成纤维细胞同步化研究

成纤维细胞同步化研究 不同浓度秋水仙素和nocodazole对绒山羊成纤 维细胞周期同步化的影响 杨惠茹，肖红梅，蔡婷，俎红丽，于新蕾，刘志红，李金泉，王志新 ( 内蒙古农业大学 动物科学学院动物遗传育种与繁殖重点实验室，呼和浩特 010018 ) 摘要:本文旨在探索更加优化的条件，使绒山羊成纤维细胞经处理后更多的处于有丝分裂G2/M 期。本研究分别采用秋水仙素和nocodazole (诺考达唑)试剂对绒山羊成纤维细胞进行周期同步化处理，用流式细胞仪检测G2/M 期的细胞数量进行比对，观测最佳作用浓度。结果表明，秋水仙素的使用浓度不宜过大;其次，添加秋水仙素时间的不同也会对试验结果产生明显的影响。另外在相同条件下，经nocodazole处理的绒山羊成纤维细胞周期同步化效果比秋水仙素好，最优的处理条件是300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h，所得G2/M期的细胞所占比例为15.10%。结果提示对于绒山羊的成纤维细胞来说，细胞周期同步化处理时，选择nocodazole更好一些。 关键词:绒山羊;成纤维细胞;秋水仙素;nocodazole(诺考达唑);细胞周期同步化;流式细胞仪 Dolezel等(2011) 报道随着测序技术的发展，使用流式细胞仪分离单条染色体，将拓展测序技术应用的领域，对于山羊这种大基因组动物更有广泛的应用价值。流式细胞术可以分选出指定的染色体，能快速精确地检测染色体数目和结构的畸变，以及非整倍体和染色体缺失。目前已在l7 1993)利用FCM对碗豆的流式个植物物种中利用流式细胞术对染色体进行分析与分选。Macas等( 核型进行分拣，结合PCR技术对其DNA进行物理定位， 成功实现了USP基因、碗豆球蛋白基因和假基因在相应染色体区域上的定位。施家琦等 (1998) 在人类的染色体分选研究中，通过采用流式细胞技术分离染色体实现对人二倍体成纤维细胞的单分散染色体核型的分析及分选。最近的研究中，Yang等(2011) 通过流式技术分离出单个染色体已经完成了基因组的测序工作。翟中和等(1992) 采用流式分离单条染色体工作的核心在于富集足量同步化的中期染色体的细胞核型，因此细胞同期化的处理是研究中最基础最为重要的一步。细胞周期时间长短的主要差别在G1期，而S期、G2期和M期的总时长相对恒定，尤其是M期持续的时间更为恒定，常常仅持续半小时左右。通过添加有丝分裂抑制剂，来阻滞细胞的有丝分裂使其停滞在G2/M 期，人工调控增加G2/M期的细胞数量，为单条染色体分选做前期准备。目前，秋水仙素是一种最为常用的有丝分裂抑制剂，起作用机理在于抑制中期纺锤体的形成。nocodazole是一种类似于秋水仙素的细胞微管抑制剂,也可阻止微管蛋白聚合和纺锤体形成,使细胞同步于M期,从而使大部分细胞的发育停滞在G2/M期和M期，与秋水仙素试剂相比毒性较低。Tanaka等(1995)研究表明采用nocodazole处理法对大鼠进行同期化处理后，M期细胞的数量显著增加。因此，本研究将采用这两种试剂对成纤维细胞同期化的最优化条件做探索。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1材料 1.1.1 试剂耗材和动物 秋水仙素、nocodazole、胎牛血清(Hyclone)、，0.25%胰酶(Gibco)、DMEM/F12培养基(Hyclone)、无水乙醇(国产)、DPBS(Hyclone)、青链霉素(Gibco)、PI(碘化丙啶)、15 mL离心管(corning)、250 mL离心管(corning)、细胞培养瓶(corning)25 cm、塑料吸管。 本研究选用绒山羊公羊耳源组织，来自于内蒙古鄂尔多斯农场。 1.1.2 主要仪器设备 流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )、CO恒 温 培 养 箱 ( Galaxy A，RXBiotech) 、2 超净工作台 ( ZHICHENG，XHJH-1112B)、倒置相差显微镜( NIKON BIOPHOT) 、离心机( Eppendorf Centrifuge 5415R) , 超纯水仪(Milli一Q) 1.2 方法 1.2.1 绒山羊成纤维细胞的培养 2选取一只健康的成年绒山羊公羊，用剪毛剪将公羊耳尖部的毛除净快速剪下耳尖约 1 cm组织 2的培养箱中贴块，经过一系列处理后，将组织块均匀分布于25 cm的培养瓶中，置于37 ? ,5%CO2壁培养，待细胞慢慢从组织中爬出且基本长满80%培养瓶后，进行传代培养。 1.2.2 同步化处理 正常细胞作为对照组，用含0.07 ug/mL的秋水仙素对指数生长期的成纤维细胞作用4 h,12 h,16 h,18 h,24 h，用含0.15 ug/mL的秋水仙素作用18 h后收集细胞，分别观察其结果，用含100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞18 h后，观察其结果，用含100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞24 h后，观察其结果，最后上流式细胞仪检测。 1.2.3 流式细胞仪分析 用含0.02% EDTA，0.25%的胰酶消化经同步化处理后的细胞，收集于15 mL离心管中，用PBS洗涤2遍(1000rpm，5min)弃掉上清，先加入少量PBS混匀细胞，再加入95%乙醇或无水乙醇(-20 ?预冷)到待测细胞悬液中，使其终浓度为70%乙醇，边加边在振荡器上震荡混匀(一滴一滴缓慢加 ?冰箱过夜(细胞固定后最多可放15天)，检测时再用PBS洗涤后，加PI染入)，混匀后直接放4 色，用流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测G0、G1、S、G2、M各期的细胞。 