的特异序列，剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组成； 2.有两类内含子的去除属自剪接，具有中部核心结构，形成特定的二级结构，RNA具有催化剪接的作用； 3.酵母tRNA的剪接需要蛋白质酶的参与，该酶与tRNA后加工过程中的酶有相似之处。除tRNA的剪接之外， 其他RNA的剪接尽管参与反应的要素不同，但都属于转酯反应。 一、核酶 核酶(ribozyme)有的译为核糖拟酶，核酶等，核酶是T．Cech和S．Altman(1981年)在研究四膜虫rRNA时发 现的，1982年T．Cech由核糖核酸(ribonucleic acid)和酶(enzyme)这两个词“重组”成一个新的词：“ribozyme”， 它是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类物质，这类物质具有催化功能，但和酶又有区别， 主要表明在两个方面： ?一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA； ?核酶既是催化剂又是底物，随着反应的进行，本身也消失了。而酶却不同，仅催化反应，反应前后其本身 的质和量都不发生改变。 Reactions catalyzed by RNA have the same features as those catalyzed by proteins, although the rate is slower. The K gives the concentration of substrate required for half-maximum velocity; M this is an inverse measure of the affinity of the enzyme for substrate. The turnover number gives 228 the number of substrate molecules transformed in unit time by a single catalytic site. 核酶催化的反应分为自体催化和半自体催化两类： 自体催化包括：?第一组内含子的自我剪接； ?第二组内含子的自我剪切； ?植物类病毒和拟病毒的自我剪切。 半自体催化包括：?核mRNA内含子的剪切； ?锥虫SLRNA的反式拼接； ?tRNA 5„加工，此项不属于转酯反应内含子的剪接，但也是核酶的活性之一。 除核酶之外，核酸酶和由内含子本身编码的成熟酶也参与某些内含子的剪切，如真核tRNA内含子和酵母cob基因的内含子2的剪接。 二、内含子的边界顺序及类型 1.内含子的边界顺序由保守的基序组成 The ends of nuclear introns are defined by the GU-AG rule. 比较大量的真核生物mRNA内含子发现，它们的两侧边界均有一对保守顺序，即5'-端为GU，3'-端为AG，这类称为GU,AG的内含子均以相同方式剪切。在不同的真核生物中，内含子的一致顺序有不少变化， 动物中典型的剪接位置一致顺序组成为： 5',AG,GUAAGU--------------YNYURAY--Y10-20--YAG,,3' 其中Y为U或C，N为任何核苷酸，箭头所指为外显子与内含子的交界。5?端剪接位称供体位（donor site），3?端剪接位称受体位（acceptor site）。仅仅GU,AG边界顺序并不能保证内含子的正确剪切，因为在内含子中 有不少相同的GU,AG顺序。内含子中还有另一段识别剪接边界必不可少的序列称为分枝点，位于3„-端剪接位的上游，具有特征性组成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接时参与形成分枝的特别位点。紧接在分枝点的下游有一段多嘧啶序列，也是参与剪接事件蛋白接合的位置。酵母中 分枝点序列为5’,UACUAAC,3„，位于3?剪接位上游18到140 bp之间，其作用不同于高等真核生物。 2.内含子的类型 类 型 分 布 GU-AG内含子 真核生物细胞核前体mRNA AU-AC内含子 真核生物细胞核前体mRNA I型（Group ?）内含子 真核生物细胞核前体mRNA，细胞器RNA,少数细菌RNA II型（Group ?）内含子 细胞器RNA，某些原核RNA III型（ Group ?）内含子 细胞器RNA 229 孪生内含子（Twintron） 细胞器RNA 前体tRNA内含子 真核生物细胞核前体tRNA 古细菌内含子 不同的RNA 三、剪接 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 snRNAs的参与 在高等生物中都含有很多不连接的小分子RNA片段，限制在核内的称为小分子核内RNA (small nuclear RNAs，snRNAs)。在细胞质的称为小分子胞质内RNA（small cytoplasmic RNAs，scRNA)，在自然状态下，它们以核糖核蛋白（RNP）的形式存在。剪接装置中的snRNPs和大量的附加蛋白，常称为剪接因子。 在剪接过程中有5种snRNAs (small nuclear RNAs)参加，它们是U1、U2、U5、U4、和U6。 5种 snRNAs+proteins?The snRNPs? splicesome The splicesome is 12 MDa. 5 snRNAPs account for almost half of the mass. The remaining proteins include known splicing factors and also proteins that are involved on other stages of gene expression. U1 snRNA自我配对形成了多个茎环结构，从而构成了不同的功能区。Sm结合位点是和其他snRNP相互作用的区域。