凝胶层析法测定蛋白质分子量

凝胶层析法测定蛋白质的分子质量 【实验原理】 凝胶层析法(即凝胶过滤法,gel filtration)是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法,又称为分子筛层析法(molecular sieve chromatography),排阻层析法(exclusion chromatography)。凝胶本身是一种分子筛,可以把分子按不同大小进行分离,好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡,使充分吸液膨胀,然后装入层析柱中,加入欲分离的混合物,再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中,大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进入凝胶内部,流速缓慢,以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质,不论是天然凝胶还是人工合成凝胶,它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶(agarose gel,商品名Sepharose);人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio-gel-P)和葡聚糖(dextran)凝胶(商品名称为Sephadex)的各种交联凝胶,它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶,不溶于水。 这种聚合物的立体网状结构,其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后,交联度高的,孔隙小,只有相应的小分子可以通过,适于分离小分子物质。相反,交联度低的孔隙大,适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同M r的物质。 为了说明凝胶层析的原理,将凝胶装柱后,柱床体积称为“总体积”,以V t(total volume) 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示。实际上V t是由V O,V t与V g三部分组成,: V t=V O+V t+V g V o称为“孔隙体积”或“外体积”(outer volume)又称“外水体积”,即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积,相当于一般层析法中柱内流动相的体积;V i为内体积(inner volume),又称“内水体积”,即凝胶颗粒内部所含水相的体积,相当于一般层析法中的固定相的体积,它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得;V g为凝胶本身的体积,因此 V t-V o.等于V i+V g。 洗脱体积(V e,elution, vilume)与V o及V i之间的关系可用下式表示: V e=V o+K d V i 1 式中V e为洗脱体积,自加入样品时算起,至组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积; K d为样品组分在二相间分配系数,也可以说K d是M r不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关,而与柱的长短粗细无关,也就是说它对每一物质为常数,与柱的物理条件无关。K d可通过实验求得,上式要改写成: 上式中V e为实际测得的洗脱体积;V o可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(最好有颜色以便观察,如血红蛋白,印度黑墨水,M r约200万的蓝色葡聚糖-2000等)通过实际测量求出;V i可由g·W R求得(g为干凝胶重,单位为g;W R为凝胶的“吸水量”,以ml/g表示)。因此,对一层析柱凝胶床来说,只要通过实验得知某一物质的洗脱体积V e,就可算出它的K d值。 在一般情况下,凝胶对组分没有吸附作用时,当流动相流过V i体积后,所有的组分都应该被洗出来,这一点为凝胶层析法的特点,与一般层析方法不同。 V e与分子量的关系:对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,样品流过凝胶柱时,按M r大小顺序流出,M r大的走在前面。V e与M r的关系可用下式表示: Ve=K1-K2logM r K1与K2为常数,M r为相对分子质量,V e也可用Ve—Vo(分离体积),Ve/Vo(相对保留体积),Ve/V1(简化的洗脱体积,它受柱的填充情况的较小)或K av代替,与分子量的关系同上式,只是常数不同。通常多以K av对M r的对数作图得一曲线,称为“选择曲线”,曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内,曲线愈陡,则分级愈好,而工作范围愈窄。凝佼层析主要决定于溶质分子的大小,每一类型的化合物,如球蛋白类,右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线,可用以测定未知物的M r,测定时以使用曲线的直线部分为宜。 