2. 结果 2.1正常细胞G2/M期比例 正常细胞对照组，第五代成纤维细胞经过72小时的培养，基本已经长满了整个培养瓶，汇合程度达90%以上，生长旺盛，形态正常结构完整呈长梭形(图 1 )。收集该细胞使用流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测，结果表明G2/M期所占比例为0.18%，细胞基本处于非生长期(图 2 )。 图 1 第五代成纤维细胞1 00倍镜下观察结果 图 2 正常细胞G2/M期所占比例 (备注:Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例) 2.2秋水仙碱不同作用时间下G2/M期所占比例 采用0.07 ug/mL秋水仙素对指数生长期时成纤维细胞作用4、12、16、18和24 h后收集细胞，使用流式细胞仪检测，结果表明G2/M期所占比例分别为0.64%、4.63%、7.07%、10.88%和0.05%。而0.07 ug/mL秋水仙素处理18 h，收集检测G2/M期所占比例最高为10.88%。(图 3 ) 图 3 秋水仙碱处理下G2/M期所占比例 (备注:Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例) 2.3不同浓度nocodazole和不同处理时间下 G2/M期所占比例 采用100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别作用于指数生长期的成纤维细胞，18 h后收集，流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )检测，结果表明G2/M期所占比例分别为7.43%、14.34%、11.82%，而100 ng/mL、300 ng/mL、1 ug/mL的nocodazole分别处理成纤维细胞24 h后，G2/M期所占比例分别为9.23%、15.10%、12.10%。而300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞18 h，收集检测G2/M期所占比例最高为14.34%。(图 4 )，300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h，收集检测G2/M期所占比例最高为15.10%。(图 5 ) 图 4 300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞18 h G2/M期所占比例 (备注:Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例) 图 5 300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h G2/M期所占比例 (备注:Dip G1为细胞G1期所占比例，Dip G2为细胞G2期所占比例，Dip S为细胞S期所占比例) 3. 讨论 3.1正常培养的成纤维细胞未经任何处理72 h后检测G2/M期所占比例 正常的成纤维细胞，未经过任何处理经过72小时的培养后镜下观察，细胞生长旺盛，已经长满整个培养瓶，结构完整且形态正常，说明细胞在72 h内已经进行多次有丝分裂。且收集检测处于G2/M期的细胞所占比例仅为0.18%。说明细胞已经过了指数生长期而处于平台期，基本不再分裂，增殖。刘春霞等(2007) 通过基本方法培养细胞，可以使单层的细胞处于对数增殖期，轻微震荡，M期细胞则易脱离器壁，悬浮于培养液中再继续培养、收集，则可获得一定数量的G2/M期细胞，赵雪萍等 (2007) 通过这样的方法收集的细胞不受药物伤害且同步化程度高，缺点是获得的细胞数量较少。 3.2成纤维细胞经过不同浓度的秋水仙素的处理后检测G2/M期所占比例 由于绒山羊的成纤维细胞生长时间较长，所以0.07ug/mL秋水仙素对指数生长期的成纤维细胞作用18h时，G2/M期所占比例为10.88%是最高的，而在相同的作用时间内，秋水仙素的浓度增高到0.15ug/mL，G2/M期所占比例为0.02%，秋水仙素的浓度增大，其毒性相对较大，细胞无法承受对其的作用而衰竭、死亡。所以添加秋水仙素可以抑制(微管聚合)有丝分裂的形成，将细胞阻断在有丝分裂中期，但是，细胞没有分裂，添加秋水仙素是起不到分裂抑制作用的。适当浓度的秋水仙素处理,可使培养细胞停顿于分裂中期;如处理过度会使染色体凝缩，秋水仙素的浓度过大也会阻碍其分裂增殖，甚至使得不能恢复正常的细胞周期进而衰竭死亡;低浓度的秋水仙素对细胞的毒性相对减少，作用时间延长，可以使秋水仙素在细胞分裂时对其产生抑制作用，使细胞停留在G2/M期。 3.3成纤维细胞经过不同浓度的nocodazole处理后检测G2/M期所占比例 经过秋水仙素处理的细胞G2/M期的比例虽然明显增高，但是所得比例最高仅为10%，仍然没有达到制作染色体悬液所需要的比例，因此选用另外一种抑制动物细胞有丝分裂的抑制剂nocodazole来试图提高G2/M期所占比例。 Qian等(2010)报道nocodazole常被用于细胞增殖、分裂指数、抗肿瘤机制等方面的研究，其可以和微管中的β-tubulin结合，抑制有丝分裂时纺锤体的功能，并 /M期。刘志春等(2002) 通过对小鼠成纤维细胞同步化的破坏高尔基体的结构，诱导细胞阻滞在G2 研究报道，发现最宜的nocodazole作用时间是18 h。不同浓度的nocodazole在作用18 h后，随着nocodazole的浓度增高， G2/M期的细胞数量逐渐增多，其中300 ng/mL nocodazole 中的 G2/M期所占比例最高。