衍生化荧光分光光度法测定硫酸小诺霉素含量
衍生化荧光分光光度法测定硫酸小诺霉素
含量
'中国医药研究>第2卷第2期(总第3期)2OO4年4月 衍生化荧光分光光度法测定硫酸小诺霉素含量
中图分类号ILO27.2
李忻?于倩?
文献标识码B文章编号1729—9306(2004)02-一0054—02 部标WS-212—87中测定硫酸小诺霉素含量,采用的仍是经 典的微生物法测定其含量,这种测定方法需要较长时间,细菌 培养至少需要18小时左右,而且不同实验室难于获得一致结 果.亦有报道,宓晓黎|4等人用HPLC法测定其发酵产物的 含量.小诺霉素本身不能发射荧光,但和荧光衍生化试剂邻苯 二甲醛(OPA)行胺缩醛反应后,即能吸收特定波长的紫外线, 发射荧光.本法即利用此种机理,进行了小诺霉素(MCR)含量 测定方法的探讨,并与衍生化紫外分光光度法和RP-HPLC 法进行了比较,实验证明本法准确性高,重现性好,快速,简 便,易为一般医院,药厂接受.现报道如下.
1试剂与仪器
硫酸小诺霉素
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
品:由吉林省药品检验所提供,效价为 608u/mg.
化学试剂:硼酸,氢氧化钾,乙酸乙脂,甲醇,无水亚硫酸氢 钠,EDTA-2K,以上试剂均为
分析
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纯(AR).邻苯二甲醛,2.巯基 乙醇,三蒸馏水.
RF-510岛津荧光分光光度仪,附DP-80Z打印系统; AEL-200型湘仪.岛津电子分析天平,附EP-50打印系统; 涡漩式混合器;80-2型离心沉淀机;25型酸度计;恒温水 浴箱.
2试液的配制
2.1标准贮备液精密称取硫酸小诺霉素标准品
16.45mg,置于100ml洁净容量瓶中,加适量三蒸馏水,振摇使 其溶解,然后用三蒸馏水稀释至刻度,即为100u/ml的硫酸小 诺霉素标准贮备液.
2.2邻苯二甲醛(OPA)试液的配制称取硼酸1g,溶 于38ml水,用氢氧化钾溶液(450g/L)调至pH10.4;另称取OPA 200mg,用2ml甲醇溶解,加入0.4ml2-巯基乙醇.两种溶液混 匀,充氮气避光4~C保存.
3实验方法的建立
3.1测定波长(,)的选择试样A:精密吸取100
u/ml的标准贮备液0.15ml,置于lOml具塞刻度离心管中,加三 蒸馏水0.35ml,加OPA试液0.5ml,摇匀,置于25?水浴中暗处 反应10分钟,取出,加乙酸乙酯5ml,涡漩混合器上振荡30秒 钟,250O转/分离心5分钟.
试样B:以三蒸馏水代替标准贮备液,其余操作同上. 取试样B的上层有机相为空白对照,与试样A的上层有 机相分别在300,400nln,375,50Ohm间进行扫描,绘制荧光衍 生物的荧光激发光谱和发射光谱,=345nm,=425nm. 3.2操作步骤精密吸取样品溶液适量,置于10ml具塞 ?吉林大学中日联谊医院长春市130033
?
54?
刻度离心管中,加三蒸馏水至0.5ml,加OPA试液0.5nil,振摇 均匀,置25?水浴中暗处反应10分钟,加5rrd乙酸乙酯,涡漩 混合30秒,25o0转/分离心5分钟.并同时用三蒸馏水代替样 品溶液平行操作,作为空白对照.吸取上层有机相在 345lun,425lun,灵敏度x1条件下测定荧光强度F. 3.3衍生物稳定性考察精密吸取标准贮备液0.1ml,按
"操作步骤"项下操作.吸取上层有机相分别在即刻,15分钟, 30分钟,6o分钟,120分钟测定荧光强度,分别为:98.4,98.5, 97.0,92.6,86.8,由此可见,衍生物至少在30分钟内是稳定的. 4实验步骤
4.1标准曲线的绘制精密吸取标准贮备液6fd,12fA, 24td,4896,120td,150ta,按"操作步骤"项下操作,吸取上层 有机相在345lun,425nm测定荧光强度,得回归方程: F(荧光强度)=50.7044C(u/mD一4.4174,r=0.9997 结果
表
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明:小诺霉素浓度在0,3u/nil范围内与荧光强度 成正比.
4.2样品测定取硫酸小诺霉素注射液0,1n1l,置25?ll 洁净容量瓶中,用三蒸馏水稀释至刻度,再取此液5O,按"操 作步骤"项下操作,每批取样5次,观测三批,结果见表1. 表1样品测定结果(,l=5)
5方法的
评价
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5.1回收率试验精密称取硫酸小诺霉素标准品适量, 按处方配制注射液依法测定,结果见表2.
