白色念珠菌总RNA的提取方法_cropped

白色念珠菌总RNA的提取方法_cropped () [ 文章编号 ] 16712587 ?20070220359203 白色念珠菌总 RNA 的提取方法 Isolation method of total RNA f rom Ca n di d a Al bic a ns 1 ,2 1 ,3 1 1 1 4 1张云峰, 焦立新, 贺 丹, 宋文刚, 孙文通, 横山耕治, 王 丽 (11 吉林大学基础医学院病原生物学教研室 , 吉林 长春 130021 ; 21 吉林大学第一医院儿科 , 吉林 长春 130021 ; ) 31 吉林省长春市中心血站中心实验室 , 吉林 长春 130033 ; 41 日本国立千叶大学真菌医学研究中心 , 日本 千叶 τ 26028673 目的 : 探讨提取白色念珠菌总 RN A 的方法 。方法 : 白色念珠菌标准菌株经 SDA 培养基培养后 , 采[ 摘 要 ] 用改良的异硫氰酸胍一步法提取总 RN A 。以此为基础 , 进行反转录 PCR 反应 。结果 : 得到的 RN A 经过紫外分 - 1 光光度计检测浓度达到 01 7g 〃L 以上 ; 琼脂糖凝胶电泳证实为完整 、均一的总 RN A ; 将此法提取的 RN A 反 转录成 cDN A 后经过 PCR 扩增 , 可获得清晰的目的条带 。结论 : 该方法简便 、快速 , 提取的总 RN A 可以用于 进一步基因克隆 、表达 。 念珠菌 , 白色 ; 聚合酶链反应 ; RN A 提取 ; 异硫氰酸胍法[ 关键词 ] A [ 中图分类号 ] R3791 4 [ 文献标识码 ] ( 提取是进行白 色 念珠 菌基 因 的克 隆 、表珠 , RN A 逆 转 录 试 剂 盒 Ta Ka Ra , RN A PCR RN A ) 达重要的基本操作之一 。目前已经建立了许多从动 KI T Ve r1 31 0。 ( 植物细胞中提取 RN A 的方法 , 常用的有 Trizol 试 11 2 仪 器 超声波细胞粉碎机 宁波薪芝生物 ) ( 科技有限 公 司, 低 速 台 式 离 心 机 TDL240B 型 , 剂快速 提 取 法 、异 硫 氰 酸 胍 法 、Cs 梯 度 离 心 法 、 [ 1 ] ) 苯酚法 等。而 从 真 菌 尤 其 是 白 色 念 珠 菌 中 提 取上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂 , 低 温 高 速 离 心 机 ( ) ( RN A 的方法报道较少 , 且步骤较繁琐 、耗费时间 。 He racu s , 德国, 紫外分光光度计 Sp ect r umla b [ 2 ,3 ] ( ) 本研 究 参 照 已 有 的 异 硫 氰 酸 胍 提 取 RN A 法, PCR 仪 PC 320 52 型 , 上海梭光技术有限公司, ) 型 , 美国。经过改良用于酵母相白色念珠菌总 RN A 提取 。该 11 3 白色念珠菌细胞破壁方法? 超声波细胞破方法操作简便 , 耗时较短 , RN A 降解少 , 纯度高 , 能够满足下一步分子生物学实验的需要 。壁法 : 将白 色 念 珠 菌 接 种 于 SDA 培 养 基 , 培 养 2,3 d , 从平 板 上 直 接 收 获 菌 体 , 加 2 倍 体 积 的1 材料与方法 - 1 75 %乙醇灭活 1,2 d 。2 000 r 〃mi n 离心 10 mi n , A TCC 白 色 念 珠 菌 标 准 菌 株灭菌蒸馏水洗涤 , 称取菌体 100 mg 于 15 mL 的聚 11 1 菌 株 及 试 剂 90028 , 丙烯试管中 日本国立千叶大学真菌医学研究中心赠送 ,, 加入 2 mL D EPC 水 , 将离心管臵于 ( 冰上 , 超声波处理 5 mi n 参数设臵 : 工作 1 s , 间 常规保存 , 定期传种 。采用 SDA 培养基 。变性液 - 1 - 1 () 停 2 s , 预臵功率比 50 % , 槽温度 50 ?, 成匀浆 4 mol 〃L 硫氰酸胍 , 25 mmol 〃L 柠檬酸钠 , - 1 ) 01 1 mol 〃L 二 巯 基 乙 醇 , 01 5 % Sa r ko syl ,状 。提取 过 程 严 格 遵 守 提 取 RN A 的 规 则 , 防 止 - 1 (2 mol 〃L 醋酸钠 在 40 mL 水和 35 mL 冰醋酸中 RN A 酶的污染 。 ?玻璃珠细胞破壁法 : 白色念珠 加 161 42 g 无水乙酸钠 , 用冰醋酸调节 p H 到 41 0 , 菌培养灭活方法同上 。