真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响

真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响 真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的 影响 吉林农业大学2011,33(3):293,300 JournalofJil(nAgriculturalUniversity E—mail:flndxb@vip.sina.conl 真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影 响 杜研,王康宇,王义,孙春玉,蒋世翠,张美萍 吉林农业大学生命科学学院,长春130118 摘要:以黄芪愈伤组织为试验材料,研究了不同种类真菌及同种真菌的不同浓度,不同添加时间和作用时 问对黄芪愈伤组织生长和皂苷含量的影响.用真菌提取物对黄芪愈伤组织进行诱导处理后,检测黄芪愈伤组 织的生长量和皂苷含量以及代谢过程中POD,PAL,PPO,CAT的酶活性和NO,MDA,H202的含量.结果表明: 8OmL的散子囊菌作为诱导子处理黄芪愈伤组织效果最佳,细胞的鲜重和皂苷含量分别达到12.387g和 l1.5084mg/g,并且在培养的第28天加入,作用时间为7d,此时皂苷的产率达1.42%.真菌诱导子的加入可 以激发黄芪细胞的防御性应答反应,产生氧进发和一氧化氮进发,细胞的氧化还原态势发生了明显的变化,膜 脂过氧化产物MDA的含量大幅度提高,POD,PPO,CAT的活力出现波动性的变化,并具有一定的时序性,同时 与次生代谢产物积累有关的PAL活力也得到大幅度提高. 关键词:黄蓖;愈伤组织;真菌诱导子;皂苷;次生代谢 中图分类号:$567.23文献标识码:A文章编号:1000—5684(2011)03—0293—08 DOI:CNKI:22—1100/S.20110220.1702.003 网络出版地址:】0220.1702.003.html 引文格式:杜研,王康字,王义,等.真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响[J]. 吉林农业大学, 201l,33(1):293—300. EffectsofFungalElicitorsonGrowthandMetabolisminCallusofAstra— galusmembranaceus(Fisch)Bge. DUYan,WANGKang—yu,WANGYi,SUNChun—yu,JIANGShi—cui,ZHANGMei— ping CollegeofScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China Abstract:Effeetsofdifierentfungalelicitorsanddifferentconcentration,additiontimeandactiontimeon thegrowthandsaponincontentincallusofAstragalusmembranaceus(Fisch)Bgewerestudied.Growth yield,saponincontentandenzymeactivityofperoxydasephenylalnine,ammonialyase,p0lyphenoloxidase andhydrogenperoxidaseandcontentofnitrogenmonoxidum,malonaldehydeandhydrogenperoxideafter culturetreatedwithsalysalicacidweremeasured.Results:ThebesteffectoffungatelicitorisEurotium, thebestconcentrationofwhichis80g/mL.Thefleshweightanddryweightreach12.387gand 11.5084mg/g,respectively.Theadditiontimeisthe28thdayandtheactiontimeis7days.Atthat