小鼠细胞因子趋化因子磁珠试剂盒

小鼠细胞因子趋化因子磁珠试剂盒 ? MILLIPLEXMAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠试剂盒 96孔板分析 # MCYTOMAG-70K 或 plex) # MCYTOMAG-70K-PMX (预混合 25 #MCYTMAG-70K-PX32 (预混合32 plex) 前言 “细胞因子”是不同类型的可溶性蛋白质和多肽，能在正常或病理条件下调节细胞和组织的功能活性。这些蛋白质同样介导细胞间直接的相互作用，调节过程发生在细胞外环境中。细胞因子与激素不同的是它们作用的靶细胞范围更广。与激素不同，它们不是由特定腺体中特定的细胞产生的。细胞因子包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子和趋化因子。细胞因子和趋化因子对深入了解免疫系统和抗原的多面性应答以及疾病状态例如炎症性疾病、变态反应、应激性肠病(IBD)、败血症和癌症都具有重要意义。 为了鉴定炎症或免疫应答中特定的细胞因子，需要经过筛选的过程，这常常 通量。磁珠可以使这个过程自动化和高通量筛查更需要多水平的自动化和(或)高 容易。除了自动化以外还包括: , 更加灵活的板和洗板选择 , 改进高浓度血清或血浆标本的检测 , 分析结果与非磁珠方法相当 , 自动清洗消除真空多功能/手工清洗过程中的技术障碍(例如粘性标本堵孔) ? 因此，MILLIPLEXMAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠试剂能够使你关注细胞因子的治疗潜能以及调节细胞因子的表达。在Luminex xMAP? 平台加上磁珠版式，你将获得理想的速度和灵敏度的优势，能同时定量检测多种分析物，从而显著提高检测效率。 ?MILLIPLEX MAP 小鼠细胞因子/趋化因子磁珠试剂是研究细胞因子和趋化因子最通用的系统。 , MILLIPLEX MAP 可以使你: 选择 25-plex 或32-plex 预混合的试剂盒或 从32种分析物板中选择任意组合设计用户需要的试剂盒 , 方便的“合为一体”盒样式，保证你拥有进行分析所需要的所有试剂。 ?MILLIPLEX MAP 的小鼠细胞因子/趋化因子磁珠试剂盒可以同时用来定量检测以下32种细胞因子和趋化因子:Eotaxin， G-CSF， GM-CSF， IFNγ， IL-1α， IL-1β， IL-2， IL-3， IL-4， IL-5， IL-6， IL-7， IL-9， IL-10， IL-12 (p40)， IL-12 (p70)， IL-13， IL-15， IL-17， IP-10， KC， LIF， LIX， MCP-1， M-CSF， MIG， MIP-1ɑ，MIP-1β， MIP-2， RANTES， TNFα和 VEGF。 原理 MILLIPLEX MAP 基于Luminex? xMAP? 技术——是发展最迅速、最令人敬佩的多种技术之一，提供的应用遍及生命科学而且能够用于多种生物分析，包 TM括表面标记荧光的磁珠免疫分析，已知的MagPlex-C的微磁珠。 , Luminex? 专利技术使用含有两种荧光染料的内在颜色编码微球。这些染料 具有准确的浓度，能够制造100种不同颜色的珠子，每个珠子上都包被有特 异性的捕获抗体。 , 检测样本中的分析物被珠子捕获后，加入生物素标记的检测抗体。 , 反应复合物与链霉亲和素-PE结合、孵育，链霉亲和素-PE是完成每个微球 表面反应的报分子。 , 微球迅速通过第一种激光，激发微球标记的内部染料。第二种激光激发 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 分子上的荧光染料——PE。 , 最后，高速数字信号处理识别每个微球，通过荧光报告信号定量生物分析的 结果。 