我们使用nocodazole处理绒山羊成纤维细胞同步化的研究表明，24 h后检测发现300 ng/mL nocodazole 中的 G2/M期所占比例最高，这可能是因为山羊成纤维细胞的生长周期相对较长，所以延长培养时间到24h较培养18 h的G2/M期比例高。 3.4分析对比绒山羊成纤维细胞G2/M期所占比例 刘志春等(2003)黑熊与大鼠的成纤维细胞通过nocodazole处理后G2/M期所占比例最大可接近于50%，本实验中绒山羊的成纤维细胞周期同步化于G2/M期的最大比例是15.10%，已经满足制备单条染色体悬液进行流式分选的要求了。而绒山羊成纤维细胞通过nocodazole处理后G2/M期所占比例较低，这可能是由于物种的差异性所致，绒山羊的成纤维细胞生长缓慢，所需时间较长，有丝分裂率较低。 3.5 分析比较秋水仙素与nocodazole对绒山羊的成纤维细胞同步化处理的影响 本研究发现，不同浓度的秋水仙素对绒山羊的成纤维细胞同步化处理后G2/M期所占比例最高为10.88%，而不同浓度的nocodazole对绒山羊的成纤维细胞同步化处理后G2/M期所占比例最高可达15.10%，明显高于秋水仙素同步化作用，所以对于绒山羊的成纤维细胞来说，nocodazole是更加适合的有丝分裂抑制剂。 参考文献 [1] 刘春霞，周欢敏. 马皮肤成纤维细胞的体外培养与冷冻保存[J]. 中国畜牧兽医. 2007(3) [2] 刘志春，李六金，杨贵忠，等. 大鼠成纤维细胞同步处理的流式细胞仪分析[J]. 黄牛杂志. 2002(6): 16,18 [3] 刘志春，李六金，杨贵忠，等. 流式细胞仪分析法检测黑熊成纤维细胞周期同步化处理效果[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学 版). 2003(8): 77,79 [4] 赵雪萍，谢献胜，王子玉，等. 麋鹿皮肤成纤维细胞的细胞周期同步化研究[J]. 南京农业大学学报. 2007(1): 84,87. 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Completely phased genome sequencing through chromosome sorting[J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011, 108(1): 12,17 The Effect of Colchicine and Nocodazole in Different Concentrations on Cycle Synchronization of Cashmere goat Fibroblast Huiru Yang, Hongmei Xiao, Ting Cai, Hongli Ju, Xinlei Yu, Zhihong Liu, Jinquan Li and Zhixin Wang (Inner Mongolia Key Laboratory of Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Inner Mongolia Agricultural University. Hohhot 010018, China.) Abstract: This experiment was conducted to explore optimized conditions to make more Cashmere goat fibroblasts which had been treated in G2/M. In the experiment, the colchicine and nocodazole reagents were used in the processing of Cashmere goat fibroblast cell cycle synchronization and the number of the cell in G / M was measured by flow cytometry to observe the optimal concentration and action time. The results showed that the colchicine concentration should not be too large; furthermore, the time should not be too long in treatment of colchicines. In addition, under the same conditions, the treatment of nocodazole worked better than colchicine in synchronization. The optimum processing conditions include the concentration is 300ng/mL and the action time is 24h. Then the percentage of fibroblast in G/M accounted for 15.10%. The results suggest that the effect of nocodazole reagents was more pronounced for Cashmere goats fibroblasts, when conducting the cell cycle synchronization processing. Keywords: cashmere goat;fibroblast;colchicine;nocodazole;cell