time.theyieldofsaponincontentreaches1.42%.Theresultsshowthatfungalelicitorstriggeroxygen andnitrogenmonoxidumburst,changesofcellredoxstatus,andfluctuationoftheactivityofredoxen— zymeswithasequence.ThecontentofMDAincreasedwhiletheactivityofphenylalnineammonialyase waspromoted. Keywords:Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.;callus;fungalelicitor;saponin;seconda ry 基金项目:吉林省中医药管理局项目(2004.116) 作者简介:杜研,女,硕士,研究方向:药用植物代谢工程. 收稿日期:2010—07—30网络出版时间:2011-022017:02 *通讯作者 294吉林农业大学2011年6月 真菌诱导子是来源于真菌的一种特定的化学 信号.在植物与真菌的相互作用中,能快速,高度 专一和选择性地诱导植物特定基因的表达,进而 活化特定次生代谢途径,积累特定的目的次生产 物?j.利用真菌诱导子调控植物次生代谢,进而 提高目的次生产物的含量,已在植物组织和细胞 培养中得到广泛应用. 黄芪皂苷为黄芪[Astragalusm~mbranacelL$ 是次级代谢物,属 (Fisch)Bge.]的有效成分之一, 于三萜类化合物,它在正常情况下含量很低.有 报道HJ,次生代谢产物的合成和积累随诱导子的 加入而发生显着变化.因此,深入了解影响黄芪 皂苷生物合成的调控机制,为今后大规模生产黄 芪皂苷奠定理论基础.本试验利用黄芪根际微生 物作为诱导子,研究其对黄芪愈伤组织次生代谢 的调控作用,为药用植物作为生物反应器生产有 用次生代谢产物提供理论依据. 1材料与方法 1.1供试材料和培养条件 由黄芪无菌苗的子叶,胚轴诱导愈伤组织,继 代1年以上的稳定体系.培养条件:MS+5mg/L IBA+0.5mg/LBA+3%蔗糖+0.65%琼脂,pH 6.0(灭菌前),25?,暗培养,28d继代1次. 1.2诱导子的准备和添加 1.2.1黄芪根际微生物(真菌)的分离,纯化及 鉴定使用马丁氏培养基,采用稀释涂布平板法 进行菌种分离和纯化.将纯化的菌种接种于查氏 培养基上,采用扦片法和菌落观察及显微镜观察, 根据孢子形成和其形态进行鉴定?2剖. 1.2.2诱导子的制备和测定方法将分离纯化 的6种真菌分别接种于液体马丁氏培养基, 26,1()(),110r/rain普通摇床上振荡培养,5, 6d后,待菌丝体充分生长后收获.悬浮培养的 菌丝体经抽滤后,用蒸馏水反复冲洗几次,加入 l0倍体积的生理盐水室温下进行超声波破碎 30n1in,然后3000r/rain离心10min,收集上清液. 12lqC高温灭菌20rain后即为诱导子粗提物.用 葸酮比色法测定上述制备的诱导子粗提物中的多 糖含量,根据诱导子粗提物中含糖量确定诱导子 的添加浓度.诱导子粗提物于无菌的条件下加入 培养的黄芪愈伤组织中,检测其对黄芪愈伤组织 生长量及皂苷含量的影响. 1.3黄芪培养物生长量和黄芪皂苷含量的测定 1.3.1黄芪培养物生长量的测定定期对培养 物的生长情况进行检测,以鲜重(Fw)增加量,干 重(DW)增加量计算.干重是将鲜重材料于50? 以下烘干至恒重. 1.3.2黄芪皂苷的提取及其含量的测定(1)黄 芪皂苷的提取.将烘干至恒重的黄芪愈伤组一 研磨成细粉一精确称取1g一甲醇浸泡24h一赳 声波提取30min一蒸干甲醇一蒸馏水回溶一乙酸 乙酯萃取3次,收集水相一水饱和正丁醇萃取3 次,收集正丁醇相一蒸干正丁醇一甲醇回溶,储存 备用.(2)标准曲线的绘制.精密吸取黄芪皂苷 标准液0,50,60,70,80,90,100,uL各加人1支试 管中,不足100L的以甲醇补足至100L,再加 入0.5mL香草醛(5%),置于冰浴中,然后缓缓加 入5mL硫酸(72%)溶液,混匀后放入62cI=水浴 中保温20min,取出冰浴冷却至室温,摇匀,以第1 组作空白(对照),用751GD紫外/可见分光光度 计在=544nm波长处测吸光度,30min内测完. 