给每个标本加多种包被的珠子可以从每个标本得到多种结果。开放式结构xMAP?技术使多种类型的生物分析联合使用，比传统方法节省时间、人力和成本。 收到试剂后立刻储存的条件 , 试剂盒成分推荐的储存温度为2-8 ?。 , 标准品和质控品一旦复溶，立即转移到聚丙烯瓶。不要将标准品或质控品储 存在玻璃瓶。若要长时间储存，将复溶的标准品和质控品在 ?-20?冰冻。 避免多次(> 2)冻融。 , 不要冰冻抗体包被的珠子、检测抗体和链霉亲和素-藻红蛋白。 提供的试剂 注意:2 - 8?保存所有试剂 小鼠细胞因子/趋化因子抗体包被的预混合珠子: 内含根据用户选择分析的小鼠细胞因子/趋化因子抗体包被的珠子。 小鼠细胞因子/趋化因子抗体包被的珠子: 需要但没有提供的材料 试剂 1、Luminex鞘液(Luminex Catalogue #40-50000) or Luminex 驱动液(Luminex Catalogue # MPXDF-4PK) 方法/材料 1、可调节的带有枪头的可释放25-1000μL加样枪 2、多通加样枪，可释放5μL --50μL或25μL--200μL 3、试剂储存库 4、聚丙烯微量离心管 5、橡皮筋 6、铝箔 7、吸水垫 8、实验室旋涡混合器 9、超声波破碎仪(Branson Ultrasonic Cleaner Model# B200或相当的) 10、滴定板振荡器(Lab-Line Instruments Model# 4625或相当的) 11、装有Luminex公司xPONENT 软件的Luminex 200?， HTS， FLEXMAP 3D ? MAGPIX仪器 ? 或 12、磁珠自动洗板机(Bio-Tek ELx405， Millipore catalog #40-015或相当的) 或者手持式磁性分离块 (Millipore catalog # 40-285或相当的) 注意:如果没有磁珠洗板机或手持式磁性分离块，可以使用微量滴定滤板(Millipore Catalog# MX-PLATE)进行分析，可使用真空过滤装置(多通道微孔真空器Catalog #MSVMHTS00或相当的，还要有微孔真空泵Catalog# WP6111560或相当的) 安全警告 , 所有的血的成分和生物材料应该作为潜在的危险物质。当操作和处理传染性 病原体时应遵守疾病预防和控制中心及职业安全与健康管理局制定的通用 安全警告。 , 在某些试剂中加了叠氮化钠或Proclin作为防腐剂。虽然浓度低，但叠氮化 钠和Proclin可能与铅和铜管道发生反应，形成高度爆炸性的金属叠氮化物。 在处理上用大量的水冲洗以防止叠氮化物形成。 技术指导 为了获得可靠的和可重复的结果，操作者在做实验之前应仔细阅读整个手册并完全理解每个分析步骤的所有部分。以下注意事项应该在实验前回顾和理解。 , 仅用于研究。不适用于诊断操作。 , 超过标签上有效期的不要使用。 , 不要把本试剂与其它来源的试剂混合或用替代试剂。 , 抗体包被的珠子对光敏感，必须一直远离光线。在所有的孵育步骤中，用不 透明的板或者铝箔遮盖含有珠子的分析板。 , 所有的试剂在使用之前温度要达到室温(20 - 25?)。 , 不完全的洗涤会使测定结果相反。所有的清洗步骤必须使用提供的洗涤液。 , 水溶解后，所有标准品和质控品必须转移到聚丙烯管。 , 标准品的连续稀释必须在1小时内准备。丢弃任何未使用的标准品除了标准 品原料，它在?-20?可储存1个月，在?-80?可储存一个月以上。 , 如果标本结果超过了分析动态范围，可用适当的稀释液进一步稀释标本，重 复分析。 , 任何未使用的混合抗体包被的珠子在混合瓶里2 - 8?可储存一个月。 , 在准备标准曲线时，进行下一步稀释之前要充分混匀高浓度的孔。每次稀释 要使用新枪头。 , 分析完成后应立即读板。然而，如果不能立即读板，要封板，覆盖铝箔或不 透明的盖子，板在2 - 8?可储存24小时。