[word格式] 超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的影响

[word格式] 超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的影响 超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子 质量的影响 第15卷第6期 Vo1.15No.6 草地 ACTAAGRESTIASINICA 2007芷 Nov. 11月 2007 文章编号:1007一O435(2OO7)06—0588—05 超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的影响 李荣辉,曹社会 (西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100) 摘要:对多年生黑麦草(Loliumperenne)及红豆草(Onobrychisviciaefoli) 种子超低温保存前后种子发芽率,发芽指 数,电导率,脱氢酶活性,丙二醛含量和可溶性糖含量进行测定分析,探讨超低温保存对种子质量的影响.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:多年生黑麦草与红豆草种子在自然含水量状态即可直接投入液氮中保存,保存时间的长短对种子质量影响不 显着;多年生黑麦草种子超低温保存前后差异不显着,红豆草种子冻 后发生了有益的适应性变化;含水量不是影响 超低温保存效果的重要因素,多年生黑麦草和红豆草种子超低温保 存最适含水量范围分别为9.2,11.8与 5.6%,9.O. 关键词:多年生黑麦草;红豆草;种子质量;超低温保存 中图分类号:S812文献标识码:A EffectofCryOpreserVatiOnonSeedqualityofLoliumperenneand Onobrychisviciaefoli LIRong—hui,CAOShe—hui (CollegeofAnimalSci—Tech,NorthwestA&FUniversity,Yanling,Sh aanxiProvince712100.China) Abstract:Effectofcryopreservationonseedqualityofperennialryegrass(Loliumperenne)andsainfoin (OnobrychisviciifoliaScop.)wasstudiedinthispaperbymeasuringandanalyzingtheseedgermination rates,germinationindex,electroconductibility,dehydrogenaseactivity,MDAcontent,andsolublesugar contentbeforeandaftercryopreservationatdifferentseedmoisturecontents.Theresultsshowthatperen— nialryegrassandsainfoinseedsatnaturalmoisturecontentcouldbecryopreservedinliquidnitrogen. Therewasnosignificanteffectofcryopreservationtimeonthequalitiesoftwokindsofseeds.Therewere adaptivechangesdetectedforsainfoinseedsaftercryopreservationVS.beforecryopreservation,whileno differenceforperennialryegrass.Seedmoisturecontentwasnotacriticalfactordeterminingcryopreserva— tioneffects;theappropriaterangeofmoisturecontentforperennialryegrassandsainfoinseedscryopreser— vationwas9.2,11.8and5.6,9.0,respectively. Keywords.Loliumperenne;Onobrychisviciifolia;Seedquality;Cryopreservation 超低温贮藏指将材料放置在低于,70?的环境 中贮藏,一般存于液氮(,196?)中,利用液氮保存 种子,不需空调设备及其他管理措施,所需费用低于 低温种质库,许多报道认为在一196?温度下,保存 种子时间的长短对种子的活力无显着影响[】],从而 大大地节约了人力和费用[3].因此,许多国家的有关 实验室开展了植物器官,组织和细胞的超低温保存以 及种质库建立的研究,我国在牧草种质超低温保存方 面的研究报道很少,本文以多年生黑麦草(Loliumpe— renne)和红豆草(Onobrychisviciifolia)种子为试验材 料,探讨不同种子含水量对超低温保存效果的影响, 探索其种子超低温保存的处理方法,为牧草种质资源 的超低温保存提供科学依据. 