生物防治-02昆虫病原细菌及利用

昆虫病原细菌(苏云金杆菌(Bt))及其应用 Bt杀虫剂是一种非常重要的微生物杀虫剂,是目前唯一能通过工业发酵大规模商品生产的微生物杀虫剂,也是世界产量最大的一种微生物杀虫剂。目前Bt广泛应用于100 多种常发性农业、林业、果树、蔬菜和环境卫生害虫的防治,并有良好效果,在害虫的综合治理中占有及其重要的地位。在传统生物防治中的份额占90%。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种自然界中广泛分布的革兰氏阳性细菌,在世界范围内其菌种和基因资源均十分丰富,从昆虫、土壤、储藏品及其尘埃、污水和植被等来源上均已分离到,据估计全世界已分离保存的Bt菌株有60 000多个。由于它对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等9个目的昆虫和螨类等节肢动物,以及动植物寄生线虫、原生动物、扁形动物等有特异性毒杀作用,具有对人畜安全、害虫不易产生抗性、易于工业化生产等优点。 苏云金杆菌的发现:1901年,日本石度Ishiwata从患病的家蚕幼虫(软腐病)体内分离出一种细菌,被命名为猝倒杆菌Bacillus sotto,但当时没有保存下来。1911年,德国病理学家Berliner从德国苏云金的地中海粉螟中重新分离到一株芽孢杆菌,并于1915年正式定名为苏云金杆菌Bacillus thuringiesis。此后世界各国先后从蜡螟、家蚕、西伯利亚松毛虫、印度谷螟、一点谷螟、红铃虫及其它鳞翅目幼虫中分离出与苏云金杆菌类似的芽孢杆菌,被陆续命名为苏云金杆菌的各个变种。 是芽孢杆菌属。 从20世纪20年代起,Bt开始大规模生产,并被用来防治欧洲玉米螟。直到1950年,人们才了解到Bt的杀虫作用是芽孢形成时产生的晶体蛋白所决定。由于这些蛋白具有杀虫活性,故被称为杀虫晶体蛋白Insecticidal Crystalline Protein ICPs,或δ—内毒素。1981年,Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白的基因,解开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。迄今为止,已先后分离到4万多个Bt菌株,报道了51个血清型,50多个亚种,已克隆出60多个毒素基因。Bt基因已被成功地导入烟草、玉米、棉花等多种植物,获得了一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源,产生了显著的社会效益和经济效益。目前Bt中杀虫晶体蛋白基因成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。 一、苏云金杆菌的形态及分类 1.形态和培养特征 有三个发育阶段示意图 ①营养体呈杆状,两端钝圆,大小为1.2-1.8*3.0-5.0微米,周生鞭毛能移动,或无鞭毛不移动,单个存在或两个以上呈链状(串状)。营养体为繁殖体,横裂生殖。营养体在芽孢出现前停止繁殖,细胞质浓缩,并逐渐形成芽孢和伴孢晶体。 ②芽孢囊当营养菌体老熟时,同时形成芽孢和伴孢晶体。营养体一端斜生一个椭圆形的芽孢,另一端同时出现晶体,即伴孢晶体。芽孢囊呈长卵形,比营养体粗壮。用石炭酸染色后,营养体为红色,晶体深红色,而芽孢不着色,仅见具其轮廓的折光体。 ③芽孢和伴孢晶体芽孢囊到一定时间后破裂,释放出游离的芽孢和伴孢晶体(1—2个或2个以上)。芽孢大小为0.8-0.9*2.0微米,是休眠体,对高温干燥等不良环境条件有较强的抵抗力,商品制剂即以芽孢较长期存放。芽孢在适宜条件下可盟发成新的营养体。伴孢晶体的形状因变种而异:菱形、圆形、方形、长方形、椭圆形或不规则形。伴孢晶体的化学成分是蛋白质,是杀虫的主要有效成分。芽孢和晶体成熟后,母细胞自溶,芽孢和晶体释放到基质中。借助电子显微镜可以观察到芽孢及晶体的形成过程。 苏云金杆菌在牛肉膏、蛋白胨培养基上生长良好,其生长的最适温度为28-32℃。 2.分类 苏云金杆菌是一个种,其下的分类应用的是血清学技术和生化指标。根据营养体的鞭毛抗原(H抗原)的血清学反应及其它特性,苏云金芽孢杆菌可划分为51个血清型和54个血清型亚种。 血清学反应:绝大多数菌株具有鞭毛,鞭毛主要由蛋白质组成,具有抗原的特性,称为H—抗原。制 1 备一个菌株的抗原,注射家兔,制备出含抗体的抗血清。该抗血清与其它菌株的抗原进行交叉凝集试验,确定两者是否是同一血清型。若抗血清与另一菌株的抗原发生凝集,则为同一血清型,否则为不同血清型。 生化指标有:卵磷脂酶、尿酶、几丁质、淀粉水解、纤维二糖、甘露糖、蔗糖、七叶灵、水杨苜、蛋白质水解等。 我国用于生产杀虫剂的主要有:①血清型H1的苏云金亚种、②血清型H3库斯塔克亚种的HD-1菌株及7216菌株、③血清型H5ab蜡螟亚种、④血清型H4ab武汉亚种、⑤松蛛亚种、⑥血清型H14以色列亚种、⑦H8ab莫里逊亚种、⑧拟步甲亚种等菌株。其中1-5亚种对鳞翅目效果好,6-7亚种对双翅目,8亚种对鞘翅目效果好。 3.寄主 据国内外资料,苏云金杆菌各亚种菌株对鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、食毛目、直翅目、等翅目、蚤目600余种害虫有不同程度的致病性。其中鳞翅目和双翅目昆虫占绝大多数:粉蝶科、菜蛾科、尺蛾科、巢蛾科、天蛾科、卷叶蛾科、小卷叶蛾科、舟蛾科、灯蛾科、天蚕蛾科、弄蝶科、凤蝶科、蛱蝶科、刺蛾科、麦蛾科、枯叶蛾科、螟蛾科等的多数害虫对其较敏感。某些菌株对毒蛾科和夜蛾科也有一定毒效。以色列亚种和某些亚种菌株对双翅目的150种纳、蚊有毒效,而对其它昆虫无效。该类细菌的杀虫作用及其有效范围是与致病机制和昆虫寄主密切有关的。 苏云金杆菌不同亚种菌株对同一寄主的毒性是不同的,表现出不同的杀虫活性;而同一菌株对不同昆虫毒力也不同,表现出不同的杀虫谱活性。因此Bt的杀虫范围、毒力大小,不仅与菌种产生的毒素有关,也与昆虫种的特异性有关。 到目前为止,已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋白至少对脊椎动物中4个门和节肢动物门中9个目的有害生物有活性。1977年从以色列分离到血清型H-14,对蚊、蚋、白蛉幼虫有速效,Bt H-14广泛用于防制各种水体中滋生的伊蚊、库蚊,骚蚊等幼虫,无残效,但对蠓类和家蝇幼虫无作用;少数苏云金杆菌产生外毒素(exotoxin)血清,对家蝇亦有毒性。 二、苏云金杆菌的致病机理及其分子生物学 1.苏云金杆菌的毒素 苏云金杆菌对昆虫的致病力,主要是其产生的毒素。苏云金杆菌产生的杀虫毒素有多种,但可分为两大类,一类是内毒素:δ-内毒素(δ-endotoxin),即伴孢晶体,杀虫晶体蛋白;另一类是外毒素,是细菌在生命活动过程中排出体外的代谢物:α-外毒素(α-exotoxin)、β-外毒素(β-exotoxin)、γ-外毒素、不稳定外毒素(labile exotoxin)、水溶性外毒素(water_soluble toxin)和鼠因子毒素。