【doc】 云南常见药用红景天的RAPD分析

【doc】 云南常见药用红景天的RAPD分析 云南常见药用红景天的RAPD分析 ?96?中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第1期2005年1月 药材与资源 云南常见药用红景天的RAPD分析 虞泓,朱荣勋,李永谊,和云峰 (1.云南英茂生物技术实验室,云南昆明650106;2.云南大学生命科学学院生态遗传学实验室,云南昆明650091) 摘要:目的研究云南常见药用植物红景天的遗传背景.方法采用RAPD技术对3种6个居群59个红景天样 品进行了遗传关系研究.结果大花红景天3个居群的多态位点百分率(PPB)分别1.结论RAPD分子标记可很好地用于红景天物种的分子鉴定和遗传背景研究. 关键词:大花红景天;长鞭红景天;云南红景天;遗传多样性;Shannon’S信息指数;随机扩增多态DNA 中图分类号:R282.710.3文献标识码:A文章编号:0253—2670(2005)O1—0096一O4 RAPDanalysisofcommonmedicinalplantsofRhodiolaL.inYunnanProvinc e YUHong..,ZHURong—xun,L1Yong-yi,HEYun—feng (1.YunnanInmolLaboratoryofBiotechnology,Kunming650106,China;2.LaboratoryofEcologicalGenetics, CollegeofLifeScience,YunnanUniversity,Kunming650091,China) Abstract:ObjectiveToanalyzethehereditarybackgroundofcommonspeciesfromRhodiolaL.in YunnanProvince.MethodsFifty—ninesamplesofsixpopulationsinthreena turalmedicinalspeciesfrom RhodiolaL.werestudiedbyRAPDmethod.ResultsThepercentageofpolymorphicbands(PPB)of threepopulationsfromR.crenulataere37.97,46.15,and39.45respectivelopulationsfromR.stigiata were43.67and44.42%,1were0.2153and0.2174,respectively;atthespeciallevel,thePPBwas 65.51,Gand1were0.3132and0.3139,respectively;thePPBofR.yunnanensiswas36.97%,1was O.1881.ConclusionRAPDmolecularmarkercouldbeusedtomolecularauthenticationandgenetic diversityanalysisofmedicinalspeciesfromRhodiolaL. Keywords:Rhodiolacrenulata(Hook.f.etThoms.)S.H.Fu;Rhodiolastigiata(Hook.f.et Thorns.)S.H.Fu;Rhodiolayunnanensis(Franch.)S.H.Fu;geneticdiversity;Shannon’Sinformation index:RAPD 红景天为景天科(Crassulaceae)红景天属 (RhodiolaL.)多年生草本或亚灌木植物,多生长在 海拔30005000m的雪域高原及干旱,低温,缺 氧,紫外线照射强,风大,积雪的石灰岩和砾岩的恶 劣环境中口].红景天属植物在全世界有9O多种,分 布于欧,亚和北美的高寒山区.我国有7O多种分布 于东北,华北,西北,西南等地,云南有24种,主要分 布于横断山区[2].现代医药研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:红景天具有抗 寒冷,抗缺氧,抗疲劳,抗微波辐射,抗衰老,抗肿瘤 及抗病毒,强心,增强免疫力等生理,药理作用,并表 现出很好的双向调节作用.而且其抗疲劳,抗缺氧和 增强免疫力作用超过人参,刺五加和绞股蓝;益智作 用超过刺五加,又无人参兴奋过强和刺五加易致便 秘的缺点,因此格外受到重视. 关于红景天遗传多样性及其遗传结构研究报道 十分少见,目前缺乏开展红景天引种,驯化,繁育和 遗传育种以及栽培等工作的遗传基础资料.RAPD 是研究居群遗传多样性快速,简便,有效的方法.因 收稿日期:200403—28 基金项目:中药现代化科技产业(云南)基地专项(2002ZY一18) 作者简介:虞泓(10一),教授,博士生导师,现从事药用植物引种驯化, 遗传育种,GAP,化学和生物指纹图谱研究 .Tel:(0871)7392184Fax:(0871)7392576E—mail:fisher@yninmo1. com …一.