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基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比.doc

基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比

销魂天空唯独月色依旧
2019-05-03 0人阅读 举报 0 0 0 暂无简介

简介:本文档为《基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比doc》,可适用于医药卫生领域

基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比李诗鹏李 强石正松蔡伟良宁寅宽陶 旋(桂林医学院附属医院急诊创伤外科广西壮族自治区桂林市 )引用本文:李诗鹏李强石正松蔡伟良宁寅宽陶旋基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比J中国组织工程研究():DOI:jissn  ORCID:(李强)文章快速阅读:不同病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的效果文题释义:腺病毒载体:是无包膜的双链DNA病毒基因组DNA片段在感染和触发时是瞬时表达但仍是游离体其宿主范围广能够容纳较大的外源基因片断然而载体基因不整合到宿主基因组中且体内转染后对细胞产生很强的细胞免疫反应因此腺病毒治疗潜力仅限于病毒蛋白的免疫反应临床上已大幅度减少腺病毒载体应用。慢病毒:是单链RNA病毒基因组的基因传递系统可以随机将外源基因整合到宿主细胞基因组中并能灭活关键的管家基因或肿瘤抑制基因他们能够高效率的感染分裂细胞如骨髓间充质干细胞有效的把目的基因转入细胞中进行基因治疗。摘要李诗鹏男年生汉族甘肃省兰州市人桂林医学院在读硕士主要从事骨组织工程研究。通讯作者:李强主任医师教授硕士生导师桂林医学院附属医院急诊创伤外科广西壮族自治区桂林市中图分类号:R文献标识码:A文章编号:()稿件接受:LiShipeng,Studyingformaster’sdegree,DepartmentofEmergencyTraumaticSurgery,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,GuangxiZhuangAutonomousRegion,ChinaCorrespondingauthor:LiQiang,Chiefphysician,Professor,Master’ssupervisor,DepartmentofEmergencyTraumaticSurgery,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,GuangxiZhuangAutonomousRegion,China背景:腺病毒载体和慢病毒载体均是较好的组织工程基因载体两者在介导骨形态发生蛋白转染兔骨髓间充质干细胞中的差异尚待探究。目的:比较腺病毒和慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染体外培养兔骨髓间充质干细胞的转导效率、持续时间及外源基因表达差异。方法:将第代兔骨髓间充质干细胞分组培养A组以腺病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白(AdEGFPBMP)转染细胞B组以慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白(LentiEGFPBMP)转染细胞C组为未进行转染。转染h、h、h、周、周检测EGFP基因表达转染h后免疫组织化学观察细胞骨形态发生蛋白的表达转染后h、周、周Westernblot检测骨形态发生蛋白蛋白表达。结果与结论:①转染h后A、B组可见EGFP表达A组明显强于B组转染h后A、B组荧光进一步增强转染h后A组荧光强度近高峰B组荧光持续增强。转染周后A组荧光强度开始下降B组荧光强度仍然增强。转染周后A组荧光强度明显下降甚至消失B组荧光强度有所下降但仍然保持一定的表达。C组在各时间点均无EGFP表达②A、B组胞浆均呈骨形态发生蛋白阳性表达C组呈阴性表达③转染h后A组骨形态发生蛋白蛋白表达量强于B组转染周后A组表达下降B组表达增强并强于A组转染周后A组表达微弱B组持续表达且明显强于A组④结果表明相对腺病毒载体慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞在表达持续时间上具有一定的优势。