荧光定量PCR仪操作规程
1．开机程序
（1） 打开电脑，进入桌面。
（2）打开PCR仪器的电源开关（注：该仪器有两个电源开关，一个控制PCR仪，一个控制光源系统）。
（3）双击桌面上的软件图标，点击“yes”,进入软件的主菜单。
(4)或打开开关，视窗上显示“SELF TEST”，显示10秒中后，显示RUN-ENTER菜单：“RUN ENTER PROGRAM ”准备执行程序。
2．关机程序
(1) 保存数据，退出软件的主菜单。
(2) 关掉电脑，关闭PCR仪器的电源开关。
3.程序文件的设置及打开
(1)实验程序已预先设定
点击软件左方主目录中的“Library”，进入该界面后。选择“View Protocol”页面，根据路径，找到预存的程序文件。
放入样本管，关紧盖子。运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》，用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则屏幕显示：“-ENABLE DISABLE HEATED LID” 按《Proceed》选择ENABLE，则开始执行程序。
(2)创建新的程序文件
点击软件左方主目录中的“Workshop”，进入该界面。选择“Edit Protocol”页面，输入相应的温度、时间、重复的循环数（Repeats），增加或删除
步骤
新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤
（Cycle和Step），在“Select data collection step（s）”中选择需要进行荧光收集的步骤。完成后，在“Protocol Filename”中输入程序的文件名，点击“Save this protocol”。
如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM，按《Proceed》，屏幕显示“ -NEW LIST EDIT DELET”，按《Proceed》，1）选择NEW，命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认。输入程序步骤：名字输入后，显示“ STEP1 TEMP GOTO OPITON END”，按《Proceed》则可以输入温度（0～100℃），按《Proceed》确认后，则可以输入孵育时间，用《Select》键移动光标，输入数字，完成后按《Proceed》确认，跳到下一步，输入方式同上。选择GOTO，输入循环步骤时链接到第几步（循环数最多可达9999次）（为实际循环数-1)。选择option，显示“STEP EXTENDI NCREMENT SLOPE ”再选择increment，按《Proceed》确认，输入初始的温度，确认后输入时间，按《Proceed》确认，然后输入每个循环增加或减少的温度，增加用正值，减少用负值（-0.1℃～6℃），按《Proceed》确认。选择extend，按《Proceed》确认，输入每个循环增加或减少的时间（-60～60秒），按《Proceed》确认。
选择slop（指温度上升或下降的速率），输入温度的改变值（-0.1～1.5℃）按《Proceed》确认，然后输入加热或致冷的速度，按《Proceed》确认。选择End，输入结束步骤。
输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。
4.仪器操作程序
(1)编辑样本
将装有反应液的PCR反应管放入PCR仪，
记录
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样本摆放顺序。点击进入软件左方主目录的“Workshop”界面，选择“Edit Plate Setup”页面。点击“Samples：Whole Plate loading”，根据样本摆放的顺序和样本属性，选择相应的图标（Unknown和Standard），在plate上相应位置作标识，是标准品（Standard）的，在屏幕右下方的“Standard Quantity”中输入相应浓度。点击“Select and load fluorophores”，在“1. or deselect a fluorophore”中选择荧光标记，在“2.Assign a color”中选择该标记相对应的颜色，然后在plate上对 1.3所选择的孔位进行荧光标记。完成后，在“Plate Setup Filename：”中输入样本文件的文件名，点击“Save this plate setup”。
(2)运行
编辑样本完成后，在该页面下点击“Run with selected protocol”。转入“Run Prep”页面，确认“Select run purpose”所选的是“PCR Quantification Melt Curve”和“Select well factor source”所选的是“Experimental Plate”，核对一下“Selected Protocol”和“Selected Plate”的文件名是否正确。然后在“Sample volume”中输入反应体系，点击“Begin Run”，在弹出的对话框中输入要保存的数据文件名称，点击保存。
5.数据分析
点击软件左方主目录中的“Library”，进入“View Post-Run Data”页面,
找到并选中要分析的数据文件，点击“Analyze Data”，转入“Data Analysis”界面。根据“baseline”和“Threshold”分析原则，进行数据分析，观察PCR Standard Curve”。
6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。
**可以用《Cancel》键删除输错的值，输入新的值后按《Proceed》确认。**对于未输完的程序，要先输入END，按《Proceed》将程序储存后才能删
除。
**删除已经储存的程序：从RUN-ENTER菜单中选择RUN－PROGRAM
《Proceed》，显示主菜单，选择DELET，用《Select》选择删除。查看程序的步骤：在主菜单上选择LIST，按《Proceed》，用《Select》将选择名称，再按《Proceed》，显示程序的第一步，用《Select》键向前、向后翻页查看，此时不能改变程序的值。编辑已有的程序：
如何设置一个PCR体系：一般分为8步：
预变性：可用94～95℃，2～10min，一般用5min。
变性：一般用94℃，30s～2min，一般45s～1min。
退火：温度自定，30s～2min。
延伸：70～75℃，一般72℃，对于＜2kb，＜1min；＞2kb，每增加1kb加1min。
循环数：一般25～35个循环。
最终延伸：72℃，5～15min。
保存：10℃，时间设为0。
浙公网安备 33021202002483