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人参多糖含量测定方法研究 前沿论文.doc

人参多糖含量测定方法研究 前沿论文

毒手神枭4
2017-09-28 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《人参多糖含量测定方法研究 前沿论文doc》,可适用于综合领域

人参多糖含量测定方法研究前沿论文人参多糖含量测定方法研究王丹吕永磊卜海博徐丽媛李向日(北京中医药大学中药学院北京)摘要:目的:建立人参多糖含量测定方法。方法以人参精制多糖测得人参多糖对葡萄糖的换算因子以苯酚硫酸分光光度法测定人参多糖的含量。结果:供试液在h内显色稳定重现性好平均回收率为RSD=。人参多糖含量为RSD为。结论:该方法简便快速测定结果客观准确。关键词:中医学人参多糖含量测定精制中图分类号:RContentDeterminationofPolysaccharideintherootofPanaxginsengWANGDan,LVYonglei,BUHaibo,XULiyuan,LIXiangri(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing)Abstract:Objective:ToestablishamethodforcontentdeterminationofpolysaccharidesintherootofPanaxginsengMethod:Theconversioncoefficientofginsengpolysaccharidetoglucosewasobtainedbyrefinedpolysaccharides,andthenthecontentofcrudepolysaccharidesintherootofPanaxginsengwasdeterminedbythemethodofphenolsulfericacidResult:thecolorofthetreatedsolutionshowedgoodstabilizationwithinhandtheaveragevalueoftherecoveryforpolysaccharidemeasurementwaswithofRSDThecontentsofpolysaccharideintherootofPanaxginsengwaswithofRSDConclusion:Themethodwassimple,rapidandaccurateKeywords:traditionalChinesemedicinePanaxginsengpolysaccharideContentdeterminationRefining引言人参为五加科植物人参(PanaxginsengCAMey)的干燥根在我国有悠久的药用历史人参中主要含有人参皂苷、人参多糖、挥发油、氨基酸及微量元素等有效成分。据研究报道,人参多糖对机体的免疫功能、造血功能以及在抗肿瘤和降血糖等方面均有作用。本文采用苯酚硫酸法来测定人参多糖的含量以葡萄糖为对照品绘制标准曲线并采用换算因子来提高方法的准确度。为了保证测定换算因子方法的准确性本文测定了人参精制多糖的CNMR谱以及反映人参多糖精制前后单糖组成的HPLC在验证人参精制多糖中基本不含其他杂质且单糖组成与粗多糖基本相同的基础上以人参精制多糖测得人参多糖对葡萄糖的换算因子再以此校正采用苯酚硫酸法测定的人参中多糖的含量。仪器与试药仪器TMWatersHPLC色谱仪:Waters紫外双波长检测器,breeze色谱工作站(美国Waters公司)AV型超导屏蔽核磁共振仪(德国Bruker公司)紫外可见分光光基金项目:国家自然基金面上项目()高等学校博士学科点专项科研基金()作者简介:王丹()女硕士研究生主要研究方向:中药炮制与质量控制的研究通信联系人:李向日()女副教授主要研究方向:中药炮制、活性成分及质量控制的研究Email:lixiangrisinacom度仪(北京普析通用仪器有限公司)TDLA低速台式大容量离心机(杭州汇尔仪器设备有限公司)。