Bt不同亚种菌株产生的毒素种类和性质也不同,表现出不同的杀虫谱活性。Bt是通过口腔感染昆虫的。它杀死昆虫可以由细菌本身的活动引起,更重要的是菌体产生的毒素的作用。毒素不仅能帮助细菌入侵,而且可使害虫在短时间内中毒死亡。 ①α-外毒素 是一种可溶性酶类,即卵磷脂酶,具水溶性、热敏感,对昆虫具毒性。不是苏云金杆菌所特有的,蜡状芽孢杆菌和其它一些无芽孢杆菌也可产生。作用:影响许多细胞的磷脂膜,造成细胞破裂或坏死,破坏肠壁细胞,有助于肠道中的细菌侵入血腔,从而破坏了寄主正常的防御机制,引起败血症。 ②β-外毒素 又叫热稳定外毒素或苏云金素。这种毒素在营养细胞生长阶段产生,在培养的24小时内达到高峰。特点:热稳定性、水溶性和可透析性。在结构上是一种ATP类物质,对鳞翅目、双翅目、膜翅目、半翅目、直翅目和等翅目的69种昆虫及数种螨类、线虫有致病性。家蝇的幼虫对该毒素非常敏感,感染3天引起死亡或畸形,幼虫发育受明显影响,如出现半化蛹,不羽化或畸形成虫,故也称蝇毒素。 ③γ-外毒素:是一种或几种未被鉴定的酶,能使卵黄琼脂澄清。 ④水溶性外毒素 感染家蚕3小时内就引起类似于伴孢晶体毒素作用的症状:停止取食,对外部刺激反应消失及出现麻 痹症状。 ⑤鼠因子毒素和虱因子毒素 ⑥δ-内毒素重点 又称伴孢晶体、晶体毒素、杀虫晶体蛋白Insecticidal Crystalline Proteins,简称ICPs等,是伴孢晶体的主要组成成份,是苏云金杆菌对昆虫的致死中起主要作用。杀虫晶体蛋白是菌体在形成芽孢的同时所产生的一种蛋白质晶体。 杀虫晶体蛋白:伴孢晶体主要由蛋白质组成,由一到多种蛋白质组成,经分析含有18种氨基酸,各种氨基酸含量在不同亚种菌株晶体之间有所差别,伴孢晶体还含有相当数量的钙、铁、镁和硅。晶体不溶于水和一般有机溶剂。通常采用高PH和还原剂、蛋白酶或昆虫肠乳酶水解 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 研究其蛋白质多肽组成。 伴孢晶体蛋白本身无活性。杀虫晶体蛋白—原毒素—毒性多肽:当敏感昆虫摄食苏云金杆菌的伴孢晶体后,在中肠肠液碱性条件下打开二硫键溶解成原毒素(通过SDS-PAGE测定在130-160KDa之间的多肽)而原毒素在蛋白酶的作用下可水解成具有杀虫活性的小分子多肽(55-70KDa或更小的多肽),是苏云金杆菌杀虫的主要活性成分。 2.苏云金杆菌的致病机理 苏云金杆菌对昆虫的致病作用主要是胃毒作用,通过昆虫食入菌剂而引起的。菌剂包括芽孢和细菌所产生的毒素。害虫的死亡有两方面的原因:1.菌体本身的繁殖可导致昆虫的死亡。2.而昆虫能在短时间内死亡往往是苏云金杆菌产生的毒素所致,作为杀虫剂施用的制剂的主要作用应该是杀虫晶体蛋白所起的作用。 ①昆虫消化道的构造及机能 消化道是一根不对称的管道,前端的口位于口前腔的基部,后端的肛门位于体躯的末节。 构成:消化道由来源和机能不同的三部分组成:前肠、中肠和后肠。功能:前肠摄食、磨碎食物、暂时贮存食物。后肠排除食物残渣和代谢废物,同时吸回水份和无机盐类。中肠是分泌酶类、消化和吸收物质的主要部位。 中肠是消化和吸收养分的主要部位,起胃的作用,来源于内胚层。