【doc】 探讨抗γ公共链单抗诱导移植免疫耐受的作用机制

【doc】 探讨抗γ公共链单抗诱导移植免疫耐受的作用机制 探讨抗γ公共链单抗诱导移植免疫耐受的作 用机制 ?470?中华器官移植杂志2005年8月第26卷第8期ChinJOrganT型Pnt!?g!:!: 探讨抗公共链单抗诱导移植 免疫耐受的作用机制 昌盛沈世乾陈必成张鑫杜敦峰周洁陈忠华 【摘要】目的探讨抗7公共链单抗在诱导移植免疫耐受中的作用机制.方法将实验动物分 为2组,每组20只.实验组:在Balb/c裸小鼠(H一2)体内用CFSE标记的Balb/c小鼠(H一2)T细胞 (3×10个)重建其免疫系统,同时给予经丝裂霉素C处理的供者C57BL/6小鼠(H一2)脾细胞(5 ×10个)静脉输注,24h后实验组受鼠经腹腔注射抗7c单克隆抗体(4G3,3E12,TUGm2,各0.5 mg)和抗白细胞介素2受体(IL-2R)B链单克隆抗体(TM-J31,0.5mg) 混合液;对照组:以IgG2a2.0 mg作为同型对照代替抗体腹腔注射,余处理与实验组相同.经上述处理后12h和48h后处死受 鼠,取其脾细胞及外周血,利用流式细胞技术检测T细胞的增殖及凋 亡.结果经抗体处理12h和 48h后,实验组T细胞未发生明显增殖;而对照组两时间点均可观察到CFSE标记细胞荧光强度明 显地减低, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明T细胞发生了分裂增殖.同时AnnexinV法可见,实验组标记有CD3一PE单抗的T 细胞12h发生了明显的凋亡,但48h却几乎无明显的凋亡细胞;而对照组两时间点则均未检测到明 显的细胞凋亡.两组间12h结果差异有统计学意义(P<O.01),但48h差异无统计学意义(P> 0.05).结论移植术前给予抗7公共链单抗联合供者细胞特异性输注,通过有效抑制针对供者抗原 发生效应的T细胞增殖,可进一步促使其发生凋亡而被有效清除,从而最终实现免疫耐受,且此种耐 受具有抗原特异性. 【关键词】受体,生长因子;免疫耐受;小鼠 MechanismofinductionoftransplanttoleranceviaYcsignalsblockadeinmur inemodelCHlANG Sheng,SHENShi—qian,CHENBi—cheng,ela1.InstituteofOrganTranspl antation,TongjtHos— pital,TongJiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnolo gy.Wuhan43()()3(). China [Abstract]ObjectiveToinvestigatethepossiblemechanismofinductionoftransplanttolerance viacommon7chain(7c).MethodsSplenocytes(5×10cells)fromC57BL/6(H一2)micewerehar— vestedandtransfusedintoT—celldeficientBalb/c(H一 2)nudemicethatwerereconstitutedwithsyn— geneicT-cells(3×10cellsfromwild-typeBalb/cmice)labeledwithCFSE.Ontheday2.recipients IL-2R[3mAb(TM-~I,0.5mg)anda receivedi.p.injectionofmixtureofanti— nti一7cmAbs(i.e., 4G3,3E12andTUGH12,0.5mg,respectively),ornomAbstreatmentinsteadofIgG2a,2.0mg(i— sotypecontrolgroup).ThelabeledT-cellswereisolatedandharvestedfromrecipientspleenafter12h