基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比

基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比 李诗鹏，李  强，石正松，蔡伟良，宁寅宽，陶  旋(桂林医学院附属医院急诊创伤外科，广西壮族自治区桂林市  541001) 引用本文：李诗鹏，李强，石正松，蔡伟良，宁寅宽，陶旋. 基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比[J].中国组织 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究，2017，21(9):1340-1345. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.006    ORCID: 0000-0001-9327-3574(李强) 文章快速阅读： 不同病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的效果 文题释义：腺病毒载体：是无包膜的双链DNA病毒，基因组DNA片段在感染和触发时是瞬时表达，但仍是游离体，其宿主范围广，能够容纳较大的外源基因片断，然而载体基因不整合到宿主基因组中，且体内转染后对细胞产生很强的细胞免疫反应，因此腺病毒治疗潜力仅限于病毒蛋白的免疫反应，临床上已大幅度减少腺病毒载体应用。慢病毒：是单链RNA病毒，基因组的基因传递系统可以随机将外源基因整合到宿主细胞基因组中，并能灭活关键的管家基因或肿瘤抑制基因，他们能够高效率的感染分裂细胞，如骨髓间充质干细胞，有效的把目的基因转入细胞中，进行基因治疗。摘要 李诗鹏，男，1990年生，汉族，甘肃省兰州市人，桂林医学院在读硕士，主要从事骨组织工程研究。 通讯作者：李强，主任医师，教授，硕士生导师，桂林医学院附属医院急诊创伤外科，广西壮族自治区桂林市 541001 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)09-01340-06 稿件接受：2016-11-17 Li Shi-peng, Studying for master’s degree, Department of Emergency Traumatic Surgery, the Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Corresponding author: Li Qiang, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Emergency Traumatic Surgery, the Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China 背景：腺病毒载体和慢病毒载体均是较好的组织工程基因载体，两者在介导骨形态发生蛋白2转染兔骨髓间充质干细胞中的差异尚待探究。 目的：比较腺病毒和慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染体外培养兔骨髓间充质干细胞的转导效率、持续时间及外源基因表达差异。方法：将第5代兔骨髓间充质干细胞分3组培养，A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Ad-EGFP/BMP-2)转染细胞，B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2(Lenti-EGFP/BMP-2)转染细胞，C组为未进行转染。转染24 h、48 h、72 h、1周、3周，检测EGFP基因表达；转染72 h后，免疫组织化学观察细胞骨形态发生蛋白2的表达；转染后72 h、1周、3周，Western blot检测骨形态发生蛋白2蛋白表达。结果与结论：①转染24 h后，A、B组可见EGFP表达，A组明显强于B组；转染48 h后，A、B组荧光进一步增强；转染72 h后，A组荧光强度近高峰，B组荧光持续增强。转染1周后，A组荧光强度开始下降，B组荧光强度仍然增强。转染3周后，A组荧光强度明显下降甚至消失，B组荧光强度有所下降，但仍然保持一定的表达。C组在各时间点均无EGFP表达；②A、B组胞浆均呈骨形态发生蛋白2阳性表达，C组呈阴性表达；③转染72 h后，A组骨形态发生蛋白2蛋白表达量强于B组；转染1周后，A组表达下降，B组表达增强并强于A组；转染3周后，A组表达微弱，B组持续表达且明显强于A组；④结果表明，相对腺病毒载体，慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势。关键词：干细胞；骨髓干细胞；慢病毒载体；腺病毒载体；骨髓间充质干细胞；基因转染；骨形态发生蛋白类；国家自然科学基金主题词：干细胞；腺病毒科；慢病毒属；间质干细胞；组织工程基金资助：国家自然科学基金资助项目(31160199)；广西区自然科学基金资助项目(2014GXNSFAA118263)缩略语：骨形态发生蛋白：bone morphogenetic proteins，BMPs Comparison of lentiviral vector and adenoviral vector mediated gene transfer into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells Li Shi-peng, Li Qiang, Shi Zheng-song, Cai Wei-liang, Ding Yin-kuan, Tao Xuan (Department of Emergency Traumatic Surgery, the Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Both lentiviral vector and adenoviral vector are considered as good