…… 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第1期2005年1 月’97. 此,开展红景天居群RAPD遗传多样性研究,将揭 示红景天的遗传多样性及其遗传结构,可以为红景 天的引种驯化和遗传育种提供理论依据和基础资 料.本研究试图利用RAPD分子标记技术,开展红 景天居群遗传多样性和遗传结构分析,为红景天药 用植物保护,引种驯化,遗传育种,繁育栽培和GAP 种植提供理论依据和方法措施.同时,对红景天药 材,GAP种植优良品种进行DNA分子标记,为红 景天DNA指纹图谱奠定基础. 利用RAPD技术对云南常见药用红景天原植 物的3个种6个居群59个个体进行了随机引物扩 增,对红景天不同种,不同居群间的亲缘关系和遗传 多样性进行了探讨,为红景天引种驯化和繁育栽培, GAP 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 化种植和分子指纹鉴定提供素材和依据. 1材料和方法 1.1实验材料:供试的3个种6个居群59个个体 分别采自云南省中甸,丽江,怒江,并引种驯化种植 在香格里拉县小中甸镇共卓社引种驯化基地(海拔 3300m),样品来源见表1. 表1供试样品材料 Table1Plantmaterialsfortest 1.2实验方法 1.2.1红景天基因组总DNA的提取:基因组 DNA提取采用CTAB法I3],并稍作修改.0.5g左 右的植物组织加入到4mL预热到65C的2× CTAB(含2一巯基乙醇)中,研磨成糊状,65C水 浴1h,冷却至室温,加入1/3体积5mol/L的KAc 冰浴1h,4C7000×g离心3min,取上清液,C1 抽提液(氯仿一异戊醇一24:1)抽提2次,取上清液 加3/4体积的异丙醇,一20C静置30,60min, 12000×g离心10min,70乙醇洗2次,无水乙醇 洗1次.加400L1×TE,室温静置2h,使DNA充 分溶解,1琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,用 , ~DNA(20,50,100ng/t~L)标定,利用Kodak1D分 析软件分析并标定到20ng//~L备用. 1.2.2RAPD扩增:引物筛选:从80个随机寡核苷 酸引物(上海生工)中筛选出21个扩增良好,带型清 晰的引物用于正式扩增.见表2. 表2引物扩增结果 Table2Primersforamplification 引物序列引物序列 SlGTTTCGCTCCS2l7CCAACGTCGT S5TGCGCCCTTC$366CACCTTTCCC S8GTCCACACGG$399GAGTGGTGAC Sl2CCTTGACGCAS46lGTAGCACTCC $21CAGGCCCTTCS462TCGGCACGCA S35TTCCGAACCCS463CTGATACGCC $82GGCACTGAGG$464GTGTCTCAGG $94GGATGAGACC$465CCCCGGTAAC $201GGGCCACTCA$466GTGGGCTGAC $208AACGGXGACAS5l2ACAGGTGCGT $212GGGTGTGTAG 反应体系:采用25L反应体系,其中模板 DNA40ng,20mmol/LMgC12(Taq酶配套),2.5 L10×Buffer(Taq酶配套),dNTPs为0.2 mmol/L(上海生工),Taq酶(ShanghaiPromega) 2.0U,引物(上海生工)2.64ng/t~L. 扩增程序:反应在PE9700型PCR仪(美国应 用生物系统公司)进行,采用降落式多聚酶链式反应 (Touch—downPCR)程序,循环参数为94?预变性 5min,然后经94C变性30S,40lC梯度降温退火30 S(每个循环降温1?),72C延伸60S,循环14次 后,将退火温度恒定在34C再循环26次,最后72 C延伸7min,灭菌水代替模板DNA作空白对照. 产物检测:扩增产物在1×TAE,2.0的琼脂 糖凝胶中电泳,溴化乙锭染色,用GeneRuler1O0 bpDNALadder作分子量标记(MB1Fermentas), Kodak1D凝胶成像系统照相,曝光2rnin. 1.2.3数据统计分析:利用Kodak1D分析软件分 析,每个样品的扩增带按有或无记录,”有”赋值为 1,”无”赋值0,得到原始数据矩阵.弱带及重复性不 好的条带不予统计.利用PAUPBeta10forPower PC商用软件包和PopGene32共享软件计算统计 所得数据. 2RAPD扩增结果 本实验中21个随机寡核苷酸引物所检测到的 片段大小在0.24,2.2kb,条带清晰可辨,部分结 果见图1.PAUP软件运算得到红景天59个个体间 的非加权算术平均数(UPGMA)聚类树,用靴带值 (500次重复抽样)检验各分支的支持强度,见图2. 利用PopGene32软件,假定Hardy—Weinberg平衡 得到红景天居群的遗传距离,物种和居群水平的平 均等位基因数(),有效等位基因数(Ae),Nei’S基 因多样性(矗),Shannon’S信息指数()和多态位点 比率(PPB),见表3;红景天居群基因分化系数 .98.