用兔红细胞膜制备亲和树脂纯化红芸豆红细胞凝集素的方法

用兔红细胞膜制备亲和树脂纯化红芸豆红细胞凝集素的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 用兔红细胞膜制备亲和树脂纯化红芸豆红 细胞凝集素的方法 第8卷第2期 2010年3月 生物加工过程 ChineseJournalofBioproeessEngineering V01.8No.2 Mar.2010 doi:10.3969/j.issn.1672—3678.2010.02.010 用兔红细胞膜制备亲和树脂纯化红芸豆 红细胞凝集素的方法 吴昌英,何涛,吴东明,宋海星,张涛 (1.成都医学院基础医学院,成都610083;2.成都医学院基础医学实验教 学中心生物技术实验室,成都610083) 摘要:建立运用兔红细胞膜制备亲和树脂来纯化红芸豆中红细胞凝集素的方法.红芸豆经过浸提,(NH)SO 沉淀,红细胞膜亲和树脂吸附,洗脱得到红细胞凝集素(PHA—E)试样.采用电泳法测定其纯度,相对分子质量和等 电点.用体积分数2%的兔红细胞悬液测定试样凝血活力及影响凝血因素.经PAGE分析PHA—E试样为单带, SDS—PAGE分析显示亚基相对分子质量为3.2X10,等电点为6.5.研究发现,促使50%兔红细胞产生凝集的试样 蛋白质最低质量浓度为4g/mL,单糖不影响PHA—E凝血活力,EDTA抑制其凝血活力,zn促进其凝血. 关键词:亲和树脂;红细胞膜;凝集素;纯化 中图分类号:Q513文献标志码:A文章编号:1672—3678(2010)02—0050—05 PurificationoferythrohemagglutininfromPhaseolusvulgarisbyusing rabbiterythrocytemembranefabricatedaffinityresin WUChang.ying,HETao,WUDong—ruing一,SONGHai—xing,ZHANGTao (1.SchoolofPreclinicalMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China;2.ExperimentsLearningCenterof PreclimicalMedicineBioteehnologyLaboratory,Chengdu610083,China) Abstract:Amethodforerythrohemagglutinin(PHA— E)productionfromPhaseolusvulgarisanditspurifi— cationbyrabbiterythrocytemembraneaffinityresinwasestablished.PHA— Ewaspurifiedfromtheseeds ofPhaseolusvulgarisbyextraction,(NH4)2SO4precipitation,adsorptionbyerythrocytemembraneaffinity resin,andelution.ThemolecularweightandtheisoelectricpointofpurifiedPHA— Eweredetermined. Theabilityandtheinfluencingfactoroftheagglutinationweredeterminedby2%erythrocytesofhuman. ThepurifiedPHA.EshowedsinglePAGEbandandtheapparentmolecularweightsofthesubunitwas 3.2X10bySDS—PAGEandtheisoelectricpointofthePHA—Ewas6.5.PHA— Ecouldpromoteaggluti— nationofhumanerythrocytesat4txg/m1,anditsactivitywasnotinhibitedbymonosaeeharide.EDTAin— hibitedtheagglutinationability.andZn"accelerateditsbloodeoagnlation. Keywords:affinityresin;erythrocytemembrane;erythrohemagglutinin;purification 植物凝集素(phyt0hemagglutinin,PHA)是从豆 科植物种子中提取的一种含糖蛋白质J,能识别糖 蛋白和糖脂,特别是细胞膜中复杂的碳水化合物结 构,即细胞膜表面的糖基.