称取灭活菌体 100 mg 溶于 用水定 容 至 100 mL , 最 终 溶 液 的 钠 离 子 浓 度 为15 mL 聚 丙 烯 试 管 中 , 加 入 2 mL 的 D EPC 水 和- 1 ) ( ) 2 mol 〃L , 酚 ?氯 仿 ?异 戊 醇 25 ?24 ?1 ,300 mg 酸洗玻璃珠 , 拧紧瓶盖 , 在 4 ?条件下 , 蜗 - 1 () 异丙醇 , 75 %乙醇 用 D EPC 处理水制备, 01 5 %旋 振 荡 器 上 1 800 r 〃mi n 高 速 振 荡 5 mi n , - 1 () SD S D E PC 水处 理, 01 45 , 01 55 mm 酸洗 玻 璃10 000 r 〃mi n 低温离心 , 留取上清 。在匀浆或上 206230 2006[ 收稿日期 ] () 国家自然科学基金资助课题 30571773[ 基金项目 ] () [ 作者简介 ] 张云峰 1964 - , 男 , 吉林省长春市人 , 副教授 , 在读医学博士 , 主要从事真菌学研究 。 ( )[ 通讯作者 ] 王 丽 Tel : 0431285619486 , E2mail : wli99 @jl u1 edu1 cn - 1 A / A 为清中加入 3 mL 变性液 , 混匀 。加入 2 mol 〃L 醋 : A 为 11 401 , A 为 01 718 , 法 260 280 260 280 - 1 () 酸钠 p H 41 001 2 mL , 充分混匀 。加入 2 mL 水 11 95 , RN A 含 量 为 01 701 g 〃L ;璃 珠 破 壁 方 ( ) 饱和 酚 和 01 5 mL 氯 仿/ 异 戊 醇 24 ?1 。振 荡 法 : A 为 11 546 , A 为 01 785 ,A / A 为260 280 260 280 - 1 - 1 10 s , 冰 浴 15 mi n , 12 000 r 〃mi n 、4 ? 离 心11 97 , RN A 含量为 01 754 g 〃L 。2 种方法获得的 20 mi n 。吸取上清 , 加入等体积的酚 ?氯仿 ?异戊 RN A 量均较高 , RN A 纯度均能够满足要求 。() 醇 25 ?24 ?1, 振 荡 10 s , 冰 浴 15 mi n , 4 ?、 RN A 样品经 1 %琼脂糖凝 胶21 2 RN A 的质量 - 1 12 000 r 〃mi n 、离心 20 mi n 。吸取上清 , 重复上 电泳后 , 在 紫 外 灯 下 观 察 , 可 见 28 S 、18 S 及 5 S 一步骤一次 。上清加入等体积的异丙醇 , - 20 ?沉 () 3 条 r RN A条带 图 1。- 1 淀 30 mi n 后 , 12 000 r 〃mi n 、4 ?离心 15 mi n , 弃上清 。将 RN A 沉 淀 用 1 mL 变 性 液 再 次 溶 解 , 加 入 等 体 积 的 异 丙 醇 , - 20 ?沉 淀 30 mi n , - 1 12 000 r 〃mi n 、4 ?离 心 15 mi n , 弃 上 清 。用 75 %的乙 醇 洗 涤 沉 淀 2 次 , 以 除 去 残 存 的 胍 盐 。 - 1 12 000 r 〃mi n 、4 ?离心 10 mi n , 弃上清 , 真空 μ干燥 15,30 mi n 。将 RN A 沉淀溶于 100,200 L D EPC 水中 , - 70 ?备用 。 RN A 样品浓? 11 4 RN A 样品纯度和质量检验 度和纯度测定 : 测定紫外分光光度计在 260 n m 和 ( ) 280 nm 处的 A 值 取 3 次测定的平均值。RN AFig. 1 Elect rop ho retic pat ter n of to tal RN A - 1 ( ) ( ) 浓度 g 〃L = A 值 ×40 ×稀 释 倍 数 /260 L a ne 1 : Sup er so nic wave met ho d ; L ane 2 : Gla ss bead met ho d 1 000 ,并计算 A / A 的比值 。 ?用 1 %琼脂糖凝 260 280 胶电泳检验 RN A 的完整性 。 21 3 R T2PCR 提 取 的 总 RN A 逆 转 录 合 成 [ 4 ] 1 5 1cDN A合 成: 合 成? R T2PCR 反 应 cDN A , 以该 cDN A 为模板 , 采用特异性引物进行 cDN A 的引 物 选 用 了 Oli go d T2A dap to r Pri mer 或 ( ) PCR , 得到预期的产物 图 2, 说明提取的 RN A特异性下游引物中一种 。