试剂与试药人参(生晒参)产地宽甸太平哨镇经北京中医药大学李向日老师鉴定为五加科植物人参。D葡萄糖(Glc))半乳糖(Gal))D半乳糖醛酸(GalA)、D木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)均购自中国药品生物制品鉴定所重蒸酚)双氧水)乙醇)苯基甲基吡唑啉酮(PMP))三氟乙酸(TFA)均为分析纯乙腈为色谱纯水为娃哈哈纯净水。方法与结果人参精制多糖的制备称取人参粉末(过四号筛)g加入乙醇mL回流提取次每次h脱脂过滤药渣挥尽乙醇后沸水提取两次每次提取h离心(rmin,min)合并上清液浓缩至mL加乙醇使醇含量达到于冰箱中过夜过滤干燥即得到人参粗多糖。将粗多糖以水复溶与等体积Sevage试剂(氯仿:正丁醇=:)混合振摇)离心除去蛋白先在,nm紫外光谱段进行扫描,nm处无吸收峰再用考马斯亮蓝法测蛋白反复进行次至无蛋白。浓缩溶液至mL加入体积分数的过氧化氢原液用molL的氢氧化钠调节其pH至,水浴h将多糖脱色液置于透析袋中先流水透析d再蒸馏水透析d。流水透析后过滤浓缩加乙醇使醇含量至于冰箱中过夜过滤滤渣依次用无水乙醇)丙酮)乙醚洗涤次真空干燥即得精制多糖。人参精制多糖的CNMR图谱(溶剂为DO)见图化学位移的信号为糖的端基碳信号的为糖的甲基碳信号,的为除上述碳信号外糖上其他的碳信号除上述糖信号外未见其他信号由此可判断精制的人参多糖中基本不含蛋白质等其他杂质。图人参精制多糖CNMR图FigCNMRSpectrumofrefinedpolysaccharideInPanaxginsengPMP衍生化法测定粗多糖和精制多糖的单糖组成衍生化供试品的制备精密称取人参粗多糖mg和精制多糖mg加入molL三氟乙酸mL氮气封管于水浴h从中取出μL置具塞试管中氮气吹干吹的同时反复加入甲醇以除净三氟乙酸。在水解供试品中加molL氢氧化钠溶液和molL的PMP甲醇溶液各μL混匀后于水浴min冷却至室温后加molL盐酸μL中和加水至mL最后加入等体积三氯甲烷除去未反应的PMP重复次。水相分别以μm滤膜过滤后备用。HPLC条件AgilentC色谱柱(mm×mmμm)流动相乙腈molL磷酸盐缓冲液(pH)紫外检测器检测波长nm流速mLmin进样量μL。人参粗多糖和精制多糖的PMP衍生物HPLC图分别见图。由图可知人参多糖精制前后多糖组成没有明显变化。AB图人参粗多糖和精制多糖PMP衍生物HPLC图FigChromatogramsofPMPderivativesofhydrolyzatesofPolysaccharideandrefinedpolysaccharideinPanaxinsenggA人参粗多糖(crudepolysaccharideinPanaxginseng)B人参精制多糖(refinedpolysaccharideinPanaxginseng)PMP半乳糖醛酸(GalA)葡萄糖(Glc)半乳糖(Gal)木糖(Xyl)阿拉伯糖(Ara)供试品溶液的制备精密称取人参粉末(过四号筛)g加入乙醇mL回流提取二次每次h滤渣挥尽乙醇后用mL热水回流提取次每次h过滤合并水提液加乙醇使醇含量至于冰箱中过夜。过滤得到粗多糖将粗多糖溶于水定容至mL容量瓶中精密移取ml至ml容量瓶中蒸馏水定容至刻度摇匀为供试品溶液。最大吸收波长的选择精密量取供试品和葡萄糖对照品溶液(gL的葡萄糖溶液)各mL置mL试管中加入苯酚溶液mL浓硫酸mL混匀后室温下放置min沸水加热min冷至室温以蒸馏水替代多糖溶液如上法配制空白在,nm范围内扫描确定最大吸收波长。对照品最大吸收波长在nm供试品最大吸收波长都在nm综合考虑选择测定波长为nm。,nm全波长扫描图见图。