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滋阴清热方对mrl-lpr狼疮鼠皮质醇及糖皮质激素受体mrna表达的影响.doc

滋阴清热方对mrl-lpr狼疮鼠皮质醇及糖皮质激素受体mrna…

王斯夫
2017-11-15 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《滋阴清热方对mrl-lpr狼疮鼠皮质醇及糖皮质激素受体mrna表达的影响doc》,可适用于自然科学领域

滋阴清热方对mrllpr狼疮鼠皮质醇及糖皮质激素受体mrna表达的影响滋阴清热方对MRLlpr狼疮鼠皮质醇及糖皮质激素受体mRNA表达的影响【摘要】目的观察MRLlpr狼疮鼠皮质醇及糖皮质激素受体(GR)mRNA表达的变化及滋阴清热方对其水平的影响,探讨中药减轻激素不良反应的机理。方法只MRLlpr狼疮模型鼠随机分为组,即模型组、中药组、西药组、中西药组。分别给予生理盐水、滋阴清热方、强的松悬液、滋阴清热复方强的松悬液灌胃,均每日次,每次mL,连续用药周。另选用昆明小鼠只作为正常对照组。应用放射免疫法测定MRLlpr狼疮鼠糖皮质醇水平,反转录酶聚合酶链反应法(RTPCR)检测GRmRNA,观察各组皮质醇、GRmRNA表达的变化。结果模型组血清皮质醇水平与正常组比较,P,,而GRαmRNA表达明显低于正常组(P,)。西药组GRαmRNA、GRβmRNA下调水平高于中药组和中西药组(P,或P,)。结论滋阴清热方可上调MRLlpr狼疮鼠GRmRNA表达水平,从而增强糖皮质激素的临床疗效,减少激素不良反应。【关键词】系统性红斑狼疮,滋阴清热方,皮质醇,糖皮质激素受体mRNA,动物模型Abstract:ObjectiveToobservethechangeofglucocxnticoid(GC)andthemessengerRNAexpressionofitsreceptor(GRmRNA)inMRLlprmicewiththeinterventionofnourishingyinandclearingheatdecoctionMethodsFortyMRLlprmicewererandomlydividedintofourgroups:modelcontrolgroup,TCMgroup,westmedicinegroup,combinedtreatmentoftraditionalchinesemedicineandwestmedicinegroup,miceineachgroupThegroupwasintragastricallyadministratednormalsodium,nourishingyinandclearingheatdecoction,prednisonesuspension,nourishingyinandclearingheatdecoctionplusprednisonesuspension,mLeverytime,oncedailyforweeksrespectivelyMeanwhile,Kungmingmicewereselectedasnormalgroup,administratednormalsodium,likethemodelgroupTheexpressionofglucocxnticoidreceptoralphaandbeta(GRαmRNA,GRβmRNA)weredetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)ResultsComparedwithnormal,theexpressionofGRmRNAwasincreasedinmodelgroups,butthelevelofGCwasnotdifferentComparedwithmodelgroup,GRαmRNAandGRβmRNAofMRLlprmicewereimprovedinalltreatmentgroups,especiallyincombinedtreatmentoftraditionalChinesemedicineandwesternmedicinegroupConclusionNourishingyinandclearingheatdecoctionhaseffectofupregulatingtheexpressionofGRmRNAinMRLlprmice,soastoenhancetheeffectofglucocorticoidandreduceitssideeffectsKeywords:SLE,Nourishingyinandclearingheatdecoction,CORT,GRmRNA,animalmodel系统性红斑狼疮(SLE)是一种淋巴细胞活化失调,自身抗体产生过多和多器官、多系统受累为特点的自身免疫性疾病。