多数中肠是前后粗细近似的管道,中肠从组织分六层;围食膜、肠壁细胞层、底膜、环肌、纵肌、围膜。图: 肠壁细胞:只有一层细胞组成,有消化细胞和再生细胞组成。消化细胞是肠壁细胞层的功能细胞,具有活泼的分泌和吸收功能。顶端边缘分化成很多垂直的条纹,称条纹边,在光镜下明显,微细的消化液由此条纹边分泌入肠腔。条纹边在电镜下呈微杆。再生细胞:在消化细胞的基部,成群或单独存在的小型细胞。分裂补充消化细胞。 中肠消化液的酸碱度:一种昆虫中肠的PH是特定的,中肠肠液具有很强的缓冲能力,PH维持在比较恒定的水平。多数昆虫中肠的PH:6-8。但种间的差异大,一般植食性比肉食性偏碱,鞘翅目、直翅目近中性。鳞翅目幼虫中肠PH碱性至强碱性,棉铃虫8.0,菜青虫9.7,家蚕9.4-10.3,正因为此,Bt杀虫剂对鳞翅目幼虫效果好。 前肠的PH受食物影响较大,波动较大;后肠的PH多偏酸性,这与尿酸的沉积有关。 ②杀虫晶体蛋白(δ-内毒素)的致病机理:内毒素对昆虫的毒害作用主要是胃毒作用,因此,必须由敏感昆虫食入苏云金杆菌的杀虫晶体蛋白和芽孢后才能有效。 杀虫晶体蛋白—原毒素—毒性多肽:当敏感昆虫摄食苏云金杆菌的伴孢晶体后,在中肠肠液碱性条件下打开二硫键溶解成原毒素(通过SDS-PAGE测定在130-160KDa之间的多肽),进而在肠道胰蛋白酶的作用下激活成抗原蛋白酶的毒素核心片断(toxic core fragment),(55-70KDa或更小的多肽),才能与刷状缘(brush border)上特异性受体高亲和性地结合,快速而不可逆地插入细胞质膜,形成孔或病灶(lesion),并破坏钾、钠离子梯度,引起膜的非极性化,最后通过胶体渗透裂解(Colloid-osmotic lysis),将细胞膨胀并裂解。中肠的碱性高渗内容物进入血腔,血淋巴PH值升高从而导致感病昆虫麻痹死亡。δ-内毒素对虫体的作用的第一个部位是中肠。毒素对中肠的作用是高度特异性的。(Bt所产生的杀虫晶体蛋白在昆虫的中肠或碱性条件下分解成原毒素,原毒素也无毒性。原毒素被肠道酶消化后才释放出有毒的成分。) 鳞翅目幼虫消化道内的PH值一般为9-10.5,属碱性,晶体蛋白易形成原毒素,因此B.t对鳞翅目幼虫 防治效果好。 杀虫晶体蛋白的作用部位是中肠,菜青虫取食后2小时,肠壁细胞内出现很大的空泡,随后空泡进一步扩大,4小时后,中肠肠壁细胞全面解体。 影响δ-内毒素毒力的因素: 研究最多的是紫外线、添加剂和保护剂对δ-内毒素的毒力影响。紫外线照射可使δ-内毒素失去活性。用电镜、电泳及生物测定等方法研究紫外线对库斯塔克亚种伴孢晶体的影响结果表明,紫外线可破坏晶体的表面结构和形态,降低晶体的溶解度。用紫外线照射1小时,其杀虫活性下降一半;照射2小时,活性下降78%;照射74小时后基本丧失活性。活性丧失的主要原因主要是长时间的紫外线照射,破坏了晶体表面的结构和形态,破坏了晶体蛋白的一级结构和主体结构,使之变性,难溶于中肠消化液,不能降解为有杀虫活性的小分子肽。 化学物质及保存温度与时间对δ-内毒素也有影响。在Bt杀虫剂的调配时应注意。 ③细菌的增殖:芽孢经口进入消化道,外毒素破坏中肠,菌体进入体腔,菌体繁殖,同时产生有毒代谢物,引起幼虫败血症,使害虫瘫痪而死亡。通常经2-4天死亡,防治上见效慢。 苏云金素(β-外毒素)作用效果比较慢,而持效期则较长,在应用上可以弥补芽孢晶体的不足。苏云金杆菌感染寄主后,在芽孢形成之前寄主死亡,所以苏云金杆菌很少自然地引起流行病。 ④中毒症状:鳞翅目幼虫摄入芽孢、晶体后,在数分钟内停止取食。