葡萄糖(glucose)人参多糖(polysaccharide)图葡萄糖对照品和人参多糖供试品全波长扫描图Fig,,spectrumofglucoseandPolysaccharideinPanaxginseng标准曲线的绘制精密称取葡萄糖对照品mg定容至mL容量瓶中精密量取此溶液ml于ml容量瓶中蒸馏水定容至刻度分别精密量取、、、、、、、ml于ml容量瓶中稀释至刻度摇匀配成系列标准溶液。精密量取mL系列标准溶液于具塞试管中以蒸馏水作空白分别加入苯酚溶液mL浓硫酸mL摇匀放置min沸水加热min冷至室温于nm处测定吸光度。经计算得回归方程:Y=Xr=葡萄糖在μg到μg之间呈良好的线性关系。换算因子的测定精密称取人参精制多糖mgmL容量瓶定容摇匀。精密量取mL于具塞试管中按照“”项下显色方法显色并测定吸光度根据回归方程计算多糖溶液中葡萄糖的浓度按f=WCD计算换算因子其中W多糖质量(mg)C为多糖中葡萄糖浓度(mgmL)D为稀释倍数。测得换算因子f=(n=)。精密度试验精密量取葡萄糖标准溶液mL按“”项下方法显色并测定其吸光度平行测定份结果RSD=表明精密度良好。稳定性试验按照“”项下提取方法制备份供试品溶液。精密量取供试品溶液mL置具塞试管中按照“”项下方法显色并测定吸光度每隔h测定次连续h测得吸光度的为表明供试品溶液在h内显色稳定。RSD重复性试验按照“”项下提取方法同时制备份供试品溶液。精密量取各供试品溶液mL,分别置于具塞试管中按照“”项下方法显色并测定吸光度结果RSD为表明该方法重复性良好。加样回收率试验精密称取份人参粉末(过四号筛)各g分别加入精制多糖约mg按照“”项下制备供试品溶液和“”项下方法显色并测定吸光度计算回收率结果平均加样回收率为RSD为。人参多糖含量的测定精密称取人参粉末g按照“”项下提取条件提取和“”项下显色条件显色测定吸光度由回归方程计算供试品溶液中葡萄糖浓度按含量()=(C*D*fW)×计算供试品中多糖的含量。式中:C为供试品溶液中葡萄糖的浓度D为稀释倍数f为换算因子W为供试品干重质量。结果人参多糖含量为RSD=(n=)。讨论本研究对人参多糖含量测定的提取条件的加水量)提取次数进行了单因素考察同时也对苯酚硫酸法中的苯酚用量)硫酸用量)沸水加热时间进行了正交实验考察结果优选出的最佳提取条件和显色条件。利用精制多糖测得多糖对葡萄糖的换算因子可消除单纯以葡萄糖为标准计算多糖含量带来的误差而以往人参多糖含量测定文献只做了这一步未对精制多糖的纯度进行评价也未对精制前后的单糖组成进行验证。本文测定了人参精制多糖的CNMR谱结果表明其中已基本不含蛋白质等其他杂质并采用多糖PMP柱前衍生化法HPLC法检测其粗多糖和精制多糖的单糖组成表明人参多糖在精制前后其组成未见明显变化。人参多糖中的单糖除了葡萄糖外还有半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖和木糖等不同单糖在苯酚硫酸显色时其吸光度不同造成标准曲线的斜率不同因此单纯以葡萄糖计多糖含量就有误差本文以精制多糖测得多糖对葡萄糖的换算因子消除了单纯以葡萄糖为标准计算多糖含量带来的误差提高了实验结果的准确性。CNMR谱和PMP衍生化HPLC法的结果保证了采用换算因子计算多糖含量的准确性对多糖含量测定具有指导意义为人参的综合应用和质量评价提供科学的依据。参考文献(References)张彬林瑞超冯芳人参多糖的研究概况J中国药事():赵俊吴宏王亚平人参多糖的化学与药理学研究进展J国外医学)中医中药分册():钟岩潘浦群王艳红等苯酚硫酸法测定鲜人参中多糖含量J时珍国医国药():~孙磊乔善义赵毅民黑骨藤多糖含量测定方法研究J中国中药杂志():王文平郭汜远李琳等考马斯亮蓝法测定野木瓜多糖中蛋白质的含量J中国中药杂志():马鸿雁刘小彬李楠等(附子粗多糖提取工艺的优化J时珍国医国药():戴军朱松汤坚PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成J分析测试学报():

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