用凝胶层析法测定蛋白质M r,方法简单,技术易掌握,样品用量少,而且有时不需要纯物质,用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中,为了测定某一酶组分的分子量,只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分,然后确定其洗脱体积,即可人MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1713894164623_0曲线中查出其M r。凝胶层析法测定M r也有一定的局限性。在pH6-8的范围内,线性关系比较好,但在极端pH时,一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时,测得M r比真实的要大,铁蛋白则与此相反,测得的M r比真实的要小。有一些酶底物是糖,如淀粉酶,溶菌酶等会与葡聚糖凝胶形成络合物,这种络合物与酶-底物络合物相似,因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。有凝胶层析法所测M r的结果,要和 其他方法的测定相对照,由此才可作出较可靠的结论。 凝胶层析技术操作方便,设备简单,周期短,重复性能好,而且条件温和,一般不引起生物活性物质的变化,目前已得到相当广泛的应用,例如可用于脱盐,浓缩高分子物质溶液,生化物质的分离提纯,去除热源物质以及用于测定高分子物质的M r。下面实验是利用葡聚糖凝胶层析法测定蛋白质的M r。 【试剂和器材】 一(试剂) 1、标准蛋白质: 牛血清蛋白(M r67000)15mg,鸡卵清蛋白(M r43000)15mg,胰凝乳蛋白酶 原A (M r25000)5mg,细胞色素C(M r12400)2.5mg,二硝基苯丙氨酸(M r255) 0.3mg,蓝色葡聚糖(M r2000000)3mg,混合后溶解于2ml 50mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液中。 2、50mmol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液(pH7.2) 3、Sephadex G-100 4. 未知蛋白质样品 (二)、器材 1、层析柱:1.6cm×80cm 2、核酸蛋白质检测仪(或紫外分光光度计) 3、部分收集器 4、恒流泵 5、小型台式 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 仪 【实验步骤】 测定蛋白质的M r根据需要可选用Sephadex G-75,G-100或G-150型凝胶,凝胶颗粒一般在40μm-120μm。柱管选用直径1.0cm-1.6cm,柱长80cm-100cm。本实验凝胶用SephadexG-100,层析柱用1.6cm×80cm,凝胶层析的操作方法如上所述。 1、测定V o和V i:将0.5mL蓝色葡聚糖-2000和硫酸铵混合液(2mg/mL)上柱,用50mmol/l KH2PO4-K2HPO4缓冲液溶液洗脱,分别测出V e.蓝色葡聚糖的V e即为该柱的V o,硫酸铵洗脱体积V e减V o 。即为柱的V io蓝色葡聚糖的洗脱峰可根据颜色判断,硫酸铵的洗脱峰用乙酸钡生成白色沉淀判断。 2、标准曲线的制定: 标准蛋白质混合液: 分别称取:15mg牛血清蛋白(M r 67000),15mg鸡卵清蛋白(M r43000),5mg胰凝乳蛋白酶原A(M r25000),2.5mg细胞色素C(M r12400),0.3mg二硝基苯丙氨酸,3mg 蓝色葡聚糖,共同溶于2ml 50mmol/l KH2PO4-K2HPO4缓冲液溶液中。 上柱和洗脱:将2mL标准蛋白质混合液上柱,然后用50mmol/l KH2PO4-K2HPO4缓冲液溶液洗脱。流速3Ml/10min,3mL/管,紫外检测仪280nm处检测,记录仪记录洗脱曲线。或用部分收集器收集,收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管A值,以管号(或洗脱体积)为横坐标,A值为纵坐标绘出洗脱曲线。 根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积(V e)。然后以蛋白质M r的对数(1g M r)为横坐标,V e为纵坐标,作出标准曲线。为了结果可靠,应以同样条件重复1-2次,取V e的平均值作图。 同时根据已测出的V O和V i以及测量柱的直径和凝胶柱床高度,计算出的V i求出K av,也可以K av.为横坐标,1g M r,为纵坐标作出标准曲线。 3、未知样品M r的测定:完全按照标准曲线的条件操作,根据此紫外检测的洗脱峰位置,量出洗脱体积。重复测定1-2次,取其平均值,由标准曲线可查得样品的M r。 【要点提示】 一、一般操作方法 1、凝胶的选择和处理:葡聚糖凝胶是以干粉保存的,因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要用作洗脱剂的相同液体中,充分溶胀,然后才能使用。根据层析柱的体积和所选用的凝胶,膨胀后床体积,计算所需凝胶干粉的质量,将称好的干粉倾入过量的洗脱液中,一般多为水,盐溶液或缓冲液,放置在室温,使之充分吸水溶胀。注意不要过分搅拌,以防颗粒破碎。浸泡时间根据凝胶交联度不同而异为了缩短溶胀时间,可在沸水浴上加热至将近100℃,这样可大大缩短溶胀时间至几小时,而且还可杀死细菌和霉菌,并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。 凝胶颗粒最好大小比较均匀,这样流速稳定,结果较好。如果颗粒大小不匀,可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗倾去。