中草药ChineseTraditiona1andHerba1Drugs第36卷第1期2005年1月 图1引物$21对红景天不同个体的扩增 结果(图上的数据为个体编号) Fig.1RAPDamplifiedproductsgeneratedby$21 todifferentsamplesofRhodiolaL? (datainfigureareNo.ofsamples) 图2红景天59个样品UPGMA系统树(基于靴带检 验,分支上的数字是500次检测的靴带值) Fig.2Dendrogramof59samplesofRhodiolaL? byUPGMA(basedonbootstrap,numbers onbranchesarebootstrapestimates for500replicates) (G.),见表4. 3结果分析与讨论 3.1红景天居群的遗传变异:RAPD分子标记中, PPB值的大小代表了居群遗传多样性水平的高低. 祖元刚等用等位酶分析技术对分布于黑龙江大海林 林业局高山红景天R.sachalinensisA.Bor.天然 分布区内3个亚居群及吉林长白山1个亚居群的9 种酶系统18个位点进行了遗传分析,结果表明居群 内存在一定的遗传变异(PPB一30.55,A一 1.333)__4].颜廷芬等用等位酶分析技术对分布于黑 龙江大海林林业局平顶山及吉林长白山北坡的4个 海拔梯度的长白红景天R.angustaNakai的遗传 多样性及遗传分化进行了初步分析,结果表明长白 红景天天然居群中存在一定的遗传变异(一1.48, PPB一46.7.HP一0.195)].在本研究中大花红 景天居群和长鞭红景天居群水平的PPB平均分别 表3居群内部和居群间的平均等位基因数,有效等位基因 数,Nei氏基因多样性,Shannon’S指数,Shannon多样 性基因遗传分化系数及多态位点比率 Table3Averagenumberofalleles,effectivealleles’ NeiSgenediversity,Shannon’Sinformation indexofdiversity,genedifferentiatiOnby Shannondiversity,andPPBwithinand amongpopulationsfromRhodiolaL? A一等位基因数AP一有效等位基因数h-Nei’s基因多样性, Shannon’s信息指数Ist-Shannon多样性基因遗传分化系数 PPB-多态位点比率 allelenumberAe—effectiveallelenumberh—Nei’sgene A— diversityI-Shannon’sinformationindexIs,-genedifferentiation byShannondiversityPPB—percentageofpolymorphicbands 表4云南长鞭红景天和大花红景天居群遗传分化分析 Table4PopulationgeneticdifferentiationGl analysisofR.fastigiataandR. crenulatafromYunnanProvince G一基因遗传分化系数Ht一总基因遗传多样性月一种群基因 遗传多样性D.t一居群间基因多样性 G.t—coefficientofgenedifferentiationHt—totalgenediversity H一genediversitywithinpopulationDt-genediversityamong populations 为70.47和65.51(表3),均显着高于高山红景 天和分布范围狭窄的长白红景天,这与大花红景天 和长鞭红景天所具有的丰富的蕴藏量和广泛分布的 状态一致. 从物种水平看,大花红景天PPB值(70.47%) 大于长鞭红景天PPB值(65.51);从居群水平看, 大花红景天居群平均PPB值(41.19)小于长鞭红 景天居群平均PPB值(44.05),云南红景天居群 PPB值最小(36.97%).从物种水平看,Nei’S基因 多样性,长鞭红景天(0.2068)>大花红景天 (O.1614);Shannon’S信息指数,长鞭红景天 (O.3139)>大花红景天(0.2583).从居群平均水平 看,Nei’S基因多样性也是长鞭红景天(0.1408)>大 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第1期2005年1 月.99’ 花红景天(0.1304);Shannon’S信息指数也是长鞭 红景天(0.2164)>大花红景天(0.2008).由此可 见,除了物种水平的PPB值以外,长鞭红景天遗传 多样性总体大于大花红景天.大花红景天PPB值大 于长鞭红景天可能是由于长鞭红景天检测居群数少 于大花红景天检测的居群数. 3.2红景天居群的遗传多样性及基因型的聚类分 析:从RAPD分子标记聚类树上可以看出,不同种 的红景天属植物得到了明确的区分,每种红景天不 同居群的不同个体均在种一级聚在一起,表明 RAPD分子标记可以作为其种的分子鉴定依据.