关键词:干细胞骨髓干细胞慢病毒载体腺病毒载体骨髓间充质干细胞基因转染骨形态发生蛋白类国家自然科学基金主题词:干细胞腺病毒科慢病毒属间质干细胞组织工程基金资助:国家自然科学基金资助项目()广西区自然科学基金资助项目(GXNSFAA)缩略语:骨形态发生蛋白:bonemorphogeneticproteinsBMPsComparisonoflentiviralvectorandadenoviralvectormediatedgenetransferintorabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsLiShipeng,LiQiang,ShiZhengsong,CaiWeiliang,DingYinkuan,TaoXuan(DepartmentofEmergencyTraumaticSurgery,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,GuangxiZhuangAutonomousRegion,China)AbstractBACKGROUND:Bothlentiviralvectorandadenoviralvectorareconsideredasgoodvectorsforgenemediation,andtheirdifferencesintransferringbonemorphogeneticprotein(BMP)intorabbitbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)areunclearOBJECTIVE:Tocomparetheduration,efficiencyandthedeviationofexogenousgeneexpressionafterrabbitBMSCstransfectionusinglentiviralvectorandadenoviralvectorwhichareusedtomediateenhancedgreenfluorescentproteins(EGFP)andBMPMETHODS:RabbitBMSCsatpassagewereexposedtoAdEGFPBMP(groupA)orLentiEGFPBMP(groupB)withmultiplicityofinfectionof,astransfectiongroupsAndincontrolgroup(groupC),thesamequalityofculturemediumwasrequiredequivalenttothegroupsAandBTheexpressionofEGFPwasobservedbyinvertedfluorescencemicroscopeatvarioustimeintervalsAndtheexpressionofexogenousgeneBMPincellswasdetectedandanalyzedbyimmunohistochemicalstainingathoursaftertransfectionaswellasbywesternblotathours,,weeksaftertransfectionRESULTSANDCONCLUSION:TheintensegreenfluorescenceemergedunderthemicroscopeathoursaftertransfectioningroupA,whichwasstrongerthangroupB,reachedthepeakathours,andthendecreasedatweekuntildisappearanceatweeksNoEGFPexpressionwasdetectedingroupCHighexpressionofBMPwasfoundingroupAbutwasdramaticallydownregulatedafterweekGroupBshowedthehighexpressionofEGFPBMPpersistedforalongerperiodaftertransfectedthatevenlastedforweeksOverall,thelentiviralvectorandadenoviralvectorcanefficientlytransfectrabbitBMSCsandstablyexpressthetargetgeneofEGFPBMPUnderthesameMOI,comparedtotheadenoviralvector,transfectionoflentiviralvectortorabbitBMSCsismoreeffectivelyandexpressionofEGFPBMPcanbepersistentinalongertermSubjectheadings:StemCellsAdenoviridaeLentivirusMesenchymalStemCellsTissueEngineeringFunding:theNationalNaturalScienceFoundationofChina,NoNaturalScienceFoundationofGuangxiZhuangAutonomousRegion,NoGXNSFAACitethisarticle:LiSP,LiQ,ShiZS,CaiWL,DingYK,TaoXComparisonoflentiviralvectorandadenoviralvectormediatedgenetransferintorabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsZhongguoZuzhiGongchengYanjiu(): 引言 Introduction骨组织工程在治疗骨科疾病如骨缺损等方面展现了良好的前景。