1材料与方法 1.1供试材料 收获一年的多年生黑麦草种子(特拉华Dela— ware)及收获两年的红豆草种子,由杨凌种籽苗木 科技部,博示蔬菜研究所提供. 收稿日期:2007—01—25;修回日期:2007—08—20 作者简介:~(1982一),硕士研究生,研究方向为草业技术,E-mail:lirongl@tom.com;*通讯作者Authorforcorrespondenee 第6期李荣辉等:超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的 影响589 1.2实验处理 测定种子含水量后,将一部分在硅胶干燥器中 干燥,其余装入冷冻管中,并投入液氮保存60d,定 期注入液氮,使种子始终处于液相之中. 置于干燥器中的种子每隔2d取出一部分,一 半用于测定种子含水量,电导率,发芽率,发芽指数, 脱氢酶活性,丙二醛及可溶性糖含量,另一半装入冷 冻管中,直接投入液氮,两天后取出迅速用37?水 浴解冻并测定同样指标.以未干燥,未冻存种子做 对照. 1.3含水量测定 采用高恒温烘箱测定法:烘箱温度为130, 133?,红豆草60min,多年生黑麦草120min,取出 后放置于硅胶干燥器中冷却30~45min后称重,计 算含水量. 1.4发芽率与发芽指数测定 按《中华人民共和国牧草种子检验规程》方法. 在25?光照培养箱中测定,每重复100粒,3次重复. 发芽率()一规定发芽期内正常发芽的种子 数/供试种子总数)×100 发芽指数]:GI一?G/D其中:D:发芽日 数,:在t日内的发芽数 1.5电导率测定 数取黑麦草种子100粒,红豆草种子3O粒,2 次重复.种子放入干净的250mL三角瓶中,加入 去离子水250mL,于2O?浸种24h,测出多年生黑 麦草(us/cm?100粒)与红豆草(us/cm?30 粒)电导率. 1.6脱氢酶活性测定嘲 采用TTC定量法,染色后经丙酮提取,用紫外 分光光度仪测定光密度值,计算脱氢酶活性(/lg TTC?100粒). 1.7丙二醛,可溶性糖含量测定[7 采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛及可溶性糖含量. 取100粒种子,3次重复,加5三氯乙酸8 mL,放人石英砂少量,研磨后所得匀浆在3000r/ min下离心10min,取上清液3mL,加0.5硫代 巴比妥酸溶液3mL,混合后在100?水浴中煮沸1O min,冷却后再3000r/rain下离心10min,分别测定 上清液在450,532和600nm处的吸光值,并按下列 公式计算: MDA(mmol?100粒)一[6.452×(D532一 D6..)一0.559×D]×r/1 可溶性糖含量(mmol/L)一11.71D. (D32,D6..,D45.:分别是652,600及450nm处 的吸光值) 1.8数据处理 用SPSS11.5拟合各指标相对于含水量的曲 线,使拟合度R最大的拟合模型是二次多项式模 型y—b.+b1t+b2t,在Excel2003中用二次多项 式模型作出趋势线图. 2结果与分析 2.1保存时间对自然含水量种子超低温保存的影响 自然含水量的多年生黑麦草种子超低温保存 2d,60d的发芽率,电导率,丙二醛及可溶性糖含量 较冷冻前有所提高,发芽指数及脱氢酶活性有所降 低,方差分析表明,其差异不显着,这说明试验方法及 保存时间对自然含水量种子的活力影响较小(表1). 红豆草种子经冻存后,各指标值的含量均有所 提高,且丙二醛及可溶性糖含量变化显着(P< 0.05),冻存60d可溶性糖变化与冻前差异极显着 (P<O.01),可溶性糖含量变化是对超低温保存适 应性变化的结果,而丙二醛含量的增加,表明种子细 胞膜损伤加重.各指标值有所提高的原因可能与超 低温保存解除了部分红豆草种子的休眠有关.保存 2d与60d差异不显着,表明超低温保存时间对种 子质量影响不大(表1). 2.2种子含水量对超低温保存效果的影响 2.2.1多年生黑麦草种子多年生黑麦草种子含 水量分为5个梯度,分别为11.8(自然含水量), 10.9,8.8,7.9和7.3,随着含水量的降低, 各指标值发生下列变化(表2,图1,3):发芽率先增 大后减小,为91,95%,最大值较最小值高4. 4.由于含水量7.3,11.8发芽率变化不大, 所以此范围内都比较适合.发芽指数先增大后减小, 为24.944~28.675,最大值较最小值高15.0,适合的 含水量范围为9.oH,l1.8.电导率为0.032, 0.058Us/cm?100粒-.,表现为先减小后增大,由 于变化甚小,因此适合的含水量范围为7.3, 11.8.脱氢酶活性(22.139,34.351t~gTTC?100 粒),先增大后减小,最大与最小值对应含水量分 590草地第15卷 别为10.5与7.3,脱氢酶活性的增大可能由于 冻存提高了种子的活力或对种子造成了损伤,因此 仅根据脱氢酶活性的变化不能确定适合冻存的含水 量范围.丙二醛含量(0.568,0.665mmol?100 粒)增加,表示膜的损伤程度逐渐增大,可溶性糖 含量减小(3.41l,3.5O4mmo|?100粒),变化不 大(表2,图1,3). 综合种子质量各方面,含水量在9.2, 11.8时种子发芽率,发芽指数,电导率与脱氢酶活 性在合适的范围之内,较适合种子超低温冻存.多 年生黑麦草种子冻存效果较适合的含水量范围为 9.2,11.8.