出现的一般症状是:开始无显著的变化,以后食欲减退,行动迟缓,反应失灵,常伴有呕吐和下痢。偶尔可见黑斑出现于体背面和体侧。虫体死亡前体伸展,死后逐渐变黑发生腐烂。所以田间药效需天见效。 三、杀虫工程菌(转Bt杀虫生物) Bt的缺点:苏云金杆菌仍存在杀虫范围窄、有效成分易降解(残效期短)等缺点。 为此,除了选择菌株和改进剂型外,许多科学家正在采取生物工程手段加以改造,对原来的毒素蛋白基因重组,使之发挥更大的效力,以提高毒素的产量和增加持效。生物技术的成就为Bt杀虫剂的发展增添了活力。 80年代后,随着遗传学和分子生物学领域取得了重大进展,苏云金杆菌的研究也有很大进展。苏云金杆菌不同病原型菌株的被发现和筛选出来,现已得到的菌种有杀鳞翅目幼虫的、杀双翅目蚊类的,杀鞘翅目叶甲类害虫的以及对某些植物寄生线虫有活性的各种类型菌株。其中许多系列菌种已进入市场。Bt新菌株的发现和商品杀虫剂的发展,对化学抗性的控制起到重要作用,对无公害农产品的生产发挥作用。同时也促进了Bt遗传学和分子生物学的发展。 1.δ-内毒素基因及其编码的蛋白质 近年来,苏云金杆菌遗传学研究取得重要进展。研究表明,Bt晶体蛋白是由基因控制的。 大多数菌株晶体蛋白基因位于质粒(30-150MD)上,质粒:细菌中独立于染色体之外能进行自我复制并包含各种功能的基因的小的双链环状DNA分子。 少数亚种菌株定位于染色体上,如松躅亚种、武汉亚种。 还有少数有两个拷贝,如苏云金亚种1715菌株和亚毒亚种,编码δ-内毒素的基因一个在染色体上,一个在质粒上。 晶体蛋白既然是由一种至多种多肽组成,这就提出一个关于Bt质粒中编码杀虫晶体蛋白基因的数目问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。现已证明许多菌株含有一个以上的杀虫毒素蛋白基因。 根据杀虫谱的不同,将杀虫基因分成六大类,统称为cry基因,用罗马数字I、II、III、IV等来命名,分别代表几种杀虫范围。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性,又分为A,B,C等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小,又分为a,b,c等不同的基因亚型。其分类如下: Cry I基因型编码对鳞翅目昆虫有毒杀作用的菱形伴孢晶体蛋白,约30~140KD,在昆虫中肠内降解为60~70KD的多肽,在cry I基因间,氨基酸同源性为82%~90%的归为cry I A;55%~71%的归为。cry I A 基因中,根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小,又分为:cry I A (a),4.50kb;cry I A (b),5.30kb; cry I A (c),6.60kb亚类基因。 Cry II基因通常编码对鳞翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的立方体伴孢晶体蛋白,约65KD。而cry II B 只对鳞翅目昆虫有毒性,它们之间的同源性达80%左右。 cry III基因编码对鞘翅目昆虫有特异毒杀作用的长方形伴孢晶体,约72KD。Cry III A基因与cry I 和cryIV基因的毒性核心5' 端编码区有同源性,与3'端编码区有所不同,如果将3'端去掉,将失去杀虫活性。 