共作3组平行试验以减小试验中因各种因素造成 的误差.再以黄芪皂苷的浓度与吸光度的数据作 线性回归分析,计算回归方程为Y=0.3283一 0.0104,R=0.9922,Y为吸光度,为浓度. (3)黄芪皂苷含量的测定.取0.1mL黄芪皂苷溶 液于磨口试管中,加0.5mL5%香草醛溶液和 5mL72%的H's0d,60?水浴加热20min,冷却, 摇匀,测OD甜值. 1.4黄芪愈伤组织代谢产物检测 1.4.1过氧化物酶活性测定(1)酶液提取.取 5g用滤纸吸水处理过的黄芪愈伤组织置于预冷 研钵中,加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),15mL pH6.0磷酸缓冲液充分研磨成匀浆,4000r/min 4cl=条件下离心15min,取上清转入25mL容量瓶 中,用缓冲液再次提取残渣,合并上清,定容,低温 保存备用.(2)酶活性测定.精密吸取酶液 0,1mL分别加入试管中,不足lmL的用蒸馏水 补足至1mL,再加入3mLpH6.0磷酸缓冲液, 1mL3%H2O2溶液,1mL愈创木酚溶液,混匀后 34?水浴保温3rain,取出后在470/lm处比色测 JournalofJilinAgriculturalUniversity2011,June 杜研等:真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响295 定酶活性[4-5],试验重复3次. 1.4.2苯丙氨酸解氨酶活性测定(1)酶液提 取.取5g用滤纸吸水处理过的黄芪培养物置于 预冷研钵中,加入少量石英沙,0.5g聚乙烯吡咯 烷酮(PVP),15mL0.05mol/L硼酸缓冲液充分研 磨成匀浆,1万r/rain4?条件下离心20min,取上 清转入25mL容量瓶中,用缓冲液再次提取残渣, 合并上清,用0.05mol/L(pH8.7)硼酸缓冲液定 容,备用.(2)酶活力测定.精密吸取酶液0, 1mL分别加入试管中,不足1mL的用蒸馏水补 足至1mL,再加入4mLpH8.7硼酸缓冲液,1mL 0.02mol/L苯丙氨酸溶液,40?水浴恒温1h,加 试验重复3 0.2mol/LHC1终止反应,测定酶活性, 次[一. 1.4.3多酚氧化酶活性测定(1)酶液提取.取 5g用滤纸吸水处理过的黄芪培养物置于预冷研 钵中,加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),15mL 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)充分研磨成匀 浆.3000r/min4?条件下离心15min,取上清转 入25mL容量瓶中,用缓冲液再次提取残渣,合并 上清,定容,低温保存备用[7-S].(2)酶活力测定. 精密吸取酶液0,1mL分别力II入试管中,不足1mL 的用蒸馏水补足至1mT一再加入1.5mL 0.05mol/L磷酸缓冲液,3mL0.02mol/L邻苯二 酚溶液,30?水浴恒温10min,在525nm波长下 测定吸光值并测定酶活性{J,试验重复3次. 1.4.4过氧化氢酶活性测定(1)酶液提取.称 取材料5g,加入0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),吸 取15mL0.05mol/LpH7.8磷酸缓冲液,充分研 磨,并用高速冷冻离心机在4000r/min,4?条件 下离心15rain,取上清液定容至25mL,4?条件 下保存备用.(2)酶活力测定.精密吸取酶液 0.2mL~1]人试管中,再加入1.5mL0.05mol/L磷 酸缓冲液,1mL蒸馏水,25?预热后,逐渐加入 0.5mL0.1mol/L的H:O,每加完1管立即计时, 并迅速倒入石英比色杯中240nm下测定吸光度, 每隔1min读数1次,共测4min,全部测定后,计 算酶活性,以1min内A加减少0.1的酶量为1个 酶活单位(U)[8-91,试验重复3次. 1.4.5丙二醛含量的测定(1)MDA的提取. 称取材料2g,加入2mL10%三氯乙酸(TCA)和少 研磨至匀浆,再加8mLTCA进一步研 量石英砂, 磨,匀浆在4000r/min离心10min,上清液为样品 吉林农业大学JournalofJilinAgriculturalUniversity 提取液.