久实牌蝙蝠蛾被毛孢对糖尿病肾病大鼠肾组织HIF-1α及VEGF
表达的影响
青海久实公司突破了青藏高原上难以再生、难以重现、难以复制珍贵稀有可食动植物资源的历史,拥有国家级发明专利技术的自主知识产权——久实牌蝙蝠蛾被毛孢菌粉的生产方法(专利申请号: 200710050273.7)。公司“久实宝”系列产品生产所用菌种,经过国家权威机构中国科学院微生物研究所的检测,鉴定结果为蝙蝠蛾被毛孢为唯一无性型久实牌蝙蝠蛾被毛孢[鉴定号:(2007)微检字第101号],同时被中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的要求该产品菌种列入收藏(保藏中心登记入册编号GMCCNo.2126)。蝙蝠蛾被毛孢(Coydyceps Sinensis)仅分布于我国青藏高原及其边缘地区海拔3000-6000米的高寒草甸阴湿地区。是寄生于蝙蝠蛾幼虫上的真菌——久实牌蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella sinensis)。独特的地理、生态、气候环境;独特的生物物种;独特的滋补和药用价值,成为中华医药千年传承的传奇珍品。蝙蝠蛾被毛孢富含四十多种人体必需的营养成分。虫草多糖、虫草素、虫草酸、D-甘露醇、腺苷、尿苷和SOD(超氧化物歧化酶),四种有机酸:软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸,具有降血脂作用,对血压进行双向调节。五种维生素:VB1、VB2、VB12、VE、VK补充人体必需的维生素。六种肽类化合物,有效增强人体免疫活性。八种微量元素:钠、钾、钙、铁、锌、硒、锰、铜,是新陈代谢的物质基础。十八种氨基酸是增强免疫的物质基础。历代医药典籍将蝙蝠蛾被毛孢药性药效归纳为,“性温,甘,平。归
肺、肾经;温而不澡,补而不滞;阴阳并补;补肺益肾,止血化痰。用于久咳虚喘,久涝咯血,肾虚遗精,腰膝酸痛,理诸虚百损”。是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代医学从功能上将其归为免疫调节。进一步映证了传统中医“理诸虚百损”的功效。蝙蝠蛾被毛孢不但对人体各种脏器的功能具有调节作用,还存在某些直接抗病功能。现代药理药效研究表明蝙蝠蛾被毛孢具有: 1、可迅速增强机体免疫力,双向调节内分泌; 2、改善心血管功能; 3、有降血糖、降血脂的作用; 4、有雄性激素样作用。对性功能低下、减退、淡漠有改善作用; 5、抗肿瘤作用; 6、有抗肾衰、抗肾炎作用; 7、抗疲劳、抗衰老作用; 8、对术后病人有抗炎症、促愈合作用; 9、抗器官移殖后的排异作用; 10、对各种免疫功能失调造成的症状有缓解作用。
慢性缺氧及肾小管损伤【1]是近年来糖尿病肾病(diabetaic nephropathy,DN)发病机制研究的热点。缺氧通过适应性表达缺氧诱导因子.1(hypoxiainducible factor.1,HIF.1)进而激活缺氧反应性基因而发挥广泛的生物学作用[2】。糖尿病状态下,多种因素参与了血管内皮生长因子vascular endothelialgrowth factor,VEGF)的表达增加b‘5],但缺氧M1是迄今为止所发现的最强的调节因素,其机制可能是通过HIF.1与VEGF基因的特定区域相结合,从而促进其转录增加。以往的研究认为,肾小球内皮细胞及足细胞是VEGF的主要产生部位,而对缺氧敏感的肾小管上皮细胞尤其是近端小管上皮细胞在糖尿病慢性缺氧状态下VEGF表达情况的研究甚少。本研究以
链脲左菌素(streptozotocin,STZ)诱导的DN大鼠模型为研究对象,观察其肾组织HIF.1a、VEGF的表达水平,探讨HIF一1a和VEGF在DN发病中的作用及冬虫夏革(Cordyceps sinensis,干预的影响。
1材料与方法
cs)对其材料STZ购自美国Sigma公司,久实牌蝙蝠蛾被毛孢制剂由江西济民可信公司惠赠,兔抗大鼠HIF.1口抗体及兔抗大鼠VEGF抗体购自武汉博士德公司,ABC法试剂盒、DAB液体购自福州迈新生物技术开发有限公司,TRIzol购自美[]Invitrogen公司,反转录试剂盒购自立陶宛Fermentas公司,HIF—la及VEGFiJI物由北京鼎国公司合成,大鼠尿N一乙酰一p—D.氨基葡萄糖苷酶(N—acet91.p—D—glucosaminidase,NAG酶)ELISA试剂盒为上海源叶产品,600 bp DNA内参为西班牙进口分装。