装柱前最好将处理好的凝胶置真空干燥器中抽真空,以除尽凝胶中的空气。 2、装柱:层析柱必须粗细均匀,柱管大小可根据实际需要选择。一般柱直径(内 径)为1~1.6 cm,如果样品量比较多,最好用直径为2cm-3cm柱。但要注意直径太小时会发生“管壁效应”,即在柱管中心部分组分移动较慢,而在管壁周围移动较快,因而影响分离效果。一般说来,柱越长,分离效果愈好,但柱过长,实验时间长而且样品稀释度大,易扩散,反而分离效果不好。一般用做脱盐时,柱高度50cm比较合适。在进行分级分离时,100cm高度就够了。 装柱方法与一般柱层析法相似,柱管可用一般柱层析管,底部目前常用多孔的聚乙烯片做底板。如果烧结玻璃砂板做底,尽量用细孔的(3号),粗孔的则要在其上铺一层滤纸或尼龙滤布。在装柱前先将凝胶上面多余的溶剂倾出,然后将浓浆的凝胶一次倾入柱中,使之自然沉降,要注意颗粒间没有夹杂气泡,最好不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。 凝胶沉集后,将溶剂放出,并且要通过2-3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定,然后在凝胶表现上放一片滤纸或尼龙滤布,以防将来在加样时凝胶被冲起。 新装好的柱要检验其均一性,可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000(又称蓝色右旋糖酐,商品名为Blue dextran-2000),红色葡聚糖或细胞色素c等配成2mg/mL 的溶液过柱,看色带是否均匀下降。或将柱管向光照方向用眼睛观察,看是否均匀,有否“纹路”或气泡,若层析柱床不均一,必须重新装柱。 要注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面,否则水分挥发,凝胶变干,分离效果变坏,并有可能混入气泡,影响液体在柱内的流动。 3、加样:被分离样品溶液一般以浓度大些为好,但因用凝胶分离的物质多为M r 较大物质,浓度大时,溶液的粘度也随之变大,而粘度过大就会影响分离效果,所以要照顾到浓度与粘度两方面。分析用量一般100mL床体积为1-2mL(1%-2%),制备用量一般100mL床体积为20-30mL左右。 加样的方法与一般柱层析法相同,将柱中多余的液体放出后,将样品溶液小心加到凝胶柱上,打开管夹,使样品溶液流入柱内。然后加入溶剂或盐溶液洗脱。 4、洗脱:洗脱用的液体应与浸泡膨胀凝胶所用的液体相同,否则由于更换溶剂,凝胶体积会发生变化而影响分离效果。洗脱用的液体有水(多用于分离不带电荷的中性物持)及电解持溶液(用于分离基团的样品),如酸、碱、盐的溶液及缓冲液等。对于吸附较强的组分,也有使有水与有机溶剂的混合液,如水-甲醇,水-乙醇,水-丙酮等为洗脱剂的,可以减低吸附,将组分洗下。 流速与洗脱液加在柱上的压力(因液面差造成)有关。它与一般离子交换树脂不同, 加压超过一个极限值,不仅不能增加速度,反而使流速急剧下降。流速对交联度不同大小的凝胶是不同的,对交联度大的凝胶(G-10至G-50型),流速与柱的压力差成正比,与柱长成反比,与柱的直径无关。对交联度小的凝胶(G-75至G-200型),流速与柱的直径有关,并在一定的适宜操作压差下有最大的流速值。 流速亦受颗粒大小影响,颗粒大时流速较大,但流速大时洗脱峰形常较宽,颗粒小时流速较慢,分离情况较好。在操作时应根据实际需要,在不影响分离效果的情况下,尽可能使流速不致太慢,以免时间过长。 5、柱的重新填装:由于在洗脱过程中,所有组分一般全可自柱上洗下,所以装好一次柱管之后,可以反复使用,无须特殊的“再生”处理。但由于在使用过程中,颗粒可能逐渐沉积压紧,因此在使用一段时间后,流速可能逐渐减低,使一次分析时间拖长很久,这时需要将凝胶倒出,重新填装,或者用反冲方法,使凝胶松动冲起,再行沉降。有时流速改变是由于柱顶有灰尘集聚,则需将表面层除去。 由于葡聚糖凝胶为糖类化合物,并且一定要在液相中操作,所以有必要注意防止发霉与生长细菌。一般可用0.02%的叠氮钠(NaN3)溶液,它极易溶于水,不与蛋白质和糖反应,也不改变它们的层析效果。也可用0.002%的洗必泰(hivitane)溶液。在弱酸性溶液中可用0.05%(或0.01%-0.02%)三氯丁醇溶液,但它在强碱性溶液或加热到60℃以上时就要分解。在弱碱性溶液中了可用0.01%乙酸汞溶液防腐消毒。一般不用氯仿、丁醇、甲苯等为防腐剂,因为它们能引起凝胶颗粒的收缩,同时还能进入仪器的塑料部件,使塑料变软,造成不良后果。 附:0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.7~8.0,K+/Na+) pH 0.2mol/L NaH2PO4(ml) 0.2mol/L Na2HPO4(ml) 5.7 93.5 6.5 5.8 92.0 8.0 5.9 90.0 10.0 6.0 8 7.7 12.3 6.1 85.0 15.0 6.2 81.5 18.5 6.3 7 7.5 22.5 6.4 73.5 26.5 6.5 68.5 31.5 6.6 62.5 3 7.5 6.7 56.5 43.5 6.8 51.0 49.0 6.9 45.0 55.0 7.0 39.0 61.0 7.1 33.0 67.0 7.2 28.0 72.0 7.3 23.0 67.0 7.4 19.0 81.0 7.5 16.0 84.0 7.6 13.0 87.0 7.7 10.5 89.5 7.8 8.5 91.5 7.9 7.0 93.0 8.0 5.3 94.7 若pH偏高或偏低,可通过改变二者的比例来加以调整即可。