读板之前，室温下，在震荡器上 摇动10分钟。延迟读板会降低某些细胞因子或趋化因子的灵敏度。 , 滴定板振荡器应设置成提供最大轨道的混合速度而没有液体溅到孔外。推荐 的板振荡器设置为5 – 7，大约是500 - 800 rpm。 , 确保探针是清洁的。这可以是通过超声处理和/或酒精冲洗完成。 , 当在 Luminex 200?上读分析时，根据Luminex 针对此试剂盒固体板推荐的 ，使用4 调整圆盘调整高度;当在FLEXMAP 3D?上读分析时，根据步骤 Luminex 针对此试剂盒固体板推荐的步骤，使用1调整圆盘调整高度;当在 MAGPIX上读分析结果，根据Luminex 针对此试剂盒固体板推荐的步骤， 用2调整圆盘调整高度。 使 , 对于细胞培养上清液或组织提取物，使用培养液或提取物介质作为本底、标 准品和质控品的基体溶液。如果标本用分析缓冲液稀释，则应使用分析缓冲 液作为基体溶液。 , 血清/血浆标本需要超过1:2进一步稀释时，要使用试剂盒提供的血清基底 溶液稀释。 , 对于细胞/组织匀浆物，最后细胞或组织匀浆物应放在这样一种缓冲液中，pH 中性，包含最小量的洗涤液或强变性洗涤液，离子强度接近生理浓度。避免 碎片，脂质和细胞/组织聚集。使用前将标本离心。 , 所有试剂加入板之前要涡旋。 标本收集与储存 A、 血清标本的准备: , 使血液凝固至少30分钟，然后1000 xg离心10分钟。分离血清，立即分析 或分装在?-20?储存。 , 避免多次(>2)冻融。 , 当使用冷冻的标本，建议完全解冻，涡旋混匀好，分析之前离心去除微粒。 , 血清标本应该用试剂盒提供的分析缓冲液1:2稀释(即一份血清加一份等量 的缓冲液)。例如，在一个管中，30μL血清要加入30μL分析缓冲液。当进 一步超过1:2稀释时，就要用试剂盒提供的血清基体溶液稀释。 B、血浆标本的准备: , 血浆采集推荐使用EDTA作为抗凝血剂。采血后在30分钟之内离心，1000xg， 10分钟。分离血清，立即分析或分装在?-20?储存。 , 避免多次(> 2)冻融。 , 当使用冷冻的标本，建议完全解冻，涡旋混匀好，分析之前离心去除微粒。 , 血浆标本应该用试剂盒提供的分析缓冲液1:2稀释(即一份血浆加一份等量 的缓冲液)。例如，在一个管中，30μL血浆要加入30μL分析缓冲液。当进 一步超过1:2稀释时，就要用试剂盒提供的血清基体溶液稀释。 组织培养上清液的准备: , 标本离心，去除碎片，立即分析或分装在?-20?储存。 , 避免多次(> 2)冻融。 , 组织培养上清在分析之前，可能需要用适当的控制介质稀释。组织/细胞应在 不含有干扰分析性能的试剂和条件的中性缓冲液中提取。过高浓度的洗涤 液，盐类，变性剂，高或低pH等将对分析产生负面影响。应避免使用有机 溶剂。组织/细胞提取标本，应该无颗粒，如细胞或组织碎片。 注意: , 可以使用稀释的血清或血浆标本，每孔最大量25ul。也可以使用组织培养物 或其他介质。 , 所有的标本必须存储在聚丙烯管中。不要储存在玻璃管中。 , 使用严重溶血或脂血标本时应除掉碎片、脂类和细胞。 , 当使用肝素作为抗凝剂时必须小心，因为过量的肝素会导致假的高值。每毫 升血液不超过10 IU肝素。 准备免疫测定试剂 A、准备抗体包被的珠子 如果使用预混合的珠子，在使用之前将预混合珠子的瓶子超声30秒，然后涡旋1分钟。 如果使用单个试剂瓶的珠子，将每个抗体-珠子的试剂瓶超声30秒，然后涡旋1分钟。从每个抗体珠子的试剂瓶取60μL加到混合瓶，加分析缓冲液使终体积为3.0 mL。涡旋混合的珠子。未使用的部分可以在2-8?储存一个月以上。(注意:由于组成是磁珠，在珠子溶液中可以看见一点彩色，这并不影响珠子或试剂盒的性能。) 例1:当使用20个细胞因子抗体包被的珠子，20种珠子的试剂瓶每个取60μL加到混合瓶，然后加1.8 mL分析缓冲液。 例2:当使用9个细胞因子抗体包被的珠子，9种珠子的试剂瓶每个取60μL加到混合瓶，然后加2.46 mL分析缓冲液。 