Cry IV基因编码对双翅目昆虫有特异毒性的椭园形伴孢晶体。cry IV A,135KD;cry IV B,128KD;cry IV C,78KD;cry IV D,72KD,cry IV A和cry IV B基因在结构上与cry I相似,毒性核心区段为53~78KD,位于原毒素蛋白的N端。 有人根据前人的研究,应用计算机数据库,对已报道的100个苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因进行了同源性比较,并进一步对该基因进行了归类,将之分为CryⅠ—CryⅧ、CryA及CryB等10个大类共36个亚类,为有目的地分离筛选、鉴定苏云金杆菌的新菌株及杀虫晶体蛋白的分子遗传学研究提供了有效的参考资料。 近年来毒素基因的遗传操作在生物技术中是一个非常活跃的组成部分。目前它已由细菌杀虫剂的范畴跨进植物基因工程领域,转Bt作物已大面积栽培。 2.Bt新生物杀虫剂的开发 转Bt杀虫生物的开发基于DNA重组技术。 方法:获得Cry基因:提取Bt质粒及染色体DNA,限制性内切酶,电泳分离获得Cry基因;克隆Cry 基因:适宜载体(质粒),酶切,连接酶连接载体及Cry基因,将重组体导入其它生物中,培养,检查Cry 是否表达,即是否有毒素产生。 例子:1981年,用pBR322为载体,E.coli为受体,克隆了库斯塔克亚种kurstakiHD-1中质粒上编码δ—内毒素基因片断。重组子具有低水平表达。生物测定表明含Bt基因的大肠杆菌对烟草天蛾有毒性。 美国Mycogen公司用Bt毒素基因重组技术,将Bt杀虫基因导入了荧光假单胞菌(pf)生产杀虫活性高、以pf菌体为包膜的新制剂,其抗紫外线强,田间杀虫有效期延长了一倍。Ecogen公司构建的工程菌可防治鞘翅目和鳞翅目害虫。 1986年农科院生物技术中心将两亚种的原生质融合,得到了既杀鳞翅目又杀双翅目幼虫的稳定融合子,融合子产生双亲所特有的晶体蛋白。杀虫试验表明,融合体对一些蚊幼虫、松毛虫都有杀虫活性。 自1981年分离到第一个晶体蛋白编码基因到现在已发现有几十个特定的基因。Bt杀虫的病原型从开始时的杀鳞翅目类到双翅目类和鞘翅目类群。杀虫谱活性的扩大足以说明杀虫活性物质在自然界的多样性比预料的更大。人们利用杀虫特异性菌株及其毒素基因,通过原生质体融合或应用遗传技术,对以Bt为基础的生物杀虫剂进行改造,取得了重要进展。 方法之一就是将不同亚种的毒蛋白基因构建成为杂种基因。例如,美国的Sandoz公司通过略加改进B.t. wuhanensis 基因毒蛋白的氨基酸组成,使之杀虫毒性提高2~3倍,然后又将基因克隆并经穿梭质粒导入B.t. kurstaki基因。这种具有杂合Bt毒素基因的工程菌已于1990年进入放大试验,具优异效果。利用抗生性标记法检测证实,该工程菌除毒力增强和杀虫谱扩大外,其它特性与原Bt菌无差异,未发现该工程菌对环境产生不良影响。不少国家在进行类似的研究,以期获得对多种害虫高效的新型Bt工程菌。 3.转基因抗虫植物 将Bt杀虫晶体蛋白的基因转入植物中,培育成具抗虫性的植物。 较早的所有实验使用一种基于土壤脓杆菌的转化系统,分别将Bt杀虫基因转入到烟草及番茄中,得到了转基因的烟草和番茄植株。杀虫基因在其内得到了表达。 抗虫的烟草:比利时的植物遗传系统NV公司的科学家,通过Ti质粒转移苏云金杆菌的δ—内毒素基因到烟草中,使烟草植株产生了对鳞翅目害虫的抗性,毒素基因在烟草内得到了表达,产生了毒素。