在 居群水平上,同为中甸出产的2个长鞭红景天居群 从遗传距离和遗传一致度上得到了良好的分辨,大 花红景天的怒江高黎贡山居群也与另2个大花红景 天居群明显分开(图2,表5),表明RAPD分子标记 对同种红景天不同居群有较好的鉴别力.大花红景 天中甸哈巴雪山和丽江玉龙雪山居群遗传相似性最 大,因为2个居群分布较近,仅为金沙江一江之隔, 它们的遗传距离较小为0.0325,遗传一致度较大为 0.9680(表5);两个居群存在较强烈的基因流动,其 基因流Nm值为3.3092,远大于大花红景天的平 均值Nm一1.4014. 表5红景天6个居群的Nei氏遗传距离(斜下)及遗传特性 Table5Nie’Sgeneticdistance(belowdiagona1) andgeneticidentityinsixpopulations 0fRhodiolaI. 居群HAHBHCHHHDHG HA****o.96800.91010.82960.82590.8054 HB0.0325****0.92l50.82700.81510.8110 HC0.09420.08l8****0.79950.79720.7842 HH0.18690.19000.2238****0.85640.7949 HD0.19120.20440.22670.1550****0.7998 HG0.2l640.20950.243l0.22950.2234*** 将红景天不同种特有带和居群特有带进行克隆 测序,转化为SCAR标记,则可对红景天属药用植 物进行种或居群的DNA分子鉴定,并在一定程度 上区分其地道性. 3.3红景天居群的遗传分化:Nei(1973)把总基因 多样性(?)分解为居群内基因多样性(?)和居群 间基因多样性(D),即:?一?+D.,而G一D/ ?,所以,居群的基因分化系数G.一(?一?)/ ?.由表5可知,大花红景天3个居群的基因分化 系数G为0.2630,即在总的遗传变异中有26.3 的变异存在于居群间,73.7的变异存在于各居群 内;长鞭红景天2个居群的G.为0.3132,即在总的 遗传变异中有31.32的变异存在于居群间, 68.68的变异存在于各居群内.根据ShannonS信 息指数,Shannon多样性基因遗传分化系数I一 (Hsp—Hpop)/Hsp,大花红景天I.一0.2226,长鞭 红景天,一0.3108,与两者的G.值基本一致.研究 显示,长鞭红景天居群间的遗传分化程度高于大花 红景天. Hamrick等(1990)认为影响居群遗传变异大小 的主要因素依次为:繁育系统,分布范围和生活型, 红景天繁育系统均以异花授粉为主,有性生殖兼无 性生殖.所以,影响居群遗传变异的主要因素是分布 范围,地理位置及小生境的差异引.调查表明,大花 红景天一般生长于雪线附近的流石滩上,分布于海 拔3800,5500m的地方;长鞭红景天从海拔 25o0,5400ITI内均有分布,适应幅度也较大.所 以,长鞭红景天(G.一0.3132)的遗传分化程度大于 大花红景天(G.一0.2630),而两者的G.值又均大 于分布范围狭窄的长白红景天(G.一0.134). References: [1]XuL,XuHH,HuangzS,eta1.New7’’hniquesof CultivationforGoodAgriculturalPractice(GAP)and IndustrializingDevelopmentontheChineseRare—medicinal Herbs(中国名贵药材规范化栽培技术与产业化开发新技术) EM3.Beijing:BeijingMedicalUniversityandPekingUnion MedicalCollegeUnitedPress,2001. Ez3InstitutumBotanicumKunmingenseAcademiaeSinieae.Flora Yunnanica(云南植物志)EM].Tomus8.Beijing:Science Press.1997. [3]DolyeJJ,DolyeJL.ArapidDNAisolationmethodforsmall quantitiesoffreshtissues[J].PhytochemBull,1987,19:11一 l5. [4]ZuYG,YanTF,ZhouFJ.Apreliminarystudyongenetic variationendangeredmechanismofRhodiolasachalinensis naturalpopulation[J].BullBotRes(植物研究),1998,18 (3):304—3l0. [53YanTF,ZhouFJ,YanXF,eta1.Geneticdiversityand populationdifferentiationofRhodiolaangusta[J].BullBot Res(植物研究),1999,19(2):189—194. [6]BrownAHD,FrankleOH,Marsaha11DR,t口.丁u ofBlantGeneticResources[M].NewYork:CambridgeUni— versityPress,1989.