(2)显色反应和测定.精密吸取上清提 取液0,2mL分别加入试管中,不足2mL的用蒸 馏水补足至2mL,再加入1mL0.6%TBA溶液,沸 水浴上反应15min,迅速冷却后再离心.取上清 液测定450,532,600nm下的吸光度9j. 1.4.6过氧化氢含量的测定(1)标准曲线的制 作.精密吸取100tlmol/LH202标准液0,0.1, 0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7mL分别加入1支试管 中,不足1mL的以4?下预冷的丙酮溶液补足至 1mL,再加入0.1mL5%硫酸钛,0.2mL浓氨水, 3000r/min离心10min,弃去上清液,留沉淀,再 加入5.0mL2mol/L硫酸,待沉淀完全溶解后,将 其转入10mL容量瓶中,用蒸馏水定容至10mL, 415nm下测定OD值,绘制标准曲线l8J回归方 程为Y:0.0069X+0.004l,R:0.997,Y为吸 光度,为浓度.(2)样品的提取和测定.称取新 鲜植物组织5g,材料与提取剂1:1的比例加入 4?下预冷丙酮和少许石英砂研磨至匀浆后,转 入离心管3000r/min下离心10min,弃去残渣, 清液为样品提取液.吸取1mL样品提取液,分别 加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后 3000r/min下离心10min,弃去上清液.沉淀用 丙酮反复洗涤3—5次,直到去除植物色素.向洗 涤后的沉淀中加入2mol/L的硫酸5mI,待沉淀 完全溶解,4l5nm处比色l8J. 1.4.7一氧化氮含量的测定(1)样品的提取. 称取1g材料,加入5mL蒸馏水和少许石英砂研 磨至匀浆后,转入离心管,4000r/min下离心 10min,弃去残渣,上清液为样品提取液.(2)含 量的测定.按照南京建成AO13一氧化氮(NO)试 剂盒测定. 2结果与分析 2.1黄芪根际微生物的鉴定 从马丁氏培养基上共分离得到6种真菌,这 6种菌株的菌落,菌丝及孢子形态描述如下: A,E,F:将A,E,F分别接种于查氏培养基上, 24,26c【二培养5—6d.菌落初期为白色,后期为 灰白色,菌丝无色透明,无横隔,不产生假根,不形 成子实体,孢子梗直立,孢子囊球形,有囊轴,孢子 囊壁薄,孢子由孢子囊壁破裂后释放.3种真菌 的孢子大小以及菌丝直径分别为A:孢子大小7, 8m,4m,菌丝直径14m;E:孢子大小6f』m, 296吉林农业大学2011年6月 3,4m,菌丝直径6,7m;F:孢子大小6m, 4m,菌丝直径9,10肛m.初步鉴定为毛霉(Mu— COtsp.1,Mucorsp.2,Mucorsp.3). B:将B接种于查氏培养基上,24—26?培养 2,3d.菌落表面疏松,呈绒毛状,颜色为淡黄 色.产生分生孢子,子囊果壁多膜质,由大而多的 角的菌丝组成,子囊果混生于黄色菌丝丛中.孢 子大小20m,4m,菌丝直径8l-tm.初步鉴定为 散子囊菌(Eurotiumsp). c:将C接种于查氏培养基上,24,26?培养 2,3d.菌落初期为棉絮状,呈白色,逐渐变成浅 绿色,最后变成深绿色.菌丝透明,有隔,孢子梗 有分枝,孢子梗上长出二级,三级分枝,分枝上柬 生孢子,孢子近似球型.孢子大小4m,2, 3儿m,菌丝直径4tLm.初步鉴定为木霉(Tricho— dermasp). D:将D接种于查氏培养基上,2426?培养 34d,菌落中部隆起,黄绿色,最外侧呈白色,菌 落上着生有黄色的水珠,背面溶出橙色色素.子 囊果无孔口,无附菌丝,子囊果小,深色,分生孢子 串生,链状,孢子梗有特有形态,疏松菌丝,孢子大 小4m,2m,菌丝直径4m.初步鉴定为青霉 (Penicilliumsp.). 6种真菌的孢子形态见图1. A.毛霉Mucorspl;B.散子囊菌Eurotiumsp.;C.木霉Trichodermasp.;D.青霉 Penicilliumsp.;E.毛霉Mucorsp.2;F毛霉Mucorsp 3;G.散子囊菌菌落形态(正面)Eurotiumsp.(obverse);H.散子囊菌菌落形态(背面)Eurotiumsp.