经常规干燥的种子也可用于冻存. 2.2.2红豆草种子红豆草种子含水量分为五个 梯度,分别为9.0(自然含水量),8.1,6.3, 5.5,4.7,随着含水量的降低,种子各生理指标 发生下列变化(表2,图4,6):发芽率先增大后减小 (13,24),最大值与最小值对应含水量分别为 7.2与4.7,含水量在5.4%以下的种子发芽率 低于含水量9.0时的值,因此,适合的含水量范围 为5.4%,9.0.发芽指数先增大后减小(2.418 2.915),最大值与最小值对应含水量分别为7.1 与4.7%,含水量低于5.2时,发芽指数低于含水 量9.0%的值,适合的含水量范围为5.2,9.0. 电导率先增大后减小(2.258,2.84Ous/cm?3O 粒),最大值与最小值对应含水量分别为7.2与 4.7,由于发芽率变化较大,电导率大小与种子活 力呈负相关],含水量4.7种子的活力最高,因 此,适合的含水量范围为4.7%,9.0.脱氢酶活性 不断减小(303.095,381.928ugTTC?3O粒).丙 二醛含量先减小后增大,最小值与最大值对应含水量 分别为7.3与4.7%,含水量低于5.6后丙二醛含 量高于含水量9.0时的值,因此,适合的含水量范围 为5.6,9.0.可溶性糖含量先减小后增大 (37.610,42.247mmo|?30粒),对应含水量分别 为6.8,9.0(表3,图4,6). 结果表明,适合红豆草种子超低温保存的含水 量范围为5.6%,9.0%,经常规干燥的种子也可用 于冻存. 表I自然含水量种子超低温保存2d,60d前后生理指标变化 Table1Changesofseedphysiologicindexbeforeandafter2-dayand60一 daycryopreserVation Variet 髂 PreservationG 财 erminat … ionGerm 芽 inatious/cm~100~:-1一ugT TTC~100~-1’(m:100.(m翼tmt”d.xE1 ectroconductibilityDehydrogenaseMDASolublesuga 多年生黑麦草0(CK) Perennialryegrass2 60 红豆草0(CK) Sainfoin2 60 0.517 0.558 0.548 1_866 2.526a 2.500a 注:a;5显着水平,A:1显着水平 Note:Smallletter’a’indicatessignificantdifferencesat0,05level;capitallett er’A’indicatessignificantdifferencesat0.O1level 100 95 雹90 S舌85 基藿80鱼70 u65 60 一 超低温保存前发芽率趋势线 Germinationindextrendlinebeforecryopreservation …- 超低温保存后发芽率趋势线 Germinationindextrendlineaftercryopreservation —— 超低温保存前发芽指数趋势线 Germinationtrendlinebeforecryopreservation 超低温保存后发芽指数趋势线 Germinationtrendlineaftercryopreservation 含水量(%) MoistureCOntent 40 萎董32籁 220 20 图1多年生黑麦草种子超低温保存前后发芽率与发芽指数趋势线 Fig.1Germinationrateandgerminationindextrendlineofperennialryegrass seedbeforeandaftercryopreservation 第6期李荣辉等:超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的影响591 黧 0= 2 q 母 一 超低温保存前脱氢酶活性趋势线 Dehydrogenoseactivitytrendlinebeforecryopresevation …- 超低温保存后脱氢酶活性趋势线 Dehydrogenoseactivitytrendlineaftercryopresevation —— 超低温保存前电导率趋势线 Electroconductibilitytrendlinebeforecryopresevation 一……, 超低温保存后电导率趋势线 Electroconductibilitytrendlineaftercryopresevation 0 0u ?蔓 苣夸 避口 蛹 霉 含水量(%) 图2多年生黑麦草种子超低温保存后电导率与脱氢酶活性趋势 Fig.2Electroconduct.bilityanddehydragenaseactivitytrendlineofperennia lryegrassseedbeforeandaftercryopreserVation 黧 趣 —— 超低温保存前可溶性糖含量趋势线 Solublesugarcontenttrendlinebeforecryopreservation 超低温保存后可溶性糖含量趋势线 Solublesugarcontenttrendlineaftercryopreservation …- 超低温保存后丙二醛含量趋势线 MDAcontenttrendlineaftercryopreservation —— 超低温保存前丙二醛含量趋势线 MDAcontenttrendlinebeforecryopreservation 1.O 08 O.6 04 耱 掣 瓣 窟 鳘莹? 