or48hT-cellproliferationwasexaminedwithfluorescentdyelabelingtechniqueandT-cellapoptosis wasdetectedbyAnnexinVstaining.Flowcytometrywasusedtoanalyzetheresults.ResultsT-cell proliferationwasmarkedlyinhibitedandapoptoticTcellscouldbedetected12hafterthemAbsinjec— tion.Theproliferationwasconstantlyinhibited,butnomoreapoptoticT-cellswerefoundin48hIn controlgroup,however,T-cellsactivelyproliferatedandnOapoptosiswasdet ectedatbothtime points.ConclusionsThisresultmaybeassociatedwithinhibitionofantigen-s cellprolifera— pecificT— tionandinductionofapoptosis.Weanticipatethatthisprotocolmaydevelopa novelapproachtOin— ducedonor-specifictolerance. [Keywords]Receptors,Growthfactor;Immunetolerance;Mice T细胞介导的细胞免疫应答在同种移植急性排 斥反应中处于核心地位.目前认为,T细胞应答除 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3O271243) 作者单位:43OO3O武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院器 官移 植研究院教育部,卫生部器官移植重点实验室 了需要双信号系统刺激引起T细胞激活外,促进活 化T细胞增殖的第三类信号也对T细胞发挥免疫 效应,这中间T细胞生长因子(TCGFs)起着主要作 用.如果没有促进T细胞增殖的因子存在,或者其 作用被阻断,T细胞不能充分增殖,也就不能发挥效 中华器官移植杂志2005年旦箜鲞笠塑翌』Q!g塑!!!坐!垒竖!:!: 应.不同生长因子的受体不完全一样,但结构上有 共同之处,即存在一条公共的7链,称之为7c链. 7c链参与介导了T细胞生长因子的效应,如抗凋 亡,促进增殖等【1].最新研究表明,应用抗7c链单 抗可诱导啮齿类动物移植模型的长期存活_2],但对 其具体的作用机制仍了解不多.本研究旨在通过免 疫学及分子生物学技术对此加以探讨. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 一 ,实验动物 实验动物为C57BL/6小鼠(H一2),Balb/c小 鼠(H一2)及Balb/c裸小鼠(H一2),雌雄不限,6, 8周龄,体重约20g,由本研究所实验动物中心提 供. 二,主要试剂及仪器 三种抗7c链单抗(4G3,3E12,TUGn12),抗IL一 2单抗(TM—p1)及IgG2a(美国BDPharMingen 公司),CFDA—SE试剂盒及CD3一PE单抗(美国Mo— lecularProbe公司),全T细胞磁珠分离试剂盒(美 国MACS公司),AnnexinV—FITC凋亡试剂盒(德 国BoehringerMannheim公司).流式细胞检测应 用BDFACSCalur流式细胞仪(美国BD公司). 三,脾细胞悬液的制备 无菌条件下切取小鼠脾脏,置于盛有不完全 RPMI1640培养液的培养皿中.以2()()目尼龙滤 网包裹,无齿弯镊轻轻挤压至无红色脾组织块.吸 取滤液再次过200目尼龙滤网,并收集滤液.1500 r/min离心10min,Tris—NHC1裂解红细胞后,再 用不完全RPMI1640培养液洗涤3次,并调整终浓 度至实验所需(1×10,6×10/m1).台盼蓝染色 判定细胞活力>95. 