(backside) 图16种真菌的孢子形态及散子囊菌菌落形态(10X40) Fig.1.6Fungalsporesf0rn1andscatteredsacfungicolonymorphous(10×40) 2.2真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长量和皂苷芪愈伤组织中黄芪总皂苷含量的提高. 含量的影响 2.2.1不同种类的真菌对黄芪愈伤组织生长量 和皂苷含量的影响黄芪愈伤组织继代培养后的 第7天,以60肚g/mL诱导子的浓度分别加入A, B,c,D,E,F6种真菌的提取物.在继代培养后的 第28天收获,并测定细胞生长量和黄芪总皂苷含 量(图2).由于在诱导过程中,真菌E提取物对 培养物的污染率极高,所以在真菌诱导子的筛选 过程中被淘汰. 由图2可见,5种真菌诱导子对黄芪细胞的 生长均有一定的抑制作用,但对黄芪的干物质积 累有一定的促进作用,对黄芪皂苷含量的影响除 C外,都有明显的促进作用,其中以B最为明显, 皂苷含量达到了17.2189mg/g,比对照组提高了 29.84%.由此可见,真菌诱导子能明显地促进黄 ckABCDF 口m(鲜);口,,f(干):+折干率Dryrate:—O一皂苷) 图2不同种类的真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长 量和皂苷含量的影响 Fig.2.Effectsofdifferentfungalelicitorsongrowth andsaponincontent 2.2.2不同浓度真菌提取物对黄芪愈伤组织生 JournalofJilinAgriculturalUniversity2011,June 杜研等:真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响297 长和皂苷含量的影响由图3可见,真菌诱导子 在40,150/~g/mL的范围内,细胞的生长,干物质 的积累以及皂苷含量都有明显的变化,并且细胞 生长及皂苷含量的增加随着浓度的增加而增加, 见图3(图注:0.对照;1.40g/mL;2.50tLg/mL; 3.60,ug/mL;4.80g/mL;5.100ug/mL; 6.120g/mL;7.150g/mL).当诱导子浓度达到 80g/mL时,细胞的鲜重和皂苷含量分别达到 12.387g和11.5084mg/g,为对照的1.32倍,同 时折干率也达最大值8.05%;当浓度超过80g/ mL达到150p.g/mL时,细胞的生长及皂苷含量几 乎与对照组持平,并没表现出促进作用,这说明真 菌诱导子在一定范围内与添加浓度呈正相关,但 浓度过高对细胞也会产生负作用,不但不能提高 次生代谓}产物含量,反而还抑制次生代谢产物的 合成.因此,确定80t~g/mL为真菌诱导子的最佳 添加浓度. ? lO , 莲 5 0 I 曲 g lO {缸 蔷罢H- 0 O 01234567 口m(鲜):口(干);+折干率Dryrate;卜--w(皂苷) 图3不同浓度的真菌提取物对黄芪愈伤组织生长 量和皂苷含量的影响 Fig.3.Effectsofdifferentelicitorconcentrationon growthandsaponincontentfungalelicitors 2.2.3不同添加时间和作用时间对黄芪愈伤组 织生长量和皂苷含量的影响不同添加时间和作 用时间对黄芪愈伤组织生长量和皂苷含量的影响 见图4(图注:1.0d加7d收获;2.7d加14d收 获;3.14d加21d收获;4.21d加28d收获; 5.28d加35d收获;6.21d加35d收获;7.35d 加42d收获;8.7d加35d收获;9.14d加35d收 获).真菌提取物的添加时间分别选在细胞生长 的延迟期,对数生长期的早期,中期和晚期以及稳 定期.当第28天加入真菌提取物时,作用7d后 细胞的鲜重,干物质积累以及皂苷含量均达到最 大值.皂苷的产率达到了1.42%,比其他处理的 皂苷含量都高. 吉林农业大学JournalofJilinAgriculturalUniversity 由图4可见,在对数生长期的早期加入诱导 子对细胞生长的促进作用并不明显,而在对数生 长晚期加入真菌诱导子时,细胞的生长量和皂苷 的含量最大.这可能是因为真菌诱导子作为一种 病原微生物对细胞具有很大的毒害作用.而对数 生长期的早期,细胞生长迅速,这时加入真菌诱导 子对细胞生长抑制作用明显.