而糖皮质激素(GC)是治疗自身免疫性疾病的首选药物之一,其作用的发挥有赖于与其受体的结合。糖皮质激素受体(GR)是GC发挥生理及药理作用的关键环节,在GR的整体水平上,GRmRNA表达水平的高低和GR密度的多少与GC的敏感性不同有关。本课题组前期临床研究发现,中医滋阴清热法结合激素治疗SLE,不仅能提高临床疗效,而且能够上调SLE患者GRmRNA水平。现观察MRLlpr狼疮鼠皮质醇、GRmRNA表达的变化及滋阴清热方对其水平的影响,为中医药治疗SLE提供实验依据。实验材料动物只MRLlpr狼疮样小鼠,雌性,周龄,体重(〒)g,中国科学院上海实验动物中心从美国jacket实验室引种培育,均在广东省中医院动物实验中心SPF级动物房中隔离饲养个月。药物滋阴清热方,本院制剂室按既定工艺完成并提供。分别配制成浓度为(相当于山茱萸mg,生地黄mg,茯苓mg,泽泻mg,牡丹皮mg,青蒿mg,甘草mg)、mgmL(上述药材加倍)两种不同浓度的水煎液。强的松悬液,由强的松片加生理盐水按含药量、mgmL配置而成,强的松片由仙居制药生产(批号)。氯化钠溶液,杭州民生药厂生产(批号)。主要试剂皮质醇(CORT)放射免疫分析药盒(北京北方生物技术研究所,批号),RNA提取试剂盒(安徽优晶生物公司),反转录PCR试剂盒(TOYOB公司)。主要仪器美国探头全自动测量γ计数仪,紫外分光光度仪(美国BZOKADuvv型),PCR扩增仪(美国PE型)。实验方法分组与给药SPF级封闭状态下普通饲料喂养周后,按体重将只MRLlpr小鼠随机分成组,每组只。模型组灌胃生理盐水,mLd,中药组灌胃浓度mgmL滋阴清热方mLd,西药组灌胃mgmL强的松混悬液mLd,中西药组予mgmL强的松混悬液(mLd)mgmL滋阴清热方(mLd)灌胃。另选用只周龄的昆明小鼠作正常对照,生理盐水灌胃,mLd。于实验起点和终点称体重。连续饲养用药周后,于次日上午时摘眼球取血,断颈处死,分离血清待测。血清皮质醇测定摘眼球取血mL,、rmin离心min,分离血清,用放射免疫法测定CORT含量。糖皮质激素受体mRNA检测取各组小鼠新鲜肝组织mg,按优晶公司总RNA提取试剂盒说明书提取各组小鼠肝组织总RNA。分光光度计测定AA比值以判定细胞总RNA的纯度,并取适量RNA行琼脂糖凝胶电泳,以验证所抽提的细胞总RNA的质量。检索NCBIGeneBank数据库设计引物,以PCR技术对转录产物进行扩增,以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照校准基因。GRα、GRβ公用上游引物’’:GTCATTCCACCAATTCCTGTT,PCR产物片段为bp,GRα下游引物’’:GCGTCTTCACCCTCAGTGGC,PCR产物片段为bp,GRβ下游引物’’:GCCATTTCTGTTCATGGCG,PCR产物片段为bp,内参照GAPDH上游引物’’:GGGCATCAATGGATTTGG,下游引物’’:GGAGCCGCCTCTATGGACAG,PCR产物片段为bp。引物均由上海博亚公司合成。取各组提取的mRNAμg按RTPCR试剂盒操作说明进行RTPCR。程序设定:min,预变性min,变性min,延伸s,个循环,最后保温min,RTPCR结束后,琼脂糖凝胶(含mgL溴化乙啶)电泳检查。统计分析及图像处理电泳后用GelDoc凝胶图像分析系统分析结果,以及各组小鼠血清CORT值均采用SPSS程序进行方差齐性检验,继而进行方差分析和LSD检验。结果小鼠一般情况观察干预治疗周后动物死亡情况:模型组只,中药组只,西药组只,中西药组只。正常组无死亡。MRLpr模型鼠外观上呈现被毛疏松不齐、活动迟缓、多处淋巴结肿大、腹围膨大等。其余各组外观上明显好于模型组,尤其中药组及中西药组小鼠被毛相对更光滑整齐,活动亦较敏捷。