四,CFDA—SE标记T细胞 收集野生型Balb/c小鼠脾细胞悬液(约3×10 个),严格按照MACS公司T细胞磁性分选 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 对CD3T细胞进行负性分选,得到CD3T细胞约 3×10个.应用荧光染料CFDA—SE对所分选T 细胞进行标记:将CFDA—SE原液(10mmol/L)加 PBS稀释制备成10~mol/L工作液,以37?工作液 孵育T细胞15rain;离心获细胞团,再以37?预热 的PBS重悬,并继续在37?孵育30rain;再次离心, PBS洗细胞,最后调整细胞浓度为6×1()/ml. 五,实验分组及处理 本研究分实验组和对照组.实验组:为抗体处 理组(=20),即将一定数量的野生型Balb/c小鼠 T细胞(约3×10个)输注给Balb/c裸小鼠,部分 重建并模拟其T细胞免疫的同时,给予供者抗原 (C57BL/6小鼠脾细胞约5×10个,并经丝裂霉素 C处理)刺激,24h后经腹腔注射抗7c单抗(4G3, 3E12,TUGm2,各0.5rag)和抗IL一2受体口链单抗 (TM一81,0.5rag)混合液2.0mg.并分别于注射后 12h和48h处死受鼠,取外周血单个核细胞及脾细 胞,通过流式细胞仪检测T细胞增殖及凋亡情况. 对照组(=20):即以IgG2a2.0mg作为同型对照 代替抗体腹腔注射,余处理与实验组相同.同时,每 组根据检测目的及处理方式不同再平均分为两个亚 组:a亚组和b亚组(=10).其中a亚组将野生型 Balb/c小鼠T细胞用CFDA—SE标记后输注给 Balb/c裸小鼠,获取细胞后通过流式细胞仪观察T 细胞的平均CFSE荧光强度变化,判断T细胞的增 殖情况;而b亚组中野生型Balb/c小鼠T细胞输注 前不用CFDA—SE标记,获取细胞后以AnnexinV— FITC凋亡试剂盒通过流式细胞仪检测T细胞的凋 亡情况. 六,统计学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 本实验数据均以均数? 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差表示,凋亡程度 以百分率表示.应用SPSS11.5软件包进行数据分 析,P<().05为差异有统计学意义. 结果 一 ,T细胞增殖的检测 实验组经抗体处理12h和48h后,流式细胞 仪检测未见CFSE标记细胞的分裂峰及荧光强度倍 减现象,说明免疫重建后的裸小鼠体内T细胞未发 生明显增殖;而对照组腹腔注射IgG2a后,两时间 点均可观察到明显的CFSE标记细胞的分裂峰,表 明T细胞发生了分裂,增殖(图1,图2).此结果说 明阻断7c信号传导,可显着抑制受者T细胞针对 供者抗原的增殖. 二,T细胞凋亡的检测 实验组经抗体混合液腹腔注射后12h,Annex— inV法可见标记有CD3一PE单抗的T细胞发生了 明显的凋亡,PE染色细胞平均凋亡率为41.7(),但 48h却几乎无明显的凋亡细胞(平均凋亡率为 4.32).而在对照组则两时间点均未检测到明显 细胞凋亡(平均凋亡率分别为4.34%和4.05%), 见图3,图4.两组问处理12h后结果差异有统计学 中华器官移植杂志2005年8月第26卷第8期ChinJOrganTranspla!, 垒ug!!:,: CrocCroc 注:给予抗体或IgG2a处理12h后,CFSE标记T细胞 在实验组未发生增殖;而在对照组发生了一定程度 的增殖. 图1处理12h后CFSE标记T细胞的比较 2 2 8 磐景 ?导 u昌 昌 2 0 CrccCrcc 注:给予抗体或IgG2a处理48h后,CFSE标记T细胞 在实验组同样未发生增殖;而在对照组发生了非常 明显的增殖. 图2处理48h后CFSE标记T细胞的比较 0 — 0 一 山 山 n0 0一 U 0 — 0 l 实验组 i ‘ ? :0?. , . ‘: ‚?’.,. , Annexin—FITCAnncxin 注:给予抗体或IgG2a处理12h后,实验组PE标记T 细胞发生了一定程度的凋亡;而对照组无明显凋亡. 