在温室试验中,所有与改良植株接触的幼虫在一周内全部死亡,而在对照株上,死亡幼虫只占5%,在另一组试 验中,与改良株接触的幼虫在5天内死亡,它们对植株叶片的危害很小;未改良的植株与幼虫接触后的4-7天受到严重危害,在10-15天后被完全吃光。毒素是很有效的。研究表明,在植株内产生的毒素量与在苏云金杆菌中产生的量近乎相等。此外,美国农业遗传学公司也使δ—内毒速度基因在植物中得到表达。 目前,转杀虫晶体蛋白基因棉花、玉米及马铃薯大面积栽培。 四、制剂的生产 苏云金杆菌制剂生产,是在人工条件下大量培养、获得杀虫有效成分—芽孢、伴孢晶体,或苏云金素。然后调制成不同的剂型品种。 苏云金杆菌尽管能产生多种杀虫毒素,但通过发酵生产回收技术能够有效回收的杀虫物质,主要是芽孢、晶体毒素和对热稳定的苏云金素。这3种有效成分在现工艺条件下可调制成如下几种类型产品:1含芽孢和晶体的复合物制剂。2仅含晶体毒素的产品。3含芽孢、晶体和苏云金素的复合制剂。4苏云金素制剂。 目前国内外市场上销售的商品所含的有效成分主要是由芽孢和伴孢晶体,加上填充料和添加剂组成,少数商品是上述3和4类型。(因此,要了解和认识Bt系列杀虫剂的作用和特点,首先要了解上述3种有效成分的作用机理。)主要杀虫物质是伴孢晶体。害虫死亡一般因伴孢晶体毒素引起的中毒症和因细菌侵入增殖引起的败血症,而导致幼虫的发病和死亡。 1991年报导,生物杀虫剂市场约一亿美元,其中苏云金杆菌占90%,苏云金杆菌之所以迅速发展,一是由于它防治害虫的有效性,二是采用了高毒效的菌株和不断完善的工艺技术。 苏云金杆菌的生产目前有两种方法。液体深层通气发酵法和固体发酵法。液体发酵法是主要的生产方法,其优点是生产量大,产品质量较稳定,生产率高,产品有悬浮剂、粉剂和颗粒剂等。固体发酵法,适宜于中小规模的生产,其产品是粉剂。此法的优点是设备简单,不要求绝对无菌,而且技术传媒易掌握,可因地制宜生产使用,缺点是发酵过程的各个阶段不易控制,产品质量不很稳定,产量有一定限制。 介绍液体深层发酵 1.生产工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 : 砂土管菌种—斜面接种—发酵—过筛除渣—离心浓缩 1.喷雾干燥—加助剂—质量、安全检查—产品分装制成可湿性粉剂 2.加助剂—质量、安全检查—产品分装制成悬浮剂 (生产菌种—扁瓶培养种子—种子罐扩大培养—生产罐发酵—贮罐—浓缩—调制—悬乳剂成品。或直接浓缩成悬乳剂成品。如果成品是粉剂,则在浓缩后经板框压滤或喷雾干燥—粉碎—调制—成品。)整个过程可分为菌种制备、生产发酵、浓缩烦躁和剂型调制,以及发酵过程的监测和半成品、成品的检测等。 2.设备条件 菌种和监测实验室及相应设备;生产发酵设备:种子罐、生产罐、贮罐等;浓缩、干燥、调制设备,如离心机或板框过滤器、粉碎机等;昆虫饲养及毒力测定实验室和设备;动力部分:锅炉、电力设备等;发酵过程的自动控制和监测系统等。 3.工艺条件 菌种:苏云金杆菌不同亚种菌株的毒力和杀虫范围不同。生产菌种应选择对目标害虫毒效高、发酵性能优良的菌种。目前商品生产制剂用于鳞翅目害虫的,多采用苏云金亚种菌株(H1型)、库斯塔克亚种(H3ab 型)、松蛀亚种(H4ab)型和蜡螟亚种(H5ab型)及武汉亚种等;用于防治鞘翅目的叶甲类害虫采用拟步甲亚种(此对鳞翅目和双翅目害虫完全无效)。用于防治双翅目蚊、纳幼虫的菌株有以色列亚种。 