表2回收率试验结果(,l=5)
5.2Et内,Et问变异取标准贮备液0.1ml,4份,按"操 作步骤"项下操作,得均数为10.04u,Et内变异0.372%. ChineseMedicineStudyVol2,No.2(sumNo.3)Apr.2OO4
在1,2.4天分别取标准贮备液0.1ml,按"操作步骤"项下 操作,得均数为10.10u,日间变异0.96%.
5.3几种方法的比较取不同批号的硫酸小诺霉素注射 液分别用本法,衍生化紫外分光光度法和高效液相色谱法进行 含量测定,结果见表3.
表3三种方法测定硫酸小诺霉素含量的比较
5.4干扰实验分别取盐酸洁霉素,硫酸卡那霉素,硫酸 庆大霉素,硫酸链霉素各注射液适量,按本法测定,结果表明: 洁霉素,链霉素对本法无影响,而庆大霉素,卡那霉素对本法有 影响.
6讨论
6.1实验用具塞刻度离心管必须用30%硝酸溶液浸泡 24小时,以消除荧光杂质.否则得不到准确可靠,重现性好的 结果.
6.2邻苯二甲醛(OPA)遇光,遇氧都不稳定,所以OPA试 液用毕后必须充氮气置4~C冰箱内避光贮放,一般可使用3—4 天,但最好能现用现配,这也是本法的缺点.
6.3本法测定的是化学等值结果,不能反映真实的生物 (中国医药研究》第2卷第2期(总第3期)2004年4月 等值,但用于药厂及医院对已知样品的含量测定则完全可行. 6.4本法不仅能用于小诺霉素各类制剂的含量测定,还 可以用于发酵中间体,原料药的质量控制.
6.5对硫酸小诺霉素注射液来说,处方量的附加剂亚硫 酸氢钠,EDTA对测定结果无影响.
6.6庆大霉素(GqWI),托普霉素(TOB),卡那霉素,丁胺卡 那霉素(AMIK),西梭霉素等均对MCR测定有干扰,必须在确 定待测样品是MCR时,才能准确定量.
致谢:本实验得到江苏省微生物研究所赵敏工程师的大力 协助,特此致谢.
参考文献
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JIM-401一B的分离和鉴别.抗生素,1984,9(2):94—98 [4]宓晓黎,等.国产相模湾霉素的高效液相色谱测定法.抗生素,1987, 12(1):28
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[6]黄波,等.反相高效液相色谱法测定硫酸小诺霉素含量.待发表资料 [7]安登魁,主编.药物分析第二版.北京:人民卫生出版社,1986,324 [收稿日期2004—01—263
中药治疗第五腰脊神经根病变综合症1例
李旭0
中图分类号R681.54文献标识码B文章编号1729—9306(2004)02—0055—01 患者男,54岁.自述1997年第五腰椎间盘突出手术治疗 愈后情况良好,并能从事轻体力劳动,2001年5月1日突发后 右腿疼痛,夜不能眠,经某院理疗,牵引后右腿疼痛基本消失, 后又找一医生按摩,第五天右腿又觉疼痛,第六天按摩完后右 腿疼痛难忍,走路跛行,合并右足下垂,于2001年6月3日来 我院诊治.
1检查
Lasegue氏测验(举腿试验)(十):Bonnet检查:Macey氏测 验,均符合腰间盘突出症状;伴有右足下垂;CT所见第五腰椎 间盘突出,右侧神经根受压,以上五项检查确诊为第五腰脊神 经根病变综合症.
2治疗
常规牵引,理疗一周,右侧坐骨神经痛消失,右足下垂依然 如故.自拟"神经再生灵"组方:川牛夕,川断,何首乌,穿山甲, ?黑龙江省铁力市铁力农场职工医院152/X~
OfineseMedicineStudyVol2,No.2(suIllNo.3)Apt.2O04
皂刺,威灵仙,黄柏,白芥子,木香,蜈蚣,淫羊藿,独活,百楠叶, 全蝎,熟附子,鹿角胶,当归等十七味中药.麝香少许为引.功
能:续接神经,强壮神经,疏通,营养神经.用法日一剂水煎分 服.
3方解
方中何首乌强壮神经,川断,蜈蚣等二味现代药理研究有 续接神经之功效,与其余药相配对续接强壮神经,疏通,营养神 经有良效.
4分析
笔者认为患者本为单纯性腰间盘突出,坐骨神经痛,但后 来由于采取按摩的手法太重或误治从而轻度挫伤神经,导致下 垂足,临床不多见.笔者在以前治疗脊椎骨折导致神经挫伤处 理的基础上,自拟用"神经再生灵"治疗此病,患者服用四剂后 右脚屈伸基本正常,病人满意,停止治疗.2002年1月3日随 访患者已正常,并能从事轻体力劳动.
[收稿日期20O4—01—123
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55?