B、准备质控品 使用之前在质控品1和质控品2中加250μL去离子水。将试剂瓶颠倒混匀几次然后涡旋。将试剂瓶放5-10分钟，然后将质控品转移到标记的聚丙烯微量离心管。未使用的部分可以在? -20?储存一个月以上。 C、准备洗涤液 将10×的洗涤液放在室温，然后混匀，让所有的盐类都溶解。稀释60 mL 10×的洗涤液(两瓶)加540 mL去离子水。未使用的部分可以在2-8?储存一个月以上。 D、准备血清基体溶液 这个步骤是血浆和血清标本必须的。 加2 mL分析缓冲液到装有冻干血清基体的瓶子。混匀，放置至少10分钟至完全溶解。剩余复溶的血清基体可以在? -20?储存一个月以上。 E、准备小鼠细胞因子标准品 1)使用之前在小鼠细胞因子标准品中加250μL去离子水，给所有分析物一个10，000 pg/mL的标准。将试剂瓶颠倒几次混匀，涡旋10秒。将试剂瓶放置5-10分钟，然后将标准品转移到适当的标记的聚丙烯微量离心管。这将要作为10，000 pg/mL的标准品;未使用的部分可以在? -20?储存一个月以上。 )准备工作标准品 2 在五个聚丙烯微量离心管上标2，000， 400， 80， 16和3.2 pg/mL。在五个管子中各加200μL分析缓冲液。准备系列稀释标准品:加50μL 10，000 ，000 pg/mL的管中，混匀，然后转移50μL 2，000 pg/mLpg/mL复溶的标准品至2 的标准品至400 pg/mL的管中，混匀，然后转移50μL 400 pg/mL的标准品至80 pg/mL的管中，混匀，然后转移50μL 80pg/mL的标准品至16 pg/mL的管中，混匀，然后转移50μL 16 pg/mL的标准品至3.2 pg/mL的管中，混匀。0 pg/mL的标准品(本底)使用分析缓冲液。 标准品浓度(pg/mL) 加去离子水体积 加标准品体积 10，000 250μL 0 标准品浓度(pg/mL) 加分析缓冲液体积 加标准品体积 2，000 200μL 50 µL 的10，000 pg/mL 400 200μL 50 µL 的2，000 pg/mL 80 200μL 50 µL 的400pg/mL 16 200μL 50 µL 的80 pg/mL 3.2 200μL 50 µL 的16pg/mL 免疫测定步骤 , 在分析之前必须完整地阅读这份 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，彻底地理解技术指导方针。 , 在分析之前所有试剂需在室温(20-25?)平衡。 , 标准品 [0 (本底)， 3.2， 16， 80， 400， 2，000和10，000 pg/mL]，质 控品1和2和标本的图表布局在孔图工作表上是垂直的结构(注意:大多数仪 器在默认情况下垂直地读96孔板)。进行分析测定推荐使用复孔。 , 如果使用滤板，在试剂配制和孵育步骤的所有时间将滤板放在板托上，这样 板的底部就不会接触任何表面。 1、在板上的每个孔中加入200μL洗涤液。封板，室温(20-25 ?)，放在振荡器上10分钟混匀。 2、倒掉洗涤液，把板反过来在可吸附的毛巾上轻叩几次去掉残余物质。 3、在适当的孔中加每种标准品和质控品。用分析缓冲液作为0 pg/mL的标准品(本底)。 4、在所有标本孔中加25μL分析缓冲液。 5、在本底、标准品和质控品中加25μL基体溶液。当分析血清和血浆时使用试 的血清基体。当分析组织培养或其他上清液时使用适当的对照培养基作剂盒提供 为基体溶液。 6、加25μL标本(将一部分血清或血浆加到一部分分析缓冲液中稀释)到适当的孔中。 7、涡旋混合瓶，每个孔中加25μL混合或预混合的珠子(注意:在加珠子的过程中要间歇地摇装珠子的瓶子，避免沉淀)。 8、用封板膜封板，在板的外面包上铝箔，放在震荡器上2-8 ?震荡孵育过夜或者可以选择室温(20-25?)震荡孵育2小时。