.血管紧张素II心肌细胞损伤作用

.血管紧张素II心肌细胞损伤作用 摩登先生网-房产频道 摘 要:目的 观察血管紧张素II刺激心肌细胞后SOD值及细胞凋亡率、并且探讨其机制。方法 1、取SD乳鼠心肌细胞做原代培养，分为空白对照组、AngII刺激组(分为不同浓度组);2、空白对照组不加任何刺激物。3、AngII组用浓度分别为40、60、80、100umol/L的 、用化学比色法测定SOD活力，流式细胞仪测定细胞凋AngII刺激乳鼠心肌细胞48小时;4 亡率。结果AngII刺激乳鼠心肌细胞48小时后细胞凋亡明显、SOD活性降低，且不同浓度AngII组间差异显著(P 关键词:超氧化物歧化酶;血管紧张素II;心肌细胞; 心肌细胞的凋亡和坏死在急慢性心力衰竭过程中起了重要的作用，在心力衰竭情况下RAAS(renin-angiotensin-aldosterone system)系统激活，血管紧张素II(AngII)增加，在心肌肥厚及心力衰竭的发生、发展中起着重要的调控作用。本试验在体外乳鼠心肌细胞的原代培养基础上，通过观察血管紧张素II刺激下心肌细胞SOD活力、细胞凋亡，探讨AngII损伤心肌细胞可能的机制。 一、 材料 (一)细胞来源:新生SD乳鼠心脏分离心肌细胞做原代培养，SD乳鼠由苏州大学动物房提供。 (二)试剂 DMEM培养基、血管紧张素II、二甲基亚砜、胰蛋白酶、EDTA，SOD检测试剂盒，Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒。 (三)仪器 BB-5060型CO2培养箱、IX70型倒置相差显微镜、SW-CJ-1F型净化工作台、LDZ5-2型高速离心机、ULT1386-V34型-80?冰箱、MDF-U332型-20?冰箱、HZ-9211K恒温震荡器、DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱、721分光光度计、XW-80A旋涡混匀器、流式细胞仪(型号:FACSVantageSE)。 二、方法 (一)SD乳鼠心肌细胞的提取、纯化和培养 采用无菌操作的方法取SD乳鼠心脏，用PBS缓冲液反复清洗，用眼科小剪刀剪成1-2m 大小的块状，加入0(25,的胰蛋白酶?消化液中，置37?培养箱孵化5-10min，将上层液体转至DMEM液管中，1000r/min离心3-5min，去上清，用DMEM培养基重悬细胞，保存于37?CO2培养箱。将未消化完的心肌组织块再加入消化液，重复上述步骤，直至所有心肌组织消化完毕为止。将所得的心肌细胞转至70ml的细胞培养瓶中，37? CO2培养箱培养60,90min，待成纤细胞贴壁后，吸取上层细胞悬液至新的培养瓶中，计数后按5×105个/ml将细胞加至96胞培养板，置5,CO2和95,O2的培养箱37?培养，同时观察和记录心肌细胞的生长状况。 (二)试验分组(96孔板中对照组和AngII组分四个浓度组分别取10孔) 1、对照组:仅用加入2,新生小牛血清的DMEM培养基。 2、AngII组:DMEM培养基中分别加入浓度为20、60、80、100umol/L的血管紧张素II作用48小时。每种处理10个复孔，置于37?含5%CO2饱和水汽培养箱中培养。 (三)SOD、细胞凋亡率的测定 1、标本收集 细胞按上述不同刺激培养48小时后，吸取培养液上清，置于-20?保存待测SOD;吸除培养板中培养基上清，剩余细胞收集后用于细胞凋亡率的测定。 摩登先生网-房产频道 2、SOD测定、细胞凋亡率均按照试剂盒说明书步骤进行。 三、数据处理: 采用SPSS11.0统计软件进行分析，所有数据用均数?标准差 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示，组间比较用方差分析，P,0.05认为差异有统计学意义。 四、结果 Ang-II 刺激乳鼠心肌细胞48小时后，培养上清液中SOD浓度明显低于空白对照组 )。( P<0.05)，且随AngII浓度加大SOD下降明显，不同浓度组间差异显著( P<0.05)(见表1各组细胞凋亡率明显高于空白对照组( P<0.05)，且随AngII浓度加大凋亡率升高明显，不同浓度组间差异显著( P<0.05)(见表2) 讨论 慢性心衰过程RAAS系统被激活,致血管紧张素II浓度增加，导致心肌损伤。可表现为细胞通透性增加，心肌酶(如CPKMB,ASTMB CTnI)外漏和心肌细胞凋亡、坏死。本文结果显示加入AngII后心肌细胞活力降低，细胞的凋亡率显著增加，与文献报告一致[1]。Kajsytura 。Ang?在心肌细胞的自分泌等[2]研究发现，在Ang II存在时，心肌细胞凋亡增加408倍 活动可通过不同途径诱导心肌细胞凋亡[3-4]。 Ang II与细胞膜上的AT1受体结合耦联细胞上的G蛋白，激活磷脂酶 C(PLC)，使细胞内的IP3和二酰甘油DAG增加，细胞内ca2+浓度增加，磷脂酶C(PLC)的活性增强，从而诱导c-fos(属促凋亡转录因子)的表达。AngII诱导c-fos表达增加依赖细胞ca2+的内流，钙通道阻滞剂 nicardipine(尼卡地平)可阻断c-fos的表达[5]，细胞凋亡可减少。 AngII在激活PLC的同时，还激活 MAPK(丝裂素活化蛋白激酶Mitogen-Activated Protein Kinase)。