各组小鼠血清皮质醇含量变化(见表)表各组小鼠血清CORT含量变化比较(略)各组小鼠糖皮质激素受体α、βmRNA表达比较(见表)表各组小鼠GRαmRNA、GRβmRNA表达比较(略)注:与正常组比较,*P,,与西药组比较,P,讨论目前,SLE的西医治疗仍以药物治疗为主,其中以GC为首选。GC能够有效控制或延缓SLE造成的多脏器损害,降低病死率,但同时不良反应也很明显。GC作用的发挥主要是由GR介导的,血清中的GC与细胞内的GR之间存在互调关系,同时靶细胞对GC的反应性与GR含量与功能有关。近年研究表明,GC对GR产生的负调节作用部分作用于mRNA水平上,GC对GRαmRNA、GRβmRNA的表达均具有明显的降调作用,且具有剂量依赖性和时间依赖性特点。因此,在mRNA水平上对GR进行研究,探讨中医药治疗SLE更有意义。有关GR基因表达的调控比较复杂,可发生在转录、mRNA的降解、mRNA的翻译、受体蛋白质的降解等几个水平上。SLE患者GC水平正常,说明SLE患者体内GC的产生和代谢可能正常,而GRmRNA表达水平降低,说明SLE患者GR质量数量存在异常。SLE患者GCGR系统的这种不平衡状态,可能在SLE的发生、发展过程中起一定的作用。同时,在临床上发现,不同患者对GC的治疗反应不同,激素的反应也不同,从而直接影响到用药的效果。而产生这种差别的原因与GR的水平高低有关,GC效应的强弱在很大程度上决定于细胞核内GRmRNA水平的高低。MRLlpr狼疮模型组小鼠血清CORT水平与正常组比较,无明显差异,肝组织GRαmRNA水平明显降低,而中药组、中西药组小鼠肝组织GRαmRNA水平较模型组及西药组明显升高,提示滋阴清热方能够提高MRLlpr小鼠肝组织GRαmRNA水平。因此推测,滋阴清热方通过抑制GC对GRαmRNA的降调作用而增加GR的数量及活性,从而增强GC效应,减少激素的用量和减轻激素不良反应。因此,我们可以考虑在临床应用激素的同时应用滋阴清热方,从而适当减少激素的用量,直接减少大量激素应用产生的不良反应。但是,GR的调控是一个极其复杂的过程,滋阴清热方或其中某种有效成分究竟通过何种途径在分子受体水平上调控GR的数目和活性,以及通过何种机制在基因水平上调控GR基因表达,尚需进一步研究。Bamberger等首次提出GRβ是一种内源性GC效应的拮抗因子的观点。GRβ可能通过与GRα竞争性占位GRE而拮抗GC效应的产生。本研究中,我们发现GC对GRβmRNA也有降调作用,中药在升调GRαmRNA水平的同时,不能降低GRβmRNA水平,因此,中医药对GC的增效减负作用尚需要进一步研究。【参考文献】金培志,张剑勇,李林滋阴狼疮胶囊对系统性红斑狼疮患者皮质醇和GRαmRNA的影响J上海中医药大学学报,,():,HimojoM,HiroiN,YakushijiF,etalDifferencesindownregulationofglucocorticoidreceptormRNAbycortisol,prednisoloneanddexamethasoneinHeLacellsJEndocrJ,,():,刘宇健,宋亮年,卢建糖皮质激素对糖皮质激素受体α和βmRNA表达的调节作用J中国病理生理杂志,,():,钟连生,马道铭,陈志强糖皮质激素受体研究进展J国外医学〃皮肤性病学分册,,():,TanakaH,AkamaH,IchikawaY,etalGlucocorticoidreceptorinpatientswithlupusnephritis:relationshipbetweenreceptorlevelsinmononuclearleukocytesandeffectofglucocorticoidtherapyJRheumatol,,():,许泼实,黑洁剥,孙长义小柴胡汤中具有糖皮质激素样作用单剂的实验研究J中国煤炭工业医学杂志,,():,BambergerCM,BambergerAM,deCastroM,et,alGlucocorticoidreceptorbeta,apotentialendogenousinhibitorofglucocorticoidactioninhumansJClinInvest,,():,

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