图3处理12h后PE标记T细胞的比较 0 — 0 一 山 山 n0 0一 U 0 — 0 l 实验组 纛.;: _l__曩譬 罩勇霸 对照组 誊 l_暑 . Armexin..FITCAnnexin.FITC 注;给予抗体或IgG2a处理48h后,实验组及对照组PE 标记T细胞均未发生明显的凋亡. 图4处理48h后PE标记T细胞的比较 意义(P<0.O1),但处理48h后差异无统计学意义 (P>0.05). 讨论 随着移植外科临床的进展以及新型免疫抑制药 物的不断涌现,临床器官移植效果逐年改善,但免疫 抑制药物的毒副作用一直是阻碍其进一步发展的大 问题.诱导特异性移植免疫耐受一直是移植领域的 目标之一,针对T细胞应答的不同环节进行干预是 诱导移植耐受的主要方法. 目前认为,T细胞应答除了需要抗原刺激信号 和共刺激信号引起T细胞激活外,还需要另外一类 信号促进激活的T细胞增殖后才能进人效应阶段, 如T细胞生长因子(TCGF).TCGF是一类协助T 细胞分裂,增殖的生长因子,包括IL一2,IL一4,II一7, IL一9,IL一15,IL一21等,其中IL-2更是在移植排斥反 应中起着至关重要的作用.T细胞激活后45min IL一2开始分泌,与激活前相比,含量可增加1000倍 以上.同时,IL一2受体a链于2h后开始表达,并与 组成性表达的IL一2受体J3,7链构成高亲合力三聚 体.IL一2与受体结合,启动由IL一2受体J3,7链介导 的信号转导通路.结果,不仅T细胞能持续激活, 而且把T细胞推入分裂周期,使之增殖分化].如 果促进T细胞增殖的细胞因子缺乏或者其作用被 阻断,T细胞不能充分增殖,则不能发挥其效应.目 前临床应用的新型免疫抑制剂巴利昔单抗(商品名: 舒莱)为人鼠嵌合型抗IL一2受体a链的单抗,即是 针对IL-2发挥作用,在临床免疫诱导治疗中取得了 较好的效果.而IL-2受体7链作为不同TCGF受 体共有的一条链(故又称之为7c链),参与介导了 TCGF的重要效应,如抗凋亡,促进增殖等l1]. 最新研究表明,应用抗7c链单抗阻断TCGF 的作用,可诱导啮齿类动物移植模型的长期存活,但 对其机制的研究仍不充分.我们也曾通过移植术前 应用抗7c单抗联合供者细胞特异性输注,在 C57BL/6小鼠H—Y皮肤移植模型巾成功地诱导了, 免疫耐受,实验组移植物存活时间均超过I【lIJd. Balb/c裸小鼠为免疫缺陷小鼠,这种小鼠与普 通Balb/c小鼠MHC完一致,但无胸腺,不能使 T细胞正常分化,缺乏成熟T细胞的辅助,抑制及 杀伤功能,无移植排斥反应.将一定数量的普通 Balb/c小鼠T细胞输注给Balb/c裸小鼠即可部分 重建并模拟其T细胞免疫.本研究通过追踪裸小 中华器官移植杂志20年笠鲞笠塑!g!!P!!垒!!!!! 鼠体内标记T细胞对供者抗原识别后所发生的一 系列改变,试图来阐明抗7c单抗联合供者细胞特异 性输注诱导移植免疫耐受的机制. CFDA-SE是一种非极性分子,无色无荧光,可 被动扩散至细胞内,当被细胞内酯酶分解后可产生 强荧光的CFSE.CFSE可自发不可逆地通过赖氨 酸侧链或其他可利用的胺,偶联到细胞蛋白质上. CFSE标记的静止细胞的荧光可在长达几个月的时 期内保持稳定.当细胞分裂或融合时,CFSE标记 物可平均分配到两个子代细胞中,但不会转移至毗 邻细胞.随着单个细胞中CFSE量的减半,其荧光 强度也.减为亲代细胞的一半.这样,在一个增殖的 细胞群中.各连续代细胞的荧光强度呈2倍递减,并 且能够利用流式细胞仪对标记细胞进行分析L4]. 实验结果显示,在供者细胞特异性输注后第2 d.给予抗c单抗和抗IL-2受体B链单抗混合液腹 腔注射,12h及48h后,经流式细胞仪检测,均未见 CFSE标记细胞分裂峰及荧光强度有倍减现象,说 明免疫重建后的裸小鼠体内T细胞未发生明显增 殖;而对照组两时间点均可观察到明显的CFSE标 记细胞分裂峰及荧光强度的减低,表明T细胞发生 了分裂,增殖.此结果说明通过阻断c信号传导, 可显着抑制受者T细胞针对供者抗原的增殖.这 可能是因为,正常情况下,和IL-2受体J3,7链结合 的各种Jak分子(如Jakl和Jak3),可借B,-/链的二 聚化发生相互磷酸化而激活.