vectors for gene mediation, and their differences in transferring bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are unclear. OBJECTIVE: To compare the duration, efficiency and the deviation of exogenous gene expression after rabbit BMSCs transfection using lentiviral vector and adenoviral vector which are used to mediate enhanced green fluorescent proteins (EGFP) and BMP-2. METHODS: Rabbit BMSCs at passage 5 were exposed to Ad-EGFP-BMP-2 (group A) or Lenti-EGFP-BMP-2 (group B) with multiplicity of infection of 100, as transfection groups. And in control group (group C), the same quality of culture medium was required equivalent to the groups A and B. The expression of EGFP was observed by inverted fluorescence microscope at various time intervals. And the expression of exogenous gene BMP 2 in cells was detected and analyzed by immunohistochemical staining at 72 hours after transfection as well as by western blot at 72 hours, 1, 3 weeks after transfection. RESULTS AND CONCLUSION: The intense green fluorescence emerged under the microscope at 24-48 hours after transfection in group A, which was stronger than group B, reached the peak at 72 hours, and then decreased at 1 week until disappearance at 3 weeks. No EGFP expression was detected in group C. High expression of BMP-2 was found in group A but was dramatically downregulated after 1 week. Group B showed the high expression of EGFP/BMP-2 persisted for a longer period after transfected that even lasted for 3 weeks. Overall, the lentiviral vector and adenoviral vector can efficiently transfect rabbit BMSCs and stably express the target gene of EGFP/BMP-2. Under the same MOI, compared to the adenoviral vector, transfection of lentiviral vector to rabbit BMSCs is more effectively and expression of EGFP/BMP-2 can be persistent in a longer term. Subject headings: Stem Cells; Adenoviridae; Lentivirus; Mesenchymal Stem Cells; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31160199; Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2014GXNSFAA118263 Cite this article: Li SP, Li Q, Shi ZS, Cai WL, Ding YK, Tao X. Comparison of lentiviral vector and adenoviral vector mediated gene transfer into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(9):1340-1345. 0  引言  Introduction 骨组织工程在治疗骨科疾病如骨缺损等方面展现了良好的前景[1]。骨组织工程学3个基本要素之一的种子细胞选取极其重要。目前较为理想的种子细胞为骨髓间充质干细胞，其是有着向成骨方向分化潜能的多能干细  胞[2-3]。细胞调控因子是另一个重要的基本要素。之所以选择骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)，是因其具有较强促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的能力，并且在体内外都能诱导成骨[4]。BMP-2是其中具有较好单独成骨效果的BMPs之一，并且其具有诱导间叶细胞和骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力[5-7]；但效价低、持续时间短等因素成为了外源性植入BMP-2的缺点。