菌种菌龄:用芽孢或营养体接种对种子发酵菌数无明显影响。但芽孢接种时有一个4-5小时的芽孢萌发、生长的延缓期,使发酵周期相应延长。而用营养体接种则仅有极短的调整期,发酵周期较短。接种菌龄一般是7-9小时。 发酵培养基:苏云金杆菌对营养基质无特别苛求。许多农副产品均可作为培养基质。如动物、植物性蛋白质及其衍生物可作为合适的氮源;一些糖类、淀粉、湖精可作碳源。此外还需适当添加钙、镁、磷、锌、 锰、铁等无机盐类,或某些维生素等物质。在Bt发酵生产中国外常用作氮源的有棉籽粉、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏和酵母自溶物等。国内常用的有豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、蚕蛹粉和酵母粉等。用作碳源的有玉米粉、淀粉、糊精、甜菜糖蜜、饴糖、麦芽糖和葡萄糖等。 生产培养基组成对Bt生长发育和毒素产量有很大影响。培养基的营养水平和适当的碳氮比是保证菌体正常生长发育,提高芽孢、晶体和其它杀虫物质产量的重要问题。 应注意的是苏云金杆菌不同亚种菌株的营养要求是有差异的,不同亚种或菌株在不同培养条件下其生物量与杀虫活性也会有明显差别。 六、苏云金杆菌的安全性试验 1.对动物的安全性试验 2.施用苏云金杆菌对生态系统的影响 七、苏云金杆菌在害虫防治中的应用 据报到1990年全国防治面积达870 000ha,收到了显著的经济、社会和生态效益。 农业害虫:蔬菜(烟青虫、菜青虫)、果树、小麦、玉米(玉米螟)、棉花(棉铃虫)、水稻(稻纵卷叶螟)、茶树(茶松毛虫)等作用。 森林害虫:松毛虫等。 卫生害虫:蚊幼虫,以色列亚种。 影响防治效果的环境因素: 菌种对害虫的毒力有差异 目标害虫:虫龄、虫口密度、生态习性等 剂型和施用技术方法 环境因子如温度、紫外线 在国内蔬菜上应用较多的是: 7216杀虫菌,是我国湖北省天门市微生物研究所于1972年从越冬的红铃虫分离出来的,是变种,称为天门杆菌。天门变种常称为7216; 140杀虫菌:武汉变种常称为140杀虫剂; 库斯坦克变种常称为HD-1. 我国将B.t杀虫剂用于防治农作物害虫,已由20世纪80年代的几十吨,发展到1994年的1万多吨。近年来在菌种选育、发酵工艺、增效剂(EGS)和光保护剂(P81)等方面均取得重大进展。应用范围由1962年前的4个目32属121种昆虫发展到10个目的522种,其中鳞翅目372种 苏云金杆菌的不同亚种或菌株的毒力活性和杀虫范围是有区别的。生产和应用应根据防治对象害虫选择毒效高的相应亚种菌株。概括起来可分以下类型:1 防治对象是鳞翅目害虫。多采用血清型H1、H3a3b、H5a5b亚种菌株。它们共同特点是都有较宽的寄主范围。是目前国内外市场的主导产品。2 杀某些鞘翅目害虫的。有 H8a8b的拟步甲亚种和圣地亚哥亚种菌株。3 专杀双翅目蚊的。有H14和H8a8b中某些菌株,这一类菌株对鳞翅目或鞘翅目害虫无毒性。 在实验室条件下Bt能毒杀568种鳞翅目昆虫,加上其它目的昆虫共有约700种。但我国用Bt防治的农、林、卫生害虫约1100种,常发性农林害虫有40种:菜青虫、小菜蛾、银纹夜蛾、韭菜蛆、稻苞虫、稻纵卷叶虫、稻二化螟、稻三化螟、玉米螟、粘虫、棉铃虫、棉红铃虫、小造桥虫、棉大卷叶虫、大豆天蛾、烟青虫、桃小食心虫、枣尺蠖、舟形毛虫、蛴螬、松毛虫、天幕毛虫、枯叶蛾等。特别是在无公害蔬菜的生产中具有重要地位。 天霸可湿性粉剂