植物凝集素具有多种生 收稿日期:2009—07—04 基金项目:成都医学院2008年创新性实验项目(CX200814) 作者简介:吴昌英(1987一),女,四川广汉人,学士,研究方向:生化分离;宋海星(联系 人),讲师,E-mail:shx@cmc.edu.cn 第2期吴昌英等:用兔红细胞膜制备亲和树脂纯化红芸豆红细胞凝集素的方法 物学功能如特异性凝集肿瘤细胞,可用于肿瘤的诊 断评价;与荧光素,酶,生物素,铁蛋白及胶体金等 结合,可用于光镜或电镜水平的免疫细胞化学研究 工作.文献[2]报道PHA是由E,L2种亚基组成的 四聚体蛋白质的混合物,按其亚基组成可分为L4, L3E,L2E2,LE3,E4这5种同工凝集素,红细胞凝集 素(E4)与红细胞膜的结合是通过其分子中肽链的 活性部位,即通过专一结合糖链的区域实现的,且 凝集素至少应该具有2个与糖链结合的位点,当这 些结合位点与红细胞膜表面的糖链识别结合后,就 会使红细胞发生凝集现象,且这种结合是可逆的. 本研究利用红细胞膜与红细胞凝集素的专一结合 的特性,经过一次层析即可得到活性较高的红细胞 凝集素单体. 目前分离纯化凝集素的方法很多,主要是 先将提取物经(NH)SO分级沉淀,通过阴离子或 阳离子交换树脂后获得凝集素混合物J,离子交换 子树脂法在前处理阶段需要盐析试样透析脱盐,处 理量大,其操作繁琐耗时,产品凝血活力回收较低, 产品质量较差.相对这些传统的方法,亲和层析方 法具有特异简便的特点,产品纯度和收率高,目前 尚无使用亲和树脂纯化红细胞凝集素单体的报道. 本研究采用纯化的兔红细胞膜,将其固定于树脂上 作为配基,亲和层析纯化得到高纯度的红细胞凝集 素,有较好的应用前景. 1材料与方法 1.1仪器与材料 UV1102紫外可见分光光度计(上海天美科技 有限公司),高速冷冻离心机(Eppendorf公司), MINI—PROTEINIV电泳系统(Bio—Rad公司),蛋白 质纯化系统(GE公司). 红芸豆(购自甘肃兰州),低相对分子质量蛋白 标准(上海东风生物技术有限公司),蛋白质等电点 标准(GE公司),两性电解质(pH3,10,USASan landChemicalCo.,LTD公司),红芸豆凝集素单体 PHA-E(Sigma公司),乙酰氨基葡萄糖(Sigma公 司),其他试剂均为分析纯. 1.2红细胞凝集素的分离纯化 1.2.1红芸豆红细胞凝集素粗提取液的制备 将红芸豆粉碎,称取20g粉末加入30mL醋酸缓 冲液(20mmol/L,pH5.6),搅拌过夜.4层纱布过 滤,收集滤液,调pH5.6,4cIC离心(6000r/min, 10min),取上清液.向上清液中加(NH):SO 6.95g,4离心(10000r/rain,10min),收集上清 液,T矗s.HC1缓冲液(pH7.4,10mmol/L)中透析过 夜.4?离心(10000r/lnin,10min),取上清液,即 制得凝集素粗提取液. 1.2.2兔红细胞膜的提取 1)血液的收集及洗涤取30mL兔血,加入到 含有5mL柠檬酸钠抗凝剂的三角锥形瓶中,轻摇混 匀.4cIC离心(1500r/min,15rain),弃上清液.用 预冷的等渗磷酸盐缓冲液(pH7.4,20mmol/L)洗 涤沉淀,4?离心(1500r/min,15min),弃上清液, 重复洗涤3次,即得红细胞. 2)溶血和红细胞膜的洗涤在洗净的红细胞 中,按照1:10的比例加入预冷的低渗Tris-HC1缓冲 液(pH7.4,10mmol/L)进行溶血.4?离心 (11000r/min,15rain),弃上清液,Tris—HC1缓冲液 (pH7.4,10mmol/L)洗涤沉淀,离心,重复5次,沉 淀即为红细胞膜. 