而对数生长期晚期 细胞的生长基本停止,所以在这时加入真菌诱导 子对细胞生长影响不大,并且细胞的生长量已经 达到一定程度,且作用的时间短.因此,确定第 28天为真菌诱导子的最佳添加时间,作用时问为 7d ? 8 \ 4 O 16 l23456,9 口m(鲜);口(干);+皂苷):—*一折干率Dryrate 图4真菌诱导子添加时间和作用时间对黄芪愈伤 组织生长量和皂苷含量的影响 Fig.4.Effectsofadditiontimeandactiontimeoffun- galelicitorsongrowthandsaponincontent 2.3真菌诱导子对黄芪愈伤组织代谢的影响 2.3.1真菌诱导子对过氧化氢含量的影响当 诱导子加入到黄芪愈伤组织培养体系后,过氧化 氢含量迅速升高.植物细胞受到刺激,会在短时 间内快速大量地释放活性氧,过多的活性氧对细 胞是有害的.将真菌提取物加入到黄芪细胞培养 体系后,过氧化氢的含量始终处于上升的趋势,并 且始终高于对照组,在第5天时达到 6.483t~mol/g.随后过氧化氢的含量逐渐下降(图 5).过氧化氢被认为是细胞内与细胞问一种重要 的信使分子,在防卫反应中作为触发信号诱导被 侵染部位的过敏反应.所以,当加入真菌诱导子 以后,过氧化氢的含量会显着高于对照组. 2.3.2真菌诱导子对细胞丙二醛(MDA)含量的 影响从图6中可见,加入真菌提取物后,引起细 胞内MDA的含量迅速上升,并且MDA的含量远 远高于对照组.在添加真菌诱导子后第5天,细 胞内MDA含量达到峰值.植物在逆境胁迫过程 luulu0u口Iu0Q时?BJQ 一?邑/(杠碑\斛鞲 84O 若lu0uIII《0导力 298吉林农业大学2011年6月 中,细胞内活性氧代谢平衡破坏而有利于活性氧 的积累,活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜 脂过氧化作用,从而导致细胞内MDA的含量上 升.MDA含量的上升会造成细胞膜系统受损,严 重时会导致植物细胞死亡. l234567 ,/d — ?一对照ck;—盘一处理Treatment 图5真菌诱导子对黄芪愈伤组织过氧化氢含量的 影响 Fig.5.EffectsoffungalelicitorsontheH2O2contentof Astragalusmembranaceuscallus j ? -:. 鲁 i 《 凸 l234567 t/d —一 对照ck;—一处理Treatment 图6真菌提取物对黄芪愈伤组织MDA含量的影响 Fig.6.EffectsoffungalelicitorsorltheMDAcontentof Astragalusmembranaceuscallus 2.3.3真菌诱导子对细胞一氧化氮含量的影 响由图7可见,真菌诱导子的添加加速了植物 细胞内NO的释放,在第3天时细胞中NO的浓度 达到了4.333ttmol/L,是对照组的2.64倍.与添 加水杨酸作用后的试验结果相一致.NO对黄芪 皂苷的促进作用可能与其活化植物细胞的防御反 应的功能有关. 2.3.4真菌诱导子对黄芪愈伤组织自由基清除 系统保护酶的影响当诱导子加入黄芪细胞培养 体系后,细胞通过启动或加强抗氧化酶类的表达, 以及时清除有害的自由基_l.自由基具有很强 的氧化能力,但不稳定,能持续进行连锁反应,对 许多功能分子具有破坏作用.诱导子加入到细胞 培养体系后,大量自由基的产生诱发了自由基防 御体系中酶保护系统的显着变化,以实现对细胞 自身的保护作用. (1)真菌诱导子对黄芪愈伤组织过氧化物酶 (POD)活力的影响.由图8可见,真菌诱导子能 使黄芪细胞中POD的活力大大提高,并且始终高 于对照组.可见,真菌诱导子能提高POD的活 力,从而提高细胞的抗病能力,提高次生代谢产物 的产量. 5 l234567 t|d —一 对照ck;—?一处理Treatment 图7真菌提取物对黄芪愈伤组织NO含量的影响 Fig.7.EffectsoffungalelicitorsontheNOcontentof Astragalusmembranaceuscallus 30 善2060 2 10 0 1234567 t/d —一 对照ck;—矗一处理Treatment 图8真菌诱导子对黄芪愈伤组织POD活力的影响 Fig.8.EffectsoffungalelicitorsontheactivityofPOD ofAstragalusmembranaceuscallus (2)真菌诱导子对黄芪细胞培养物多酚氧化 酶(PPO)活力的影响.