激活的Jak使受体亚 单位胞内段上的酪氨酸残基磷酸化,进而募集,活化 转录因子STAT,并最终使T细胞进人分裂周期开 始分裂,增殖l5..而当yc信号传导被阻断,这一系 列反应则在上游阶段即被终止,因而也就不会发生 T细胞的分裂,增殖.同时,上述效应的阻断,进一 步使细胞内Bcl一2水平下调,从而使T细胞发生凋 亡_7].这一点在我们的结果中也得到了证实,抗体 注射后12h,AnnexinV法可见标记有CD3一PE单 抗的T细胞发生了明显的凋亡,但48h后却几乎无 明显的凋亡细胞.而对照组则两时间点均未检测到 明显T细胞凋亡.两组间比较,12h后结果差异有 统计学意义(P<().01),但48h后差异无统计学意 义(P>().05).我们分析之所以在实验组48h后检 测不到明显的凋亡.可能是由于当T细胞发生凋亡 后,所形成的凋亡小体很快被邻近的巨噬细胞,上皮 细胞等识别,吞噬,消化.由于这一过程很快,有时 甚至在几分钟,十几分钟即可完成,因此较难观察 到. 通过以上研究及分析,我们认为,在移植术前给 予抗y公共链单抗联合供者细胞特异性输注,通过 有效抑制针对供者抗原发生效应的T细胞增殖,可 进一步促使其发生凋亡,从而被有效清除,并最终实 现免疫耐受.这与传统上采用抗CD3抗体或免疫 毒素的清除方式相比有显着不同.用抗CD3抗体 或免疫毒素只能非特异性地杀伤受者T细胞,这种 非特异性方式与传统的免疫抑制剂没有区别;而本 研究中清除的是受者体内针对供者的抗原反应性T 细胞,但保留了受者其它克隆的T细胞,因此具有 显着的特异性. 参考文献 1MalekTR,YuAX,ScibelliP,eta1.BroadprogrammingbyIL- 2receptorsignalingforextendedgrowthtomultiplecytokines andfunctionalmaturationofantigen—activatedTcells.JImmu— nol,2001,166:1675—1683. 2LiXC,ImaA,LiY,eta1.Blockingthecommongamma—chain ofcytokinereceptorsinducesTcellapoptosisandlong—termislet allograftsurviva1.JImmunol,2000,I64:II93一II99. 3周光炎.免疫应答基础.见:ReneJ,Duquesnoy,李幼平,主编. 移植免疫生物学.第1版.北京:科学出版社,2000.35. 4HuH,DongY,FengP.eta1.Effectofimmunosuppressantson T-cellsubsetsobservedinvivousingcarboxyfluoresceindiace— taresuccinimidylesterlabeling.Transplantation,2003,75: 1075—1077. 5KolenkoV,RaymanP,RoyB,eta1.DownregulationofJAK3 proteinlevelsinTlymphocytesbyprostaglandinE2andother cyclicadenosinemonophosphate-elevatingagents:impactonIn— terleukin-2receptorsignalingpathway.Blood,1999,93:2308— 2318. 6UribeL,WeinbergKI.X—linkedSCIDandotherdefectsofcyto— kinepathways.SeminHematol,1998,35:299—309. 7LindemannMJ,BenczikM,GaffenSL.Anti—apoptoticsignaling bytheinterleukin一2receptorrevealsafunctionforcytoplasmic tyrosineresidueswithinthecommongamma(gammac)receptor subunit.JBiolChem,2()03,278:10239—10249. (收稿日期:2004—05—08)