其5’端有一保守序列： 3?CAUUCAU5? 这一序列可与核mRNA内含子5?端的边界序列互补结合，这对于剪接反应是很重要的。 U1 snRNA has a base paired structure that creates several domains. The 5’ end remains single stranded and can base pair with the 5’ splicing site. U2与分枝点配对；U6与mRNA 5?端配对；U5 使两个外显子靠拢 230 U6 snRNA既能与U4配对也能与U2配对 231 四 核mRNA的剪接 核mRNA的剪接过程和?类内含子十分相似，根本区别是：核mRNA前体本身不能形成二级结构，必需依赖于snRNP(U1,U2,U4,U5和U6)的帮助才能形成剪接体，进行自我剪接。 结构特点： 边界顺序完全符合GU-AG法则 含分枝点序列 内含子5?端保守序列（5?GUAAGUA3?）和U1snRNA的5?端保守序列 3?CAUUCAU5?互补 剪接 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 ： 232 在剪接体的作用下通过转酯反应而完成，形成一个套索（lariat）结构和剪接了的外显子，snRNP的剪接 功能和反应步骤是： U1结合?形成E complex ?A complex(U2结合) ?B1 complex ? B2 complex ? C1complex ?C2 complex The commitment(E) complex forms by the successive addition of U1 snRNP to the 5’ splice site, U2AF to the pyrimidne tract/3’ splice site, and the bridging protein SF1/BBP. The first complex formed during splicing is the E (early presplicing) complex, which contains U1 snRNP, the splicing factor U2AF, and members of a family called SR proteins, which comprise an important group of splicing factors and regulators. 233 E complex + U2 A complex (U2 ) B1 complex (U5/U4/U6 U5 5’U6U2) B2 complex (U1,U5 U6 5’) C1 complex ( U4,U6/U4U5 3’.5’ ) C2 complex (U2/U5/U6 3’ ) RNA, RNA splicing 五 ?类内含子及其剪接 1.发现 Cech et al. 1981，研究四膜虫（Tetrahymena thermophila） 35S的前体 rRNA（含有413nt 的内含子），在体外能够进行自我剪接： 234 2.分布： ?类内含子常分布于低等真核生物的细胞器中，如四膜虫的rRNA；大部分真菌如酵母的mtDNA；植物叶绿体基因的内含子；T4噬菌体的3个基因中也存在?类内含子。 3.结构特点： 边界序列为5?U——G3? 内含子中有中部核心结构(central core stucture) 内部引导序列（internal guide sequenece,IGS） ?类内含子有一个共同的二级结构，共9个配对区（P1—P9），其中P4和P7是?类内含子中共有的保守序列。P4由P和Q序列形成，长10nt，配对碱基6－7对。P7由R和S序列构成，长12nt，5对碱基配对。P3，P4，P6和P7是核心结构，是可以执行催化的最小区域。其他的配对区在不同的内含子中是不同的。 235 内部引导序列（ internal guide sequenece，IGS ）： 1982年由Davies提出， 由6个nt组成，GGAGGG （四膜虫）。内含子中可 与外显子配对的序列称 为内部引导区。最初认为 IGS的作用是通过和两个 外显子近侧区配对，使外 显子并在一起，现在认为 其作用是决定剪接的专 一性。 ?类内含子的剪接机制： 自剪接（self-splicing）反应，通过3次连续的转酯反应完成。只是磷酸酯键的直接转移，没有水解，不 需能量。 Self-splicing occurs by transesterieatio n reactions in which bonds are exchanged directly. The bonds that have been generated at each stage are indicated by the shaded boxes. 由于内含子自身形成特定的二级三级结构，从而产生适于剪接反应的空间构象和活性位点，相当于传统 236 酶的激活位点，即G苷酸结合位点和底物结合位点，后者依赖于IGS的配对来确定。G的参与完成剪接反应。即剪接反应完全由内含子自身完成。 The excised intron can form circles by using either of two internal sites for reaction with the 5’ end, and can reopen the circles by reaction with water or oligonucleotides. 237 The position of the IGS in the tertiary structure changes when P1 is formed by substrate binding. The L-19 linear RNA can bind C in the substrate-binding site; the reactive G-OH 3’ end is located in the G-binding site, and catalyzes transfer reactions that convert 2 C5 oligonucleotides into a C4 and a C6 oligonucleotide. 