1.2.3红细胞膜亲和树脂的制备 参照文献[7],室温下将琼脂糖溶胀,加入5% 的酸性高锰酸钾溶液,氧化过夜.蒸馏水充分洗涤 后,用体积分数25%,33%,50%,75%,100%的丙 酮溶液洗涤置换树脂水分.加入,一羟基琥珀酰亚 胺(NHS),使其终浓度为0.1mol/L,室温搅拌反应 8h.依次用体积分数75%,50%,33%的丙酮溶液 和蒸馏水洗涤置换丙酮,将树脂转移到Tris—HC1缓 冲液(pH7.4,10mmol/L)中平衡.4?与适量的 红细胞膜耦联,反应8h后用蒸馏水洗去未耦联红 细胞膜,后用Tris—HC1缓冲液(pH7.4,10mmol/L) 浸泡15min,抽气后装柱,得亲和树脂柱. 1.2.4红细胞膜亲和层析红细胞凝集素 将1.2.1中制得的凝集素粗提取液于上述制备 得到的亲和树脂柱上样,用Tris—HC1(pH7.4,10 mmol/L)缓冲液洗至平衡.用Gly.HC1(pH3.5, mmol/L)缓冲液洗脱,收集洗脱活性峰,纯水透析后 冻干,即得PHA—E产品. 1.3凝集素产品的电泳检测 称取纯化得到的PHA—E产品,加纯水溶解后, 用PAGE,SDS—PAGE,等点聚焦电泳测定其纯度,亚 基相对分子质量和等电点,使用标准品作为对照. 1.4PHA—E凝血活力影响因素测定 取V型血凝板,PHA-E倍比稀释后,每空加入 20L,同时加入20LEDTA,二价金属离子或单糖 52生物加工过程第8卷 等待测物质溶液,37?下孵育1h,测定凝血活力后 进行评价. 1.5分析方法 1.5.1蛋白含量的测定 参照文献[8],以牛血清白蛋白为标准,采用 Lowery法分别测定红芸豆匀浆液,(NH):SO沉淀 后上清液,透析液,洗脱峰蛋白质含量. 1.5.2凝血活力测定 抽取兔血1mL加入抗凝剂,用生理盐水反复洗 涤,1500r/min离心10min,最后收集红细胞溶于 25mL生理盐水中,制得兔红细胞悬液. 参照文献[9—10],在微量V型血凝板上进行, 用生理盐水倍比稀释凝集素,每孔含稀释液40, 加入2%兔红细胞悬液40L,振荡混合,在25?下 放置2h,肉眼观察结果,凝集活力以50%兔红细胞 凝集所需凝集素的g表示. 1.5.3蛋白质亚基相对分子质量测定 参照文献[11],使用不连续电泳(SDS—PAGE), 凝胶质量分数为12.5%,pH8.3.考马斯亮蓝R一 250染色. 1.5.4蛋白质等电点的测定 参照文献[11],将试样和pH3,10等电点标 准在pH3—10胶上进行电泳,经考马斯亮蓝R一250 染后,测定试样的等电点. 1.5.5蛋白质纯度的测定 参照文献[11],使用不变性电泳PAGE,用 PHA-E标准品做对照,测定其纯度. 2结果与讨论 2.1红芸豆中红细胞凝集素的分离纯化 经(NH4)S04盐析除杂蛋白,透析除盐后即制得凝 集素粗品.该粗品经兔红细胞膜亲和柱层析,用平衡液 洗去未被吸附的蛋白,换用洗脱液使凝集素与柱子分离, 获得—个具有较强凝集涪『生的蛋白峰A(图1). 1.o 0.8 . o.6 焉 0.4 0.2 O lo0 8o 60蝗 鲁 40 20量 0 5O10ol50 时间/min 图1红细胞凝集素的亲和层析曲线 Fig.1Affinitychromatographyoferythrohenmgglutinin 如表1所示,亲和层析洗脱液收率为48.4%, 高于目前使用甲状腺球蛋白作为亲和配基的报 道,比活力提高了l9.22倍. 表1凝集素的纯化 Table1PulrificationofPHA-E 2.2PHA.E的电泳检测 将粗提取液,(NH)SO沉淀后上清液,透析 后上清液,亲和层洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳, 结果如图2所示. 由图2可知,亲和层析纯化PHA—E,效果较好. 经红细胞膜亲和树脂层析后的蛋白峰为单一条带, 与相对分子质量标准比较,其相对分子质量为 3.2X10,与标准品一致. PHA.E试样进行PAGE电泳,结果如图3所示. 由图3可知,PHA.E试样在PAGE上表现为单带, 位置与标准品一致,表明获得了纯的红细胞膜凝集素. 二:..62x10450104?