然而最佳的分析灵敏度、精密度和准确度需要过夜孵育(16-18小时)。 9、轻轻地去掉板里的内容物，然后按照说明上列的洗板部分洗板2次。 10、在每个孔中加25μL检测抗体(注意:在使用之前将检测抗体放到室温平衡)。 11、封板，包上铝箔，在振荡器上室温(20-25?)震荡孵育1小时。孵育后不要吸液。 12、在每个含有25μL检测抗体的孔中加25μL链霉亲和素 - 藻红蛋白。 13、封板，包上铝箔，在振荡器上室温(20-25?)震荡孵育30分钟。 14、轻轻地去掉板里的内容物，然后按照说明上列的洗板部分洗板2次。 ?15、在所有的孔中加150μL鞘液(如果使用MAGPIX加驱动液)。在振荡器上重悬珠子5分钟。 16、将板放在Luminex 200TM ， HTS， FLEXMAP 3DTM或MAGPIX? 上用 xPONENT 运行。 17、保存并使用5-参数logistic或样条曲线拟合法分析中间荧光强度(MFI)数据计算标本中细胞因子/趋化因子的浓度(注意:稀释的标本要将计算的浓度乘以稀释因子)。 每孔加200μL洗涤液 室温，震荡10分钟 倾倒 , 在适当的孔中加25μL标准品、质控品 , 在本底和样本孔中加25μL分析缓冲液 , 在本底、标准品和质控孔中加25μL适当的基体溶液 , 在标本孔中加25μL稀释的标本 2-8?过夜孵育 , 在每个孔中加25μL珠子 2-8 ?震荡孵育过夜 去掉孔里的内容物 用200μL洗涤液洗两次 每孔加25μL检测抗体 室温孵育1小时 不要吸液 每孔加25μL链霉亲和素 - 藻红蛋白 室温孵育30分钟 去掉孔内容物 加200μL洗涤液洗两次 每孔加150μL鞘液或驱动液 在Luminex上读板(100μL，每个珠子设置50种珠子) 上读板 洗板 1) 固体板 如果使用固体板，就用手持式磁铁或磁性洗板机。 A) 对于手持式磁铁，将板置于磁铁上60S，使磁珠完全沉降。轻轻地倾斜 板把孔中的内容物倒进适当的废液容器，在吸水垫上轻轻拍打，去除残余 的液体。将板从磁铁上拿下，每孔加入200uL的洗涤液，震荡30S，再附 磁铁上，让珠子沉降60s，在每次洗板后按照上面描述的倒掉孔中内容着 物。重复洗板的步骤如检测程序推荐的一样。 B) 对于磁性洗板机，让板“浸泡”在磁铁上60S，使磁珠完全沉降。吸出 孔中液体。每孔加入200uL的洗涤液，让珠子“浸泡”60S，在每次洗板 后吸出孔中液体。重复洗板的步骤如检测程序推荐的一样。注意:如果使 用推荐的针对磁珠的洗板机(Bio-Tek ELx405)，要遵循仪器设置上的仪器 设置。 2) 滤板(Millipore Cat# MX-PLATE) 如果使用滤板，用多通道微孔真空器去除孔内容物。每孔加入200uL的 洗涤液洗板，在每次洗板后真空过滤去除孔中液体。重复洗板的步骤如检测 的一样。 程序推荐 仪器设置 Bio-Tek ELx405: 一般推荐洗涤程序如下: 浸泡程序: 洗涤程序: 侵泡 ? 吸液?分液?浸泡?吸液?分液?浸泡?吸液 1.)浸泡程序: 1.浸泡时间:60s 2.浸泡之前是否需要震荡:否 2.)洗涤程序 方法: 1. 循环次数:2 2. 浸泡/震荡:是 3. 浸泡时间:60s 4. 浸泡之前是否震荡:否 5. 浸泡之后是否灌注: 否 分液: 1. 分液体积:200 µL/孔 2. 分液流动率速度:5 3. 分液高度:130(16.51mm) 4. 水平吸液位置:00(0mm) 5. 是否先清洗底部,:否 6. 洗板前是否灌注,: 否 吸液: 1. 吸液高度:35(4.445mm) 2. 水平吸液位置:30(1.372mm) 3. 吸液速度:06(15.0mm/sec) 4. 吸液延迟:0 5. 交叉吸液: 否 6. 最后吸液:是 7. 最后吸液延迟:0 (0 msec) 3.)连接程序 :(注意:这个程序用于实际洗板过程) 上面的程序将浸泡和洗板联系在一起 将 注意:最终吸液后，每孔残留大约25 µl的洗涤液。