骨组织工程学个基本要素之一的种子细胞选取极其重要。目前较为理想的种子细胞为骨髓间充质干细胞其是有着向成骨方向分化潜能的多能干细 胞。细胞调控因子是另一个重要的基本要素。之所以选择骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteinsBMPs)是因其具有较强促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的能力并且在体内外都能诱导成骨。BMP是其中具有较好单独成骨效果的BMPs之一并且其具有诱导间叶细胞和骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力但效价低、持续时间短等因素成为了外源性植入BMP的缺点。病毒载体介导基因转染技术在解决此缺点上具有良好的应用前景。由于国内外常用的腺病毒载体系统具有随时间推移出现目的基因丢失的现象而降低了效果。慢病毒载体系统作为新兴的载体系统研究表明其具有一定的优越性。但有关这两种病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的表现研究较少。因此实验比较了腺病毒载体和慢病毒载体在转染兔骨髓间充质干细胞方面的差异同时将BMP基因转染入兔骨髓间充质干细胞为之后研究基因治疗修复骨缺损提供基础。 材料和方法 Materialsandmethods 设计 体外对比观察实验。时间及地点 实验于年月至年月在桂林医学院科学实验中心完成。 材料实验动物:清洁级健康d龄新西兰大白兔只雌雄不拘体质量g由桂林医学院动物实验中心提供许可证号:scxk(桂)。实验中所有处置完全按照动物伦理学标准执行。实验试剂与仪器:腺病毒载体的构建和鉴定由invitrogen公司完成腺病毒载体的构建和鉴定由上海吉凯基因化学技术有限公司完成DMEM细胞培养基(Hyclone)胎牛血清(Gibco)胰蛋白酶(四季青)BMP单克隆抗体(Bioworld)流式一抗小鼠抗兔CDCD、CD(Antigenix)同型对照小鼠抗兔IgGk(eBioscien)流式二抗PerCP标记(JacksonImmunoResearch)CO培养箱、℃超低温冰箱、液氮罐(Thermo)流式细胞仪(BD)生物安全柜(苏州苏洁)倒置相差显微镜(Nikon)化学发光仪(BIORAD)。 实验方法兔骨髓间充质干细胞的原代提取培养 将兔处死后无菌条件下取出胫骨和股骨去除干骺端暴露骨髓腔以含体积分数胎牛血清的PBS冲洗髓腔收集并吹散骨髓细胞离心弃上清含体积分数胎牛血清的DMEM重悬细胞于mm培养皿中在℃、体积分数CO培养箱中培养孵育h后换液h后再次换液之后每d换液以逐渐去除非目的细胞每日观察细胞生长情况及形态改变。细胞融合度约时∶传代。骨髓间充质干细胞表面分子标记流式细胞仪检测待第代融合度达到左右时制成细胞浓度为×L的细胞悬液加入相应CD、CD、CD抗体℃孵育检测前加入适当PBS至总体积μL上机检测。 病毒转染骨髓间充质干细胞 收集第代骨髓间充质干细胞种于孔板中分为组每组个复孔。A组以腺病毒载体介导EGFPBMP(AdEGFPBMP)转染细胞B组以慢病毒载体介导EGFPBMP(LentiEGFPBMP)转染细胞C组未进行转染。预培养后A、B组以感染复数转染转染h后换液继续培养。主要观察指标转染后EGFP表达:在倒置荧光显微镜下观察转染EGFP基因h、h、h、周、周后的EGFP表达情况。随机选取个视野孔在同一视野下用荧光显微镜视野中表达的EGFP细胞数目光镜下视野中存活的细胞总数目表示该视野的转染率最后计算出各孔和各组的平均转染率。免疫化学染色检测BMP表达:分别取转染h后的组细胞胰酶消化爬片浸入gL多聚甲醛按SP免疫组织化学染色法操作DAB显色封固倒置显微镜观察。Westernblot检测BMP蛋白表达:分别收集转染后h、周及周的组细胞BCA蛋白检测蛋白浓度后以SDSPAGE电泳分离。电泳完毕后转膜脱脂奶TBST封闭h加入鼠抗兔BMP单克隆抗体℃孵育过夜辣根酶标记的鼠抗兔抗体常温孵育h加底物TMB显色根据βactin为参考标准计算出每组蛋白相对表达量。 统计学分析 统计软件使用SPSS计量资料以表示多组之间比较时首先进行Levene检验方差齐者采用ANOVA法检验两两比较采用LSDt检验方差不齐者进行非参数检验两两比较采用MannWhitneyU法。检验水准α=。 结果 Results 原代培养的骨髓间充质干细胞形态 原代细胞培养h后部分细胞即可贴壁细胞呈圆形或椭圆形折光性强。培养h后细胞基本完全贴壁细胞呈长梭形涡旋状排列。原代细胞生长缓慢第天时细胞融合度可达。传代至第代后骨髓间充质干细胞为单一的细胞群见图。 骨髓间充质干细胞表面标志物的鉴定 流式细胞仪检测结果显示培养的第代骨髓间充质干细胞表面标志物均一表达CD、CD阳性率以上CD阴性结果基本符合骨髓间充质干细胞特征见图。 转染后兔骨髓间充质干细胞EGFP表达 AdEGFPBMP和LentiEGFPBMP转染兔骨髓间充质干细胞后EGFP转染效率见图EGFP荧光表达情况见图。转染h后A、B两组各孔均可见EGFP表达但A组明显多于B组转染h后A、B两组荧光进一步增多转染h后A组荧光表达近高峰B组荧光表达持续增多转染周后A组荧光表达开始下降而B组荧光表达仍然增强转染周后A组荧光表达明显下降甚至消失B组阳性细胞有所减少荧光有所下降但仍然保持一定的表达C组在各时间点均无EGFP表达。 