在添加诱导子后PPO活力 的变化见图9.由图9可见,诱导前期PPO的活 力受到抑制,有利于细胞内酚类物质的积累,快速 形成细胞的防御物质.随着酚类物质的积累, PPO受到诱导,其活力逐渐升高,消除多余的酚类 物质对细胞的毒害作用,起到对细胞自身的保护 作用 JournalofJilinAgriculturalUniversity2011,June 432lO —l-暑_10量)/(0邑 765432O 一..莹一0N邑 O86420 1OOOO 杜研等:真菌诱导子对黄芪愈伤组织生长和代谢的影响299 (3)真菌诱导子对黄芪细胞培养物过氧化氢 酶(CAT)活力的影响 25 20 量 曼 lo 5 O 1234567 t/d ——一 对照ok;——一处理Treatment 真菌诱导子对黄芪愈伤组织PPO活力的影响 EffectsoffungalelicitorsontheactivityofPPO ofAstragalusmembranaceuscallus 5r}/众\ l234567 t/d — __<>__一对照ck;—]处理Treatmoat 图10翼西诱导子对黄芪愈伤组织CAT活力的影响 Fig.10.Effectsoffungalelicitors013theactivityof CATofAstragalusmembranaceuscallus 诱导子加入黄芪细胞培养体系后,POD,PPO 的活力均有所提高.由图l0可见,经过真菌诱导 子处理后,CAT的活力在前期均受到不同程度的 抑制,低于对照组,这使得H202能在短时期内维 持较高的浓度.H,0与细胞的信号转导有关,它 能作为胞内的第二信使激活抗病途径中防御的相 关基因,刺激次生代谢物的合成和积累,但过多的 HE0:对细胞会产生毒害作用,所在诱导的后期 CAT的活力迅速提高,并在第3或4天时达到最 大值,明显高于对照组.CAT可以消除部分H20: 以减轻其对细胞的毒害作用. 2.3.5真菌诱导子对黄芪细胞苯丙氨酸解氨酶 (PAL)活力的影响在加入诱导子处理后,细胞 的PAL活力升高(图11).真菌提取物加入初期, PAL的活力明显升高,这可能是细胞快速应答的 反应,诱导子的加入能马上形成对相关基因的诱 导,使PAL活力在相对短时间内就明显升高.在 吉林农业大学JournalofJilinAgriculturalUniversity 诱导后期,PAL活力开始逐渐下降,这可能是由于 参与次生代谢物合成的前体物质已经合成,路径 中的后续物质的合成需要其他酶来催化.PAL活 力的提高,有利于黄酮类次生代谢产物的产生和 积累. l234567 t/d — —?-一对照ck:—1一处理Treatment 图11真菌诱导子对黄芪愈伤组织PAL活力的影响 Fig.11.EffectsoffungalelicitorsontheactivityofPAL ofAstragalusmembranaceuscallus 2.3.6真菌诱导子对黄芪愈伤组织皂苷含量的 影响真菌诱导子对黄芪皂苷含量的影响见图 12.从诱导子加入后的第1天开始,皂苷合成量 就开始增加,随着作用时间的延长,皂苷的含量不 断提高.真菌诱导下的皂苷含量的最大值出现在 诱导后的第3天,并且是对照组的1.79倍. I234567 t/d — ?一对照ck;—1一处理Treatment 图12真菌诱导子对黄芪愈伤组织皂苷含量的影响 Fig.12.Effectsoffungalelicitorsonthesaponincon— tentofcallus 从图l2中可见,皂苷含量并不是始终处于上 升趋势,当其达到最大值后皂苷的合成量开始下 降,最后趋于平稳.这可能是因为植物次生代谢 产物的积累并不是无限制的,过多的次生代谢产 物会对细胞本身产生毒害作用,细胞自身通过关 闭或降低相应代谢途径中关键酶的活力来限制次 生代谢产物的积累量.在黄芪皂苷产量增加的同 时,也对分解它本身的相关酶起了诱导作用,最终 76543210 一I?),1v 2O86420 一昱l?邑/(牡砷 300吉林农业大学2011年6月 又导致了黄芪皂苷含量的降低,但添加诱导子后 皂苷含量始终高于对照组. 