MAPK与心肌肥厚进展关系密切[6]。 CHOP / GADD153 (growth arrest and DNA damag-inducible gene153) 即“生长阻滞和DNA损伤诱导基因153”, 属促凋亡转录因子。细胞外刺激,如氧化应激(ROS)、胞内钙失衡及内质网应激等时CHOP/GADD153被显著诱导表达[7-8] , AngII作用心肌细胞可以导致ROS增加，细胞内钙超载从而使CHOP/GADD153蛋白表达明显。而预先给予CHOP/GADD153反义寡核苷酸干预,其蛋白高表达及心肌细胞凋亡均受到抑制。提示Ang?可能通过上调CHOP/GADD153的表达,诱导心肌细胞凋亡。 超氧化物 歧化酶(SOD)对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基、保护细胞免受损伤。SOD活力的高低间接反应了肌体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了肌体细胞受自由基攻击的严重程度，有的文献用SOD/MDA来描述生物体内氧化和抗氧化平衡的状态及在药理实验中评估药物的抗氧化效果。本研究显示AngII刺激心肌细胞引起SOD活性下降，且呈一定的剂量依赖性，说明AngII可诱发氧衍生自由基引起脂质过氧化损伤造成细胞损害。 综上述，本实验进一步证实血管紧张素II对心肌细胞损伤作用明确，为临床保护心肌损伤而减少AngII分泌提供了理论依据。 [1] 郭书文, 崔巍, 王硕仁, 等. 血管紧张素?诱导心肌细胞凋亡与增殖的时相特征及 摩登先生网-房产频道益气活血药对其影响[J]. 中国中西医结合杂志 2005,25(11):1004-1007. [2] Kajstura J, Fiordaliso F, et al. IGF-1 overexpression inhibits the development of diabetic cardiomyopathy and angiotensin II-mediated oxidative stress. Diabetes,2001, 50(6):1414-24. [3] SUN Y，ZHANG J，ZHANG J Q，et a1(Renin expression at sites of repair in the infarcted rat heart [J](Mol Cell Cardiol,2001,33 (5):995-100 [1] [2] 下一页 3( [4] LER1 A，CLAUDIO P P，LI Q，et a1(Stretch-mediated release of angiotensin II induces myocyte apoptosis by activating p53 that enhances the local rennin-angiotensin system and decreases the Bcl-2-to-Bax protein ratio in the cell [J](Clin Invest，1998，101(7):1326-42( [5] SADOSHIMA J，IZUMO S(Signal transduction pathways of angiotensin II-induced c-fos gene expression in cardiac myocytes in vitro(Roles of phospholipids -derived second messengers[J](Circ Res，1993，73(3):424-38( [6] Pellieux C, Sauthier T, Aubert JF, et al(Angiotensin II-induced cardiac hypertrophy is associated with different mitogen-activated protein kinase activation in normotensive and hypertensive mice [J](Hypertens,2000,18(9):1307-1317. [7] Tang JR, Nakamura M, Okura T, et al. Mechanism of ox idative stress-induced GADD153 gene expression in vascular smooth musclec ells [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 290(4): 1255-1259. [8] Ubeda M, Habener JF. CHOP gene expression in response to endoplasmic- reticular stress requires NFY interaction with different domains of a conserved DNA- binding element [J]. Nucleic Acids Res, 2000,28(24):4987-4997. 上一页 [1] [2]