一4-一 一 3.50×104 一一 一2_501o4 .84x . 104 A一粗提取液;B--(NH4)2son沉淀后上清液;c一透析后上清液; D__亲和层析洗脱液;E一标准品;F一相对分子质量标准 图2SDS-PAGE电泳图 Fig.2SDS-PAGEelectrophoresisofPHA-E 第2期吴昌英等:用兔红细胞膜制备亲和树脂纯化红芸豆红细胞凝集素的方法53 AB A—PHA—E试样;B一标准品 图3PAGE电泳图 Fig.3PAGEelectr0ph0resisofPHA?E PHA—E试样的IEF电泳图见图4. pI 9.30 8.65 8.45 8.15 7_35 6.55 餮5.85 5.20 日酾4.55 瑚_嘲3.50 ABC A—PHA—E试样;B一标准品;c一等电点标准品 图4IEF电泳图 Fig.4IEFelectrophoresisofPHA-E 由图4可知,PHA—E试样在IEF上表现为2条 A B 带,主带位置为PI6.5,与标准品位置一致. 电泳结果证明,纯化得到了电泳纯的红细胞凝 集素PHA—E. 2.3凝血活力测定 纯化得到的PHA—E产品,在微量V型血凝板上 进行凝血活力测定.无凝集时血球沉于V形孔底 部,呈一小圆点;凝集时血球相互聚集形成一片网 络状,血球不下沉. 不同的凝集程度用数字表示如下:0(不凝集)表 示血球全部沉积于V型孔底部,呈边缘清晰的小圆 点;1(少许凝集)表示沉积范围比半凝集大,未遍及全 孔;2(半凝集)表示部分沉积中部,周围有浑浊带,约 占孔面积的50%;3(大部分凝集)表示少许沉积于孔 中心,沉积点边缘模糊;4(全凝集)表示血球相互聚集 形成一片网络,血球不下沉.凝集效价的判定以2作 为终点.实验中PHA—E起始质量浓度为 2000mL,倍比稀释得~1]200,0.75mL浓度范 围(1,10号孔)的试样,以生理盐水作为空白(11号 孔),PHA.E标准品为对照(起始质量浓度为 200mL,凝血活力为8g/mL),测得PHA—E的凝 血活力为4g/mL.实验结果如图5和表2所示. 2.4凝血影响因素 凝血的影响因素结果如表3所示.由表3可 知:葡萄糖,半乳糖不影响PHA—E凝血活性,EDTA 抑制其凝血,zn?促进凝血.其他二价金属离子对 PHA—E凝血活力未见明显影响. 图5试样(A)和PHA.E标准品(B)凝血活力测定图 Fig.5HemagglutinatingactivitiesofPHA-Eexamples(A)andstandard(B) 表2红细胞凝集结果示意图 Table2SketchmapofHemagglutinatio 试样号凝集程度 孔1孔11(空白) 0 0 A(试样)4 B(标准品)4 444444410 444444100 黎 54生物加工过程第8卷 表3EDTA,二价阳离子和单糖对PHA.E凝血活力的影响 Table3EffectsofEDTAanddivalentcationsand variousmonosaccharidesonhemagglutinating activityofPHA-E 3结论 红芸豆经浸泡,(NH)SO沉淀,透析,红细胞 膜亲和树脂层析,制得PHA—E试样.经PAGE考马 斯亮蓝R一250染色后得到单一带,SDS—PAGE考马 斯亮蓝染色显示亚基的相对分子质量为3.2×10, IEF电泳经考马斯亮蓝R-250染色后测得试样的等 电点为6.5,说明分离得到的红芸豆凝集素具有较 高的纯度且与标准品一致.PHA—E试样在血凝活 性检测中,约达到4txg/'mL. 本研究利用红细胞膜与红细胞凝集素的专一 结合特性,经过一次层析即可得到活性较高的高纯 度红细胞凝集素单体.活力回收率达48.4%. 红细胞来源广泛,制备简单.采用红细胞作为亲 和纯化红细胞凝集素的配基,不仅成本低廉,操作简 单,而且产品活力和纯度较高,有较好的应用前景. 参考文献: [1]丁邦裕,戴美红,余健.江苏菜豆同工凝集素的分离纯化及性 质研究[J].生物化学杂志,1991,7(1):25-27. 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