238 Catalytic reactions of the ribozyme involve transesterifications between a group in the substrate-binding site and a group in the G-binding site. 239 六 ?类内含子的剪接 ?类内含子的剪接和?类内含子不同，而和核mRNA内含子的剪切有些相似。 分布：在酵母mtRNA,细胞色素氧化酶的a亚基、b亚基，玉米mtRNA、tRNA以及真核mRNA前体中。 边界序列为5??GUGCG- - -YnAG?,符合GT—AG法则。 二级结构：形成6个茎环结构，使两个并列的功能区靠近。功能区5和功能区6被两个碱基隔开。功能区6含有1个不配对A残基，其上带有2－OH，发动第一次转酯反应。 与前所叙的核基因mRNA的剪接过程相比，?类内含子的最大特定是不需要其他成分的参与，RNA分子本身能形成剪接所需的空间结构和催化活性区域。在核基因mRNA的剪接过程中，需要多种成分特别是 snRNA与RNA前体共同作用才能形成剪接所需的空间结构，产生具催化功能的区域。 ?类内含子的剪接机制 240 二、顺式剪接（cis-splicing） 内含子的剪接一般都是发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接，称为顺式剪接。 对很多基因而言，RNA剪接是一个不变的加工过程。基因转录时所有细胞中产生同样的成熟转录本及单 种产物。这称为组成型剪接(constructive splicing)。 其他一些基因，RNA剪接可以作为基因调节的机制，也就是说在两种组织中同一基因表达不同，尽管它 以相同的方式和速度转录。这样的调节以两种方式发生。 第一种情况: 加工或去除调节(processing or discard regulation)：初始转录本在一些组织中加工，在其他 组织中不剪接。在有些低等真核生物中(如海胆)，这是主要调节机制。大部分基因在大部分组织中转录，由 RNA加工调节来决定那些基因被翻译。在果蝇中，一个类似的机制用来控制P因子转座酶的合成，在这种情况下虽然只有一个内含子未被剪接，但却限制了P因子转座，只发生在生殖细胞中。转座酶基因包含三个内 含子，在生殖细胞中产生成熟的编码转座酶的转录本，然而在其他组织中，第三个含终止密码子的内含子被 保留，使转座酶蛋白截短，从而阻止体细胞中P因子的转座。内源性基因也用同样的策略，如哺乳动物GABAA受体E亚基的mRNA前体除了脑以外其他组织都不剪接。 第二种情况: 差别或选择性剪接 (differential or alternative splicing)：基本转录体通过选择使用外显子以不同 方式加工相关成熟转录体家族产生不同基因产物，称为剪接变异体(splicevariants)或剪接异构体(spliceisoforms)。 可变剪接产生多种RNA： 241 Alternative forms of splicing may generate a variety of protein products from an individual gene.Changing the splice site may introduce termination codons or change reading frames. Alternative splicing events that involve both sites may cause exons to be added or substitute. 选择性剪接以多种方式进行： (1)利用不同的外显子：由于不同细胞类型有着不同修饰的反式因子，导致利用不同的外显子。例如动物细胞 的原肌球蛋白(atropomyosin)基因有13个外显子(图3—13。) (2)两个相互排斥的外显子的剪接：有两类外显子对，每对之中只有一个成员能剪接到成熟的mRNA中，看来 像是相互排斥似的。如图3—13b，降钙素(calcitonin)和降钙素基因相关肽(calcitoningenerelatedpeptide，CGRP) 分别利用相邻的两个外显子，得到的两种产物分别为甲状腺和神经元细胞中所特有。 242 (3)半个起始位点，多个加poly(A)位点： 一些真核病毒转录物存在多至5个这样的位点(Tsurshita, l988)。对于一个有两个加poly(A)位点的转录物，大多数细胞类型通过利用内侧的位点产生分泌型的蛋白，一些分化的细 胞类型其产物是膜蛋白的转录物，则利用外侧的位点产生具有膜锚序列的膜结合蛋白。还是用降钙素和CGRP的例子(图3—13b)，前者利用内侧的加poly(A)位点，后者则利用外侧的。可能存在某种细胞类型特异的反式 激活因子提高外侧位点的利用效率。 (4)多个5?剪接位点竞争同一3?剪接位点：有一些基因含有多个5?剪接位点，它们的选择依赖于5?剪接位点的强度(高度适配者强)、与3?剪接位点的接近程度、空间限制等因素之间的平衡。在大多数细胞类型中将选择 上游的5?剪接位点，而使处于下游的5?剪接位点无效，主要是因为后者与分叉点的距离一般太近而不利于建 立剪接体之故(Noble l988)。也有的分别利用不同的5?剪接位点，得到不同的产物(图3—13c)。 (5)内含子保留和框式外显子：有的情况下，一个内含子不被剪接而保留下来，如果维持可读框架，便是一个 多肽片段的插入；如果移格，便会产生功能不同的产物或者关掉基因的表达。所谓盒式外显子是指那些与其 他邻近的外显子的剪接无关而独立剪接的外显子。当几个盒式外显子存在于同一个转录物中，其产物会产生 高度的趋异，如一个基因含有5个盒式外显子，再加上一对相互排斥的外显子，在理论上可以生64种同工型多肽。