病毒载体介导基因转染技术在解决此缺点上具有良好的应用前景[8]。由于国内外常用的腺病毒载体系统具有随时间推移出现目的基因丢失的现象，而降低了效果[9]。慢病毒载体系统作为新兴的载体系统，研究表明其具有一定的优越性[10-11]。但有关这两种病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的表现研究较少。因此实验比较了腺病毒载体和慢病毒载体在转染兔骨髓间充质干细胞方面的差异，同时将BMP-2基因转染入兔骨髓间充质干细胞，为之后研究基因治疗修复骨缺损提供基础。 1  材料和方法  Materials and methods 1.1  设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计   体外对比观察实验。 1.2 时间及地点  实验于2015年4月至2016年6月在桂林医学院科学实验中心完成。 1.3  材料 实验动物：清洁级健康7 d龄新西兰大白兔10只，雌雄不拘，体质量70-100 g，由桂林医学院动物实验中心提供，许可证号：scxk(桂)2013-0001。实验中所有处置完全按照动物伦理学标准执行。 实验试剂与仪器：腺病毒载体的构建和鉴定由invitrogen公司完成，腺病毒载体的构建和鉴定由上海吉凯基因化学技术有限公司完成；DMEM细胞培养基(Hyclone)；胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶(四季青) ；BMP-2单克隆抗体(Bioworld)；流式一抗小鼠抗兔CD44/CD45、CD29(Antigenix)；同型对照小鼠抗兔IgG1k(eBioscien)；流式二抗PerCP标记(Jackson ImmunoResearch)；CO2培养箱、-80 ℃超低温冰箱、液氮罐(Thermo)；流式细胞仪(BD)；生物安全柜(苏州苏洁)；倒置相差显微镜(Nikon)；化学发光仪(BIO-RAD)。 1.4  实验方法 1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的原代提取培养  将兔处死后，无菌条件下取出胫骨和股骨，去除干骺端，暴露骨髓腔，以含体积分数2%胎牛血清的PBS冲洗髓腔，收集并吹散骨髓细胞，离心弃上清，含体积分数10%胎牛血清的DMEM重悬细胞于100 mm培养皿中，在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，孵育48h后，换液，72 h后再次换液，之后每3 d换液，以逐渐去除非目的细胞，每日观察细胞生长情况及形态改变。细胞融合度约90%时1∶2传代[12-13]。 1.4.2 骨髓间充质干细胞表面分子标记流式细胞仪检测待第5代融合度达到90%左右时，制成细胞浓度为1×1010 L-1的细胞悬液，加入相应CD44、CD45、CD29抗体，4 ℃孵育，检测前加入适当PBS至总体积200 μL，上机检测。 1.4.3  病毒转染骨髓间充质干细胞  收集第5代骨髓间充质干细胞种于6孔板中，分为3组，每组6个复孔。A组以腺病毒载体介导EGFP/BMP-2(Ad-EGFP/BMP-2)转染细胞，B组以慢病毒载体介导EGFP/BMP-2(Lenti-EGFP/BMP-2)转染细胞，C组未进行转染。预培养后，A、B组以感染复数100转染，转染24 h后换液继续培养。 1.5 主要观察指标 转染后EGFP表达：在倒置荧光显微镜下观察转染EGFP基因24 h、48 h、72 h、1周、3周后的EGFP表达情况。随机选取3个视野/孔，在同一视野下用荧光显微镜视野中表达的EGFP细胞数目/光镜下视野中存活的细胞总数目表示该视野的转染率，最后计算出各孔和各组的平均转染率。 免疫化学染色检测BMP-2表达：分别取转染72 h后的3组细胞，胰酶消化，爬片，浸入40 g/L多聚甲醛，按 SP免疫组织化学染色法操作，DAB显色，封固，倒置显微镜观察。 Western blot检测BMP-2蛋白表达：分别收集转染后72 h、1周及3周的3组细胞，BCA蛋白检测蛋白浓度后，以10%SDS-PAGE电泳分离。电泳完毕后转膜，5%脱脂奶TBST封闭1 h，加入鼠抗兔BMP-2单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，辣根酶标记的鼠抗兔抗体常温孵育1 h，加底物TMB显色，根据β-actin为参考标准，计算出每组蛋白相对表达量。 1.6  统计学分析  统计软件使用SPSS 20.0，计量资料以 表示；多组之间比较时，首先进行Levene检验，方差齐者，采用ANOVA法检验，两两比较采用LSD-t 检验；方差不齐者，进行非参数检验，两两比较采用 Mann-Whitney U 法。检验水准α=0.05。 2  结果  Results 2.1  原代培养的骨髓间充质干细胞形态  原代细胞培养24 h后，部分细胞即可贴壁，细胞呈圆形或椭圆形，折光性强。培养72 h后，细胞基本完全贴壁，细胞呈长梭形，涡旋状排列。原代细胞生长缓慢，第10天时，细胞融合度可达90%。传代至第5代后，骨髓间充质干细胞为单一的细胞群，见图1。 2.2  骨髓间充质干细胞表面标志物的鉴定  流式细胞仪检测结果显示，培养的第5代骨髓间充质干细胞表面标志物均一表达CD44、CD29，阳性率90%以上，CD45阴性，结果基本符合骨髓间充质干细胞特征，见图2。 2.3  转染后兔骨髓间充质干细胞EGFP表达  Ad-EGFP/ BMP-2和Lenti-EGFP/BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞后 EGFP转染效率，见图3；EGFP荧光表达情况，见图4。转染24 h后，A、B两组各孔均可见EGFP表达，但A组明显多于B组；转染48 h后，A、B两组荧光进一步增多；转染72 h后，A组荧光表达近高峰，B组荧光表达持续增多；转染1周后，A组荧光表达开始下降，而B组荧光表达仍然增强；转染3周后，A组荧光表达明显下降甚至消失，B组阳性细胞有所减少，荧光有所下降，但仍然保持一定的表达；C组在各时间点均无EGFP表达。 