这是BioTek洗板机预先设定好的，不需要将这部分洗涤液从板里吸出。 如果使用的是全自动洗板机，而不是BioTek ELx405，请参照厂家程序使用说明。 仪器设置(续) Luminex 200?， HTS， FLEXMAP 3D? ，MAGPIX ? 和xPONENT 软件: 这些 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 适用于装有xPonent 软件的Luminex 200?， Luminex HTS， 和Luminex MAGPIX?。Luminex 设备装有其它软件(例Luminex FLEXMAP 3D? 如 MasterPlex，StarStation，LiquiChip，Bio-Plex，LABScan100)，需要按照仪器说明设门和厂商提供的读Luminex 磁珠附加的规范。 和 HTS 仪器必须用xPonent 3.1相容的校准试磁珠检测时，Luminex 200? 剂盒进行校准(Millipore Cat.# 40-275)和使用性能验证试剂盒(Millipore Cat. # 40-276)进行验证。Luminex FLEXMAP 3D?仪器必须使用FLEXMAP 3D? (Millipore cat#40-028)校准试剂盒进行校正和使用FLEXMAP 3D?验证试剂盒(Millipore cat#40-029)进行验证。Luminex MAGPIX?仪器必须使用MAGPIX?校准试剂盒(Millipore cat# 40-049)进行校正和使用MAGPIX?和使用FLEXMAP 3D?验证试剂盒(Milliporecat# 40-050)进行验证。 注意:不能在Luminex 100?或使用Luminex IS 2.3 或Luminex 1.7软件的仪器上进行这些检测。 Luminex探针高度必须适合试剂盒提供的板。如果需要使用更多的板，请用Cat.# MAG-PLATE。 事件: 50，每个珠子 样本量: 100ul 设门: 8000-15000 报告增益: 默认(滴 PMT) 时间输出: 60S 磁珠设置: 客户32-Plex 珠子 G-CSF 13 Eotaxin 14 GM-CSF 15 IFNγ 19 IL-1α 21 IL-1β 25 IL-2 26 IL-4 28 IL-3 29 IL-5 30 IL-6 34 IL-7 36 IL-9 38 IL-10 43 IL-12 (p40) 45 IL-12 (p70) 47 LIF 51 IL-13 52 LIX 53 IL-15 54 IL-17 56 IP-10 57 KC 61 MCP-1 62 MIP-1α 64 MIP-1β 66 M-CSF 67 MIP-2 73 MIG 74 RANTES 75 VEGF 76 TNFα 77 质量控制 每个分析物控制品1和2中的范围在插入的卡片上或在Millipore公司的网 站www.millipore.com/techlibrary/index.do用目录号码作为关键词查找。 分析特性 交叉反应性 这个板中的抗体和分析物以及其他分析物之间不存在或可以忽略不计的交 叉反应性，除了MIP-1α/β，MIP-1β与MIP-1α珠存在27,的交叉反应。 分析灵敏度(最小检测浓度，pg/mL) 最小检测浓度(MinDC)是Brendan技术公司的StatLIA?免疫分析软件计算出来的。如果在相同的条件下用无数个标准浓度用来检测，可以通过数学来计算实验的MinDC，测量真实的分析检测限。 精密度 批内精密度由单个分析物两种不同的浓度的细胞因子的8个可报告结果的CV,平均值产生。批间精密度由6个不同的分析物两种不同浓度的细胞因子的CV,平均值产生。 准确度 回收率:数据代表血清基体(n=6)中低浓度、中浓度、高浓度标准回收率平均 百分率。