利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体.doc

利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达载体.doc 利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的 RNAi表达载体 [摘要]NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。实验结果表明Gateway载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。 [关键词]RNAi; Gateway载体; BP和LR反应 Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。λ噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子(INF，Int)的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点:attL，attR。这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。这一过程受 编码蛋白Xis和整合因子(IHF，Int)调控。 与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体(destination vector，目的载体)上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。Gateway技术可以在任何选择的系统:细菌、酵母、昆虫或哺乳动物等[3-7]进行基因的功能表达 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。现在的多点Gateway技术[8]，能够将一个或多个基因克隆到蛋白表达载体，这项强大的体外重组技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，且同时克隆效率高达95%或更高。当基因在重组目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框，同时，Gateway也有助于进行带有不同标签蛋白的表达和纯化，见图1。 NAC是高等植物中特有的一类转录因子，自20世纪90年代从矮牵牛分离第1个NAC基因后[9]。拟南芥中已发现109个NAC转录因子，水稻中有75个NAC[10]。NAC蛋白根据N端保守序将NAC蛋白分为两大类(?，?)，各包含14和4个亚类[11]。NAC转录因子参与植物生长发育的调控，如花器官的发育、侧根的形成、木质部次生壁的形成以及叶片衰老等，同时NAC还参与生物胁迫和非生物胁迫。 本项工作设计带有attB位点(CACC)的引物，利用PCR扩增目的基因SmNAC1片断，以pENTR/SD/D-TOPO为入门载体，进行BP重组反应，形成带有目的基因片断的入门载体，经PCR检测，测序鉴定正确后，在LR Clonase酶作用下，将BP重组反应的克隆产物与表达载体pK7GWIWG2D，进行LR重组反应，最终得到含目的基因SmNAC1的RNAi植物表达载体。 通过使用Gateway技术，简单、快捷、准确的构建成功丹参转录因子SmNAC1的RNAi表达载体。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 丹参Salvia miltiorrhiza Bunge植株;pENTR Directional TOPO Cloning Kits，Gateway LR Clonase ? Enzyme Mix，Gateway载体pK7GWIWG2D均购于Invitrogen公司;大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态购自北京全式金生物技术有限公司;Phusion超保真聚合酶购自NEB公司;质粒提取试剂盒购自上海生工生物公司;ExTaq酶购自大连宝生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司;卡那霉素、壮观霉素购自Amresco公司;所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。 2方法 2.1SmNAC1基因RNAi片段的PCR扩增 利用DNAman软件设计NAC基因的特异性RNAi片段，根据Gateway载体构建的要求，引物5′末端要加上CACC，NACi-F:CACCATTTTCTCGAATTGAATGATT TGGGCCC;NACi-R:CTGATTTGTG TGTGCCTCGGTTACG。使用Phusion超保真酶PCR扩增反应程序:98 ?预变性30 s，然后进行35个循环:98 ? 30 s， 57 ? 30 s，72 ? 30 s，循环结束后72 ? 10 min 延伸反应，4 ?保温。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 2.2BP重组反应 将PCR扩增得到的SmNAC1基因RNAi片段与入门载体pENTR/SD/D-TOPO相连接。3 μL重组反应体系:pENTR/SD/D-TOPO Vector 0.5 μL，生理盐水0.5 μL，PCR产物1 μL，水1 μL，22 ?水浴放置1 h。 2.3LR重组反应 提取入门载体的质粒，在PCR管中，加入Entry clone (BP products， 100 ng) 1 μL，表达载体(pK7GWIWG2D，150 mg?L-1) 1 μL(相应的表达载体与BP产物的质量比为1.5?1)，再加 TE Buffer (pH 8.0) 到4 μL;加入1 μL LR Clonase ?酶(用前轻混)，25 ?水浴3 h，加入1 μL蛋白酶K，37 ?温育10 min，终止LR反应。产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，相应抗生素(壮观霉素Spe，100 g?L-1)平板筛选，PCR及测序验证，提取质粒。 传统的RNAi载体构建方法步骤繁多，实验周期长，Gateway技术与传统的方法相比，不用依赖限制性内切酶，而是依靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，Gateway的干扰载体pK7GWIWG2D载体含有2个aatR1和aatR2重组位点，可以将目的基因特异性片段反方向插入到内含子序列的两侧，利用位点特异性重组将目的基因一次整合到载体上，不需要中间载体。重组过程仅需要2步反应，BP与LR反应，即可高效、快速地将目的基因克隆到其目的载体(destination vector)pK7GWIWG2D上。通过使用Gateway方法成功构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi植物表达载体，此方法在时间上要比传统方法快2,3倍，成功率也高达90%以上，例如，BP反应，成功效率十分高，反应后转入大肠杆菌中，只需一夜，就可以培养基上长出铺满平板的单克隆斑点，挑取其中10个斑点测序，发现都是阳性，成功率99%以上;LR反应后也转入大肠杆菌中，虽然长出的单克隆点不如BP反应多，但也有30个左右，选10个进行测序，成功率也在90%以上。使用Gateway的方法也有几点需要注意。首先设计RNAi的特异性基因片断不要过长，一般在300,500 bp为最好。其次，设计attB重组反应引物时，引物长度一 般在20,25 bp，不要过长，一定要在5′末端加上attB重组位点，CACC。 Invitrogen公司有不同种的入门载体，入门载体pENTR/SD/D-TOPO是包含 Shine-Dalgarno)位点序列，可以有效的使融合蛋白在大肠杆菌一个SD( 中的表达。Invitrogen公司推荐BP反应在室温条件下5 min即可连接成 功，在实际操作过程中，为了提高效率，可以把入门载体与目的基因的混 合物放入22 ?水浴1 h，这样会使结果阳性率很高。LR反应时，要保证 入门载体和目的载体的质粒浓度大于150 mg?L-1，为了提高连接效率，入 门载体与目的载体的摩尔比应为1.5?1，并且25 ?水浴大于3 h。仅管 Gateway技术优点很多，但是也存在一定的缺陷，比如通用性不如经典克 隆强，对于本身含有重组类似或保守序列的片段或结构复杂的片段应用此 法可能会受影响。 [参考文献] [1] Bushman W， Thompson J F， Vargas L， et al. 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According to Gateway cloning technology， the specific fragments of SmNAC1 containing attB adapter was amplified by PCR using ultra-fideling phusion polymerase of NEB. By the BP recombination reaction， the PCR product containing attB was transferred to an donor vector (pENTR/SD/D-TOPO) . Finally， SmNACi specific gene was cloned into pK7GWIWG2D plant expression vectors by LR recombination reaction. Experimental results showed that Gateway cloning technology provide a rapid and highly efficient way to clone the interested gene. [Key words] RNAi; Gateway vectors; BP and LR reactions doi:10.4268/cjcmm20140905