3讨论 诱导子是植物抗病生理过程中诱发植物产生 植保素的因子,包括侵染植物的微生物及植物细 胞内的分子.研究表明:诱导子可作为研究植物 次生代谢产物信号识别及其细胞内信息传递的良 好载体.目前研究较多的是采用真菌提取的多糖 物质作为外源性诱导子.真菌诱导子是来源于真 菌的一种特定的化学信号.在植物与真菌的相互 作用中,能快速,高度专一和选择性地诱导植物特 定基因的表达,进而活化特定次生代谢途径,积累 特定的目的次生产物_l.不同种类的真菌诱导 子在植物细胞次生代谢调解中,因其所具有的能 时间先后不 被细胞受体所接受的信息类型,数量, 同,使诱导反应的类型,速度和强度不同,从而使 不同诱导子表现出的生理活性有明显的差异_l. 本研究结果表明:在黄芪愈伤组织中加入真 菌诱导子,对皂苷合成的生理效应,活性最高的是 散子囊菌丝体诱导子.诱导子的不同浓度对黄芪 愈伤组织的生物量和皂苷含量的影响有较大差 别.浓度太低时作用不明显,浓度太高则对细胞 产生毒害作用,抑制培养物的生长,从而使细胞的 干物质积累和次生代谢产物的产量下降;不同的 添加时间以及作用时间对生物量和皂苷含量也起 着重要的作用,本研究确定诱导子加入的最佳时 问为培养周期的第28天,作用时间为7d.原因 可能是在生长早期没有足够的前体可用于合成蛋 白(包括次生代谢产物合成途径的关键酶),或是 提高生物合成量的酶还未受到激活?.本研究 结果表明:诱导子的加入提高了POD,PPO,PAL 的活力,同时CAT的活力受到了抑制.诱导子改 变了黄芪培养物细胞中活性的POD,PAL,CAT和 PPO,这与植物抗胁迫性密切相关【17-18],也是植物 防卫反应的重要生理生化指标,其活力的提高在 一 定程度上表征了细胞次级代谢的增强,活力的 提高有利于植保素的合成和积累ll. 本研究选取6种黄芪的根际真菌,提取并测 定了真菌诱导子中多糖的含量,并按不同浓度加 入到培养基中与黄芪愈伤组织共培养,为研究真 菌诱导子对黄芪皂苷含量的影响提供了定量的方 法.通过对外源性真菌诱导子进行筛选,研究黄 芪次生代谢产物的积累和调控,有利于黄芪离体 培养体系走向工业化. 参考文献: [1]鲁明波,苏湘鄂,梅兴国.真菌诱导物对红豆杉细胞的影响 [J].华中理工大学,1998,26(7):107—109. [2]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出 版社,1999. [3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:科学技术出版社,1979, [4]韦平和.生物化学实验指导[M].北京:中国医药科技出版 社,2003:276—279. [5]奥斯伯F.精编分子生物学实验指南[M].颜子颖,王海林, 译.北京:科学出版社,1998. [6]江昌俊.苯丙氨酸解氨酶的研究进展[J].安徽农业大学学 报,2001,28(4):425-430. 7]朱广廉,[钟海文,张爱琴.植物生理实验[M].北京:北京大学 出版社,1990. [8]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京:高等教育 出版社,1990. [9]汤章城.现代植物生理学实验指南[M].北京:科学出版社, 2004. [10]LambC,DixRA.TheoxidativeburstinpIantdiseaseresistance [J].AnnuRevPlantPhysiolPlantBiol,1997(48):1251.1275. [11]方允中,李文杰.自由基与酶[M].北京:科学出版社,1989. [12]张进杰,徐茂军.NO和茉莉酸甲酯对黄芩悬浮细胞生长及 黄芩苷合成的影响[J].植物,2006,23(4):374.379. [13]ZhangCH,WuJY.Effectsofinoculumsizeandageonbiomass growthandpaclitaxelproduetionofelicitor?treatedTauxeyunna— nensiscellculture[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2002,60(4):396—402. [14]ChappellJR,NableP,?