如图3—13d所示，肌钙蛋白T有13个外显子，编码259个氨基酸残基，然而此蛋白的长度在体内不 同部位的肌肉中是不同的。有11个外显子(黑框)是所有mRNA都有的；外显子4—8(白框)则可自由组合(468，4、78，78等等)，共有32种可能性；外显子16和17(灰框)是相互排斥的，两者只能有一个出现在成熟的蛋 白质中。这样，总共就有64种可能的mRNA。真核基因存在5个以上的外显子是常有的，甚至多达37个外显子， 由此产生蛋白质的多样性是十分丰富的 (6)非剪接位点的序列参与调节：一些真核生物的病毒RNA其初级转录物即使有正确的功能剪接位点，有时 243 也会有一部分甚至大部分不发生剪接(ArrigoandBeemon1988)。这是由于其内含子中存在一种负调节元件使剪接无效，也有的基因在外显子中存在一些促进和抑制剪接的序列。 顺式剪接机理： 剪接体/拼接体的装配： 1、 U1 snRNP与5?剪接位点结合 2、 U2 snRNP与分枝点结合 3、 U4/U6和U5snRNP结合上 4、 最后形成剪接体，U5既与5?剪接位点也与3?剪接位点结合。 U群snRNA+多肽?snRNP U群snRNA是一群丰富的小分子RNA,其序列进化上相对保守，但通过转录后碱基修饰会导致其二级结构的 改变，因而构成不同功能的snRNP,使之识别和竞争不同的剪接位点。 参加剪接反应的蛋白质因子有两种类型： 一类结合在UsnRNA上形成snRNP复合物，例如Sm蛋白，共同地与U1、U2、U5 snRNA紧密结合； U1 snRNP中有3种而U5snRNP有7种蛋白紧密地与之特异结合。另外，还有一些蛋白暂时地与snRNP组分 244 相互作用并起着特殊的作用，它们是一些RNA依赖的ATPase和螺旋酶，如酵母的PRP24促进U4—U6复合物的形成，PRP4通过蛋白—蛋白相互作用结合U4—U6snRNP和U5snRNP形成上述的三元snRNP复合物；PRP8与U5snRNP结合并和3?剪接位点相互作用。这些蛋白的一部分基序结合到RNA上，另一部分结合到蛋白质上形成蛋白“桥”，介导RNA-RNA相互作用，以及剪接体构象改变，通过决定构象改变的计时来影响 剪接。 另一类是一些结构相关进化上保守的蛋白质因子，称之为SR(SRP)家族。已发现此家族的成员有SRP20、SRP30a、(SF2／ASF)、SRP30b(PR264／SC35)、SRP40、SRP55、SRP70～75(数字表示分子质量，kDa)，这些蛋白的N端有一个共同的基序(RRM或RBD)识别和结合RNA；其C端长度变化， 由交替的丝氨酸和精氨酸残基组成的结构域可能和结合特异性有关。这些蛋白在剪接过程早期起着帮助前mRNA投入剪接，后期护送snRNP加入剪接体，在剪接的两步反应中一直与剪接体缔合。由于这些蛋白因子的表达量是组织特异的， 而它们存在的量和剪接位点的选择又相关，因而不同的SRP蛋白对不同的剪接位点的优先利用表现为一种组 织特异性。SRP蛋白在离体剪接中都表现出活性的互补，但不同的SRP蛋白有其保守性， 又说明每种SRP蛋白应有其不同的功能。 三、反式剪接(trans—splicing) 前面讨论的剪接过程都是发生在一个RNA分子内部，即通过剪接将一个RNA分子内的内含子剪掉，使外显子连接在一起——顺式剪接(cis-splicing) 。 但也有另外一种情况，即不同基因的外显子剪接后相互连接，此称为反式剪接（trans-splicing），已发现，在锥虫、线虫以及植物的叶绿体中发生两个RNA分子之间的剪接，即反式剪接。 245 反式剪接是以两种不同来源的RNA前体分子作为底物。反式剪接的5?端外显子称为剪接前导RNA(spliced leader RNA，SL RNA)。经过剪接在成熟的mRNA非翻译部分5?端剪接上一小段称为“剪接前导序列(spliced leader，SL)”或“小外显子(mini-exon)”的RNA片段。这些片段本来并不存在于相应的编码基因前 面，而是由其他DNA链转录而来。已发现的各种SL RNA有一些共同的特点：都折叠成一种相同的二级结构， 此结构有3个茎—环(stem-loop)和一个单链区，此单链区类似于U1的Sm结合位点。因此，SL RNAs存在和snRNPs相似的形式。 246 四、Protein splicing is autocatalytic Protein splicing (蛋白质剪接)is the autocatalytic process by which an intein is removed from a protein and the exteins on either side become connected by a standard peptide bond. Extein (外蛋白子)sequences remain in the mature protein that is produced by processing a precursor via protein splicing. An intein（内蛋白子） is the part that is removed from a protein that is processed by protein splicing. 1994年 Perler等首先提出 247 蛋白内含子又称为内蛋白子（intein）是一种翻译后加工的产物。蛋白外显子又称为外蛋白子（extein）. 内蛋白子的基因不是单独的开放阅读框（ORF），它是插入在外蛋白子的基因中，和内含子的区别在于它可以和外蛋白子的基因一道表达，而不是mRNA阶段被切除，它在产生前体蛋白以后再从前体中被切除掉，余下的外蛋白子连接在一起成为成熟的蛋白。 