按下列成分进行逆转录反 的完整性很好 。 μμ应 : 1 L 总 RN A , 01 5 L Oligo2d TA dap to r - 1 ( μ) μM gCl Pri me r 21 5 mol 〃 L , 2 L 2 - 1 - 1 () μμ) ( 25 mmol 〃L , 1 L dN T P 10 mol 〃L , - 1 μ( ) μμ 01 5 L A M V 逆转录酶2 U 〃L , 1 L 10 × μμR T B uff e r , 31 75 L RNa se Free d HO , 01 25 L 2 μRNa se i nhi bito r , 反 应 体 系 10L 。按 以 下 条 件 进 行 逆 转 录 反 应 : 42 ?水 浴 3 h , 99 ?、5 mi n , 5 ?、5 mi n 。反应结束后以此作为 PCR 扩增的模 μ板或 - 20 ?保存待用 。? PCR 反应 : 50L PCR 反 μ应体 系 包 含 5 ×PCR B uff e r 10 L , 灭 菌 蒸 馏 水 μμ281 75 L , Ta Ka Ra Ex Taq H S 01 25 L , 特异性上 Fig. 2 Elect rop ho retic pat ter n of R T2PCR of to tal RN A μμ游和下游引物各 01 5 L , cDN A 模板 10 L , 轻轻 ext ract ed by t he imp ro ved i so t hiocya nate L a ne 1 : Super so nic wave met ho d ; L a ne 2 : Gla ss bead met ho d ; 混匀 。按 以 下 条 件 进 行 PCR 反 应 : 94 ?变 性 L a ne 3 :DN A Ma r ker 10 mi n ;94 ?、1 mi n , 55 ?、1 mi n , 72 ?、3 mi n , 取反30 个循环 ; 延伸 72 ?、10 mi n 。反应结束后 , μ 应液 10 L PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳 。3 讨 论 2 结 果 白色念珠菌具有细胞壁 , 且质地比较坚硬 , 其 [ 5 ] RN A 的提取比较困难。本实验采用超声波细胞超 声 波 破 壁 方21 1 RN A 的 浓 度 及 纯 度 360 破壁或玻璃珠细胞破壁 2 种方法 , 再经改良的异硫基成分的干扰 ; ?加大变性液的用量 , 这样在细胞 氰酸胍一步法分离 RN A 。异硫氰酸胍一步分离法 破壁后就 能 强 烈 地 抑 制 住 内 源 性 RNa se 的 活 性 , 是目前最 常用 且 行之 有效 的 方 法 , 主 要 用 于 各 种 在无 RNa se 的环境下 , 将 RN A 去除蛋白 。然后利 动 、植物组织细胞中 RN A 的提取 。本研究采用超 用 RN A 与细胞内其他大分子成分在溶解性和沉降 [ 61 7 ] 声波细胞破壁或玻璃珠细胞破壁 2 种方法, 使 性上的差异 进 行物 理分 离 , 从 而 获 得 完 整 均 一 的 RN A 和细 胞 内 的 DN A 、蛋 白 质 、多 糖 等 释 放 出 RN A 。玻璃珠细胞破壁法是以一种直径为 01 45 , 来 ; 再加入异硫氰酸胍使蛋白变性 , 将以核蛋白形 01 55 mm 的玻璃珠 , 机械性破坏真菌细胞壁的核酸 式存在的 RN A 变为溶解状态 , 同时强烈地抑制了 提取方法 。延长玻璃珠破壁振荡时间至 5,10 mi n , 内源性 RNa se , 保证 RN A 不被降解 ; 酚与随后加 能明显增加总 RN A 的产 量 , 且 经凝 胶 电泳 分析 , 入的氯仿 经 过 充 分 地 震 荡 混 匀 , 并 离 心 处 理 后 , 表明不影响提取 RN A 的纯度 。 RN A 便分布到上层水相 , 蛋白沉于下层酚相 ,用超声波法细胞破壁或玻璃珠法细胞破壁结合而 DN A 则位于界面 ; 将上层水相以异丙醇处理 ,改良的异硫氰酸胍一步法提取白色念珠菌总 RN A便 可获得 RN A 沉淀 。简便 、快速 , 是一种理想方法 。 本实验结果表明 , 通过上述 2 种细胞破壁方法 [ 参考文献 ] 提取的白色念珠菌总 RN A 的纯度和质量 , 均能满 [ 1 ] 张 , 鱼红闪 , 金凤燮. 真菌中 RN A 的提取方法 [J ] . 