2.4  免疫细胞化学检测BMP-2表达  转染后的A、B两组骨髓间充质干细胞胞浆均呈BMP-2阳性表达，可见棕黄色染色；C组细胞呈BMP-2阴性表达，见图5。 2.5 Western blot检测BMP-2蛋白表达  A、B组转染后不同时间点BMP-2蛋白均为阳性表达，C组均为阴性表达。转染72 h后，A组表达量强于B组，见图6a；转染1周后，A组表达下降，B组表达增强并强于A组，见图6b；转染3周后，A组表达微弱，B组持续表达且明显强于A组，见图6c。 图1 倒置相差显微镜观察第5代兔骨髓间充质干细胞(×100) Figure 1 The cell morphology of the 5th generation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells (×100) 图注：骨髓间充质干细胞为单一的细胞群。 图2 第5代兔骨髓间充质干细胞表面标志表达情况 Figure 2 Surface antigen expression of the 5th generation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells 图注：图中A、B、C分别为CD29、CD44、CD45阴性对照组，D、E、F分别为骨髓间充质干细胞CD29、CD44、CD45表型。 24 h 48 h 72 h 1周 3周 A组 B组 图4 转染后不同时间点各组EGFP基因荧光表达(倒置荧光显微镜，×100) Figure 4 The fluorescence intensity of enhanced green fluorescent protein gene under inverted fluorescence microscope (×100) 图注：A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞，B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞。转染24 h后，A、B两组各孔均可见EGFP表达，但A组明显多于B组；转染48 h后，A、B两组荧光进一步增多；转染72 h后，A组荧光表达近高峰，B组荧光表达持续增多；转染1周后，A组荧光表达开始下降，而B组荧光表达仍然增强；转染3周后，A组荧光表达明显下降甚至消失，B组阳性细胞有所减少，荧光有所下降，但仍然保持一定的表达。 A组 B组 C组 β-actin 43 A组 B组 C组 图注：图中A-C分别为腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染组、慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染组及未转染组。两转染组细胞胞浆呈骨形态发生蛋白2阳性表达，可见棕黄色染色；未转染组细胞呈骨形态发生蛋白2阴性表达。 骨形态发生蛋白2 26 A组 B组 C组 图5 各组骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2的表达(DAB染色，×200) Figure 5 The bone morphogenetic protein 2 protein expression in bone marrow mesenchymal stem cells (DAB staining, ×200) b a c Mr (×103) 图6 Western Blot检测各组骨形态发生蛋白2蛋白的表达 Figure 6 The bone morphogenetic protein 2 protein expression in each group by western blot analysis 图注：图中a-c分别为转染后72 h、1周及3周。A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞，B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞，C组为未转染组。 1.5 1.0 0.5 0 A组 B组 C组 A组 B组 100 80 60 40 20 0 1 d 2 d 3 d 1周 3周 平均转染率(%) 图3 各组转染后不同时间点EGFP基因平均转染效率 Figure 3 Enhanced green fluorescent protein transfection efficiencies in each group at different time after transfection 图注：A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞，B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞。两组不同时间点转染效率比较差异有显著性意义(P < 0.05)。 72 h 相对表达量 3周 1周 图7 各组不同转染时间的骨形态发生蛋白2相对表达量 Figure 7 The bone morphogenetic protein 2 protein relative expression in each group at different time after transfection 图注：A组以腺病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞，B组以慢病毒载体介导EGFP/骨形态发生蛋白2转染细胞，C组为未转染组。相同时间点下，3组间骨形态发生蛋白2蛋白表达两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；A、B组内不同时间点间比较差异有显著性意义 (P < 0.05)，C组组内不同时间点间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。