Figure 26.24 shows that the gene is translated into a protein precursor that contains the intein, and then the intein is excised from the protein. About 100 examples of protein splicing are known, spread through all classes of organisms. The typical gene whose product undergoes protein splicing has a single intein. 内蛋白子的基因除了上下代的垂直传递以外，还可以通过基因的转变而进行水平传递，被称为内蛋白子归巢 （intein homing）. 发现的内蛋白子有7种，多分布于酵母和微生物中，内蛋白子的分子量为40－60kDa,有高度保守的末端 氨基酸：N-端常为Cys或Ser,C-端总是His-Asn. 内蛋白子未剪切前称为融合内蛋白子（fused intein）,可催化前体的自我剪接反应；剪切后的内蛋白子称为游离内蛋白子（free intein）,可以作为归巢内切酶（homing endonuclease）参与内蛋白子的归巢。它可识别DNA 上内蛋白子基因在外蛋白子基因子的插入位点 Protein splicing has the same effect as RNA splicing: a sequence that is represented within the gene fails to be represented in the protein. The parts of the protein are named by analogy with RNA splicing: exteins are the sequences that are represented in the mature protein, and inteins are the sequences that are removed. The mechanism of removing the intein is completely different from RNA splicing. 248 The first reaction is an attack by an -OH or -SH side chain of the first amino acid in the intein on the peptide bond that connects it to the first extein. This transfers the extein from the amino-terminal group of the intein to an N-O or N-S acyl connection. Then this bond is attacked by the -OH or -SH side chain of the first amino acid in the second extein. The result is to transfer extein1 to the side chain of the amino-terminal acid of extein2. Finally, the C-terminal asparagine of the intein cyclizes, and the terminal NH of extein2 attacks the acyl bond to replace it with a conventional peptide bond. Each of these reactions can occur spontaneously at very low rates, but their occurrence in a coordinate manner rapidly enough to achieve protein splicing requires catalysis by the intein Inteins have characteristic features. They are found as in-frame insertions （符合读框的插入）into coding sequences. They can be recognized as such because of the existence of homologous genes that lack the insertion. They have an N-terminal serine or cysteine (to provide the -XH side chain) and a C-terminal asparagine. A typical intein has a sequence of ~150 amino acids at the N-terminal end and ~50 amino acids at the C-terminal end that are involved in catalyzing the protein splicing reaction. The sequence in the center of the intein can have other functions. An extraordinary feature of many inteins is that they have homing endonuclease activity. A homing endonuclease cleaves a target DNA to create a site into which the DNA sequence coding for the intein can be inserted . The protein splicing and homing endonuclease activities of an intein are independent 249