1.2方法
1.2.1动物模型及分组
清洁级Wistar雄性大鼠s5只,喂养1周后,随机选取40只大鼠,予STZ 60 mg/kg腹腔注射,空腹血糖维持在13.9 mmol/L或随机血糖>16.7mmol/L以上,视为糖尿病模型成功。4N后测24 h尿蛋白定量在30 mg以上者,认为DN模型成功(共30只)。实验过程中糖尿病模型不成功2只,DN模型不成功2只,死亡5只,随机剔除匹配不均1只。随机分为模型组(DN组,打=1S)、久实牌蝙蝠蛾被毛孢组(cs组,n=15)。另将15只鼠龄、体质量相匹配的大鼠作为正常组(NC组)。s组予cs浓缩提取液5.0 g/(kg.d)灌胃,NC组及DN组
等量生理盐水灌胃。干预2,4,6周时处死每组5只大鼠。实验期间观察到糖尿病大鼠每日饮水量、饮食量、大便次数及尿量较正常大鼠明显增加,毛色污秽潮湿,灵敏性欠佳,并定期监测尾静脉血糖。大鼠静脉血糖
鼠处死前天留24 h尿测蛋白定量及NAG酶水平,称体质量及大鼠肾重,计算肾重肥大指数(肾重/体质量),心脏采血测血糖,离心后测定血清肌酐值(表1)。部分肾组织用10%中性甲醛固定,部分肾组织冻存于液氮中。1.2。2一般指标双缩脲法测定各组大鼠24 h尿蛋白定量,全自动生化检测仪检测各组大鼠血肌酐(SCr)。酶联免疫吸附测定法测定尿NAG酶水平。1.2.3肾组织病理观察与检测石蜡包埋肾组织标本进行连续切片(厚度4}lm),37℃烘干12 h后进行HE 及Masson染色,光学显微镜下观察各组大鼠肾组织的形态学变化。疫组织化学步骤:将上述肾组织切片后常规脱蜡至水,采用柠檬酸缓冲液微波修复,加兔抗大鼠HIF一1口抗体(1:1S0)、兔抗大鼠VEGF 抗体(I:150),37℃孵育30 rain,4。C过夜,按ABC法试剂盒说明
书
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操作,DAB显示S~20 min,光学显微镜下观察,控制着色时间。个标本随机取lo个肾小球视野,倒臵显微镜下观察DN肾损伤,采用Image—Pro Plus 6.0软件分析阳性表达指数值(positive index, PI),即棕黄色颗粒部分面积占视野面积的比值。1.2.4 RT—PCR 检测肾组织HIF—l a和VEGF mRNA表达采用Trizol一步法提取肾组织总mRNA,按反转录试剂盒操作要求将总mRNA反转录成cDNA,测试管中分别加入HIF.1a和VEGF引物,按下列反应条件进行扩增:95℃
预变性 5 rain,94℃变性60 s,退火温度根据引物不同而不同(表2),退火60 S,72℃延伸60 S,72。C终末延伸10 rain,共30循环,电泳35 rain后在紫外灯下观察结果。半定量分析:将电泳后的凝胶放于Bandscan 5.0凝胶图像分析系统测量HIF.1a和VEGF的吸光度,分别与内参照吸光度的比值即为HIF—la和VEGF mRNA的相对值。1.3统计学处理所有研究数据均采用SPSSl7.0软件包进行统计学处理,均用均数〒
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
差(i虹)表示,计量资料多组间的差异比较采用单因素方差分析(AVOVN),两组均数间的进一步比较采用LSD.f检验。双变量相关性分析采用Pearson检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肾组织病理学改变
肾组织HE和Masson染色显示:与Nc组比较,DN组大鼠肾小球直径增大,毛细血管襻明显扩张,随着病程延长,毛细血管襻塌陷,肾小球直径缩小,肾小球系膜区基质增多;肾小管上皮细胞出现不同程度的空泡样变性甚至胞浆脱落,部分小管管腔内可见管型;间质区可见灶性炎症细胞浸润,部分肾间质纤维化形成。与DN兰Jt比较,cstH。肾小球毛细血管襻开放相对较好,系膜基质轻微增生,少量炎症细胞浸润,部分肾小管上皮细胞损伤趋于修复,病理损伤减轻2.2各组大鼠肾组织HIF.oc及VEGF蛋白的表达NC组大鼠肾组织仅可见HIF —ld及VEGF蛋白少量表达,DN组大鼠HIF—la蛋白主要表达于肾小管及集合管上皮细胞胞浆,肾小球内几乎未见表达;VEGF蛋白亦主