大 足一般分子生物学实验研究的需要 。经紫外分光分 ( ) 连轻工业学院学报 , 2004 , 23 1: 222241 析 , RN A 的 A / A 在 11 8,21 0 之间 , 吸收峰值 260 280 [ 2 ] 胡国斌 , 梅兴国 , 刘 怡. 改良异硫氰酸胍一步法提取红豆 在 260 nm 处 , 表明样品的纯度高 , 无 DN A 、蛋白 ( ) 杉细胞 RN A [J ] . 生物技术 , 2001 , 11 5: 31233 . 质及其 他 物 质 污 染 。电 泳 检 测 可 见 清 晰 的 28 S 、[ 3 ] 李 迅 , 裴建军 , 邵蔚蓝. 担子菌草姑总 RN A 的快速抽提方 ( ) 18 S 及 5 S 3 条 r RN A 条带 。且提取的总 RN A 经逆 法 [J ] 1 微生物学通报 , 2004 , 31 4: 81284 . [ 4 ] 刘进元 , 常智杰 , 赵广荣 , 等. 分子生物学实验指导 [ M ] .转录 , 合成 清晰 的 cDN A 条 带 , 与 预 想 的 结 果 吻 北京 : 清华大学出版社 , 2002 : 57267 . 合 。28 S 、18 S RN A 与 EB 的结合量比值约为2 ?1 ,[ 5 ] 萨姆布鲁克 J , 弗里奇 E F , 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指 表明 RN A 未发生明显降解 。南 [ M ] . 第 2 版. 北京 : 科学出版社 , 1999 : 3432367 . 本实验在异硫氰酸胍一步法的基础上 ,对白色 [ 6 ] 周村建 , 郝 飞 , 王 鲁 , 等. 白念珠菌总 RN A 提取的实验 念珠菌 RN A 的提取作了如下改良 : ?将液体培养( ) 研究 [J ] . 中华皮肤科杂志. 2004 , 37 8: 4942495 . [ 7 ] 陈官芝 , 王 云 , 徐秀莲 , 等. 致病性真菌 DN A 提取方法的 改为固体平板培养 , 这样白色念珠菌体较易收获 , ( ) 实验研究 [J ] . 中华皮肤科杂志 , 2002 , 35 5: 4082409 . 只需小心刮取即可 , 同时能够最大限度地减少培养 ()上接第 329 页 ( ) ( ) ( ) [ 病例 2 ] 患者 , 女 , 50 岁 。患者于 1994 年体检发现 HB sA g + 、HBeA g + 、抗 HBc + , 无明显自觉症状 , 5 - 1 半年后因劳累出现乏力 , 食欲不振 , 皮肤 、巩膜黄染 , 肝功能异常 , HBV DN A 定量大于 11 0 ×10copies 〃mL 。经住院 治疗 , 病情好转 , 但出院后于劳累时病情即发作 , 反复住院 。曾用干扰素 300 万 U 抗病毒治疗 1 疗程 , HBV DN A 定量仍 未下降 , 病情逐渐加重 , 不能参加体力劳动 。1995 年彩超提示肝硬化 , 继而出现腹水 。因经济困难停止一切治疗 。2001 年 开始遵医嘱口服拉米夫定 , 01 1 g/ 次 , 1 次/ d , 1 个月后自觉症 状好转 , 肝功基本 正 常 , 3 个 月 后 肝 功 正 常 , 腹 水 消 失 , HBV DN A 定量下降 。已服药 5 年 , 病情持续稳定 , 能正常参加体力劳动 , 体重增加 。用药期间未出现不良反应 。 2 讨 论 拉米夫定为葛兰素史克公司生产的核苷类抗病毒药 , 国外曾用于治疗爱滋病 , 后来发现其有抑制 HBV DN A 聚酶作 用 , 故用于治疗乙型肝炎 。临床观察表明 , 该药应用后可迅速降低血清 HBV DN A 水平 , 改善症状 , 恢复肝功能 , 阻止或 逆转肝硬化 。拉米夫定通过抑制乙肝病毒复制 , 改善肝脏炎症 , 具有明显抑制乙型肝炎病毒复制的作用 , 降低失代偿性肝 硬化和肝癌的发生率 , 延长生存期 。该药在临床应用中适应证选择非常重要 。对 AL T 升高达 5 倍左右患者疗效更佳 , 特别 对代偿性或失代偿性肝硬化而不能接受干扰素治疗的患者效果较满意 。本组 2 例患者均为失代偿期肝硬化 , 而且在应用多种药物治疗后效果不理想的情况下选用拉米夫定治疗 , 收到十分满意效果 。该药在应用过程中要定期监测肝功能 、HBV DN A 定量 , 并严密观察病情变化 , 防止出现病毒变异 、耐药 。因为拉米夫定虽在短期内使血中 HBV DN A 水平下降或转 阴 , 但不能清除病毒 。本组 2 例患者目前尚未停药 , 何时停药难以掌握 , 担心发生停药反跳问题 。