免疫细胞化学检测BMP表达 转染后的A、B两组骨髓间充质干细胞胞浆均呈BMP阳性表达可见棕黄色染色C组细胞呈BMP阴性表达见图。Westernblot检测BMP蛋白表达 A、B组转染后不同时间点BMP蛋白均为阳性表达C组均为阴性表达。转染h后A组表达量强于B组见图a转染周后A组表达下降B组表达增强并强于A组见图b转染周后A组表达微弱B组持续表达且明显强于A组见图c。图倒置相差显微镜观察第代兔骨髓间充质干细胞(×)FigureThecellmorphologyofthethgenerationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcells(×)图注:骨髓间充质干细胞为单一的细胞群。图第代兔骨髓间充质干细胞表面标志表达情况FigureSurfaceantigenexpressionofthethgenerationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcells图注:图中A、B、C分别为CD、CD、CD阴性对照组D、E、F分别为骨髓间充质干细胞CD、CD、CD表型。hhh周周A组B组图转染后不同时间点各组EGFP基因荧光表达(倒置荧光显微镜×)FigureThefluorescenceintensityofenhancedgreenfluorescentproteingeneunderinvertedfluorescencemicroscope(×)图注:A组以腺病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞B组以慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞。转染h后A、B两组各孔均可见EGFP表达但A组明显多于B组转染h后A、B两组荧光进一步增多转染h后A组荧光表达近高峰B组荧光表达持续增多转染周后A组荧光表达开始下降而B组荧光表达仍然增强转染周后A组荧光表达明显下降甚至消失B组阳性细胞有所减少荧光有所下降但仍然保持一定的表达。A组B组C组βactinA组B组C组图注:图中AC分别为腺病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染组、慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染组及未转染组。两转染组细胞胞浆呈骨形态发生蛋白阳性表达可见棕黄色染色未转染组细胞呈骨形态发生蛋白阴性表达。骨形态发生蛋白A组B组C组图各组骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白的表达(DAB染色×)FigureThebonemorphogeneticproteinproteinexpressioninbonemarrowmesenchymalstemcells(DABstaining,×)bacMr(×)图WesternBlot检测各组骨形态发生蛋白蛋白的表达FigureThebonemorphogeneticproteinproteinexpressionineachgroupbywesternblotanalysis图注:图中ac分别为转染后h、周及周。A组以腺病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞B组以慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞C组为未转染组。A组B组C组A组B组ddd周周平均转染率()图各组转染后不同时间点EGFP基因平均转染效率FigureEnhancedgreenfluorescentproteintransfectionefficienciesineachgroupatdifferenttimeaftertransfection图注:A组以腺病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞B组以慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞。两组不同时间点转染效率比较差异有显著性意义(P<)。h相对表达量周周图各组不同转染时间的骨形态发生蛋白相对表达量FigureThebonemorphogeneticproteinproteinrelativeexpressionineachgroupatdifferenttimeaftertransfection图注:A组以腺病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞B组以慢病毒载体介导EGFP骨形态发生蛋白转染细胞C组为未转染组。相同时间点下组间骨形态发生蛋白蛋白表达两两比较差异均有显著性意义(P<)A、B组内不同时间点间比较差异有显著性意义(P<)C组组内不同时间点间比较差异无显著性意义(P>)。

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