一0 0j E E 含水量(%) Moisturecontent 图3多年生黑麦草种子超低温保存后丙二醛与可溶性糖含量趋势 Fig.3MDAandsolublesugarcontenttrendlineofperennialryegrassseedbefo reandaftercryopreserVation 表2多年生黑麦草与红豆草种子超低温保存前后适合的含水量范围 Table2Suitablemoisturecontentofperennialryegrassandsainfoinseedsbef oreandaftercryopreservation 3讨论 3.1多年生黑麦草与红豆草种子超低温保存2d 与60d,种子存活.多年生黑麦草种子超低温保存 2d与60d相比活力基本无变化;较保存2d相比, 红豆草种子保存60d发生了有益的适应性变化. 这与Stanwood(1985)”在液氮保存过程中,在种子 冷却到一196?后再升温的过程中能存活的种子,延 长其在液氮中贮存的时间也不会对种子有害”的结 果一致.因此,本实验在液氮中短期保存的种子,基 本上反映了其在超低温保存的特性. 3.2刘燕等在研究园林花卉种子超低温保存时认为 含水量对于不同种子超低温贮藏效果不同].有报 道指出禾本科在7.2,9.3之间较为适宜_1...本 实验作出多年生黑麦草含水量在9.29,6,11.8时液 氮保存效果较好,而红豆草种子含水量5.6,9.0 592草地第15卷 超低温保存效果较好,这可能与试验种子不同有关. 3.3植物器官在逆境条件或衰老时,往往发生膜脂 过氧化作用,丙二醛是其产物之一,对细胞有毒性, 能够引起细胞膜功能紊乱,且对许多功能分子有破 坏作用,是反映膜损伤程度的重要生化指标之一 口 ,丙二醛含量变化与种子活力成反比,其变化趋 势能很好的表明种子活力的变化趋势. 3.4在试验过程中,可溶性糖含量在反映种子活力 变化水平上稳定性较差,因此单项活力指标不能全 面的反映种子活力,要从多方面,采用多种方法对种 子活力进行综合评定[1引. 3.5根据种子的贮藏特性,分为正常性种子和顽拗 性种子两大类.顽拗性种子在经成熟干燥期以后以 较高含水量从母树上脱落,既不耐干燥又不耐低温, 红豆草种子即属于此种类型,硅胶干燥较缓和,对细 胞伤害小,因此适合红豆草种子等顽拗型种子的干 燥.由于顽拗性种子对脱水低温的敏感性给长期贮 藏带来极大困难,目前认为,其贮藏的最佳手段是进 行超低温保存,因为在超低温状态时,顽拗性种子在 适度的水分状态下,不仅能维持种子活力,而且能保 持组织和细胞形态上和种质遗传的稳定性和完整 性[1,研究以红豆草种子为例研究顽拗型种子的超 低温保存具有重要意义. 4结论 4.1多年生黑麦草与红豆草种子在自然含水量状 态即可直接投入液氮中保存,保存时间的长短对种 子影响不显着;多年生黑麦草种子超低温保存前后 差异不显着,红豆草种子冻后发生了有益的适应性 变化. 4.2含水量水平不是影响超低温保存效果的重要 因素,多年生黑麦草种子和红豆草种子超低温保存 最适含水量范围分别为9.2,11.8%与5.6%, 9.0. 参考文献 [1]吴永杰,赵艳华,周明德.苹果休眠茎尖的超低温保存研究EJ]. 华北农,1999,14(1):129—133 [2]徐刚标,陈良昌.植物种质超低温保存[J].经济林研究,i998, 16(2):5卜53 [3]胡晋,徐谖,陈叶平,等.超低温保存对某些作物种子生活力和 活力的影响[J].浙江农业大学(农业与生命科学版), l994,20(4):4ll一416 E4]韩建国.牧草种子学[M].北京:中国农业大学出版社,2000. 121—123 [5]王广印,韩世栋,魏艳霞,等.化学药剂处理对蕹菜种子发芽的 影响[J].西北农业,2006,15(5):187—190 [6]黄学林,陈润政.种子生理实验手册[M].北京:农业出版社, 1990.90—92 E7]张志良,矍伟菁.植物生理学试验指导(第三版)[M].北京:高 等教育出版社,2003.274—276 [8]李玉荣,韩建国,孙彦,等.新麦草种子劣变过程中生理生化变 化[J].草地,2005,13(3):180—183 E9]刘燕.园林花卉种子超低温保存研究[J].北京林业大学, 2001,23(4):3944 [10]StandwoodPC.cryopreservationofseedgermplasmforge— neticconservationEA].In:KarthaKK.ed.cryopreservation ofplantcellandorgans[C].Florida:CRCPress,1985.i99— 227 [11]翟彩霞,马春红,王立安,等.玉米在诱导抗病过程中丙二醛含 量的变化[J].玉米科学,2005,13(1):77—78,82 [12]张玲,马春晖,段黄金.新疆高羊茅成熟过程中种子活力变化的 研究[J].西北农业,2003,12(2):1-4 [13]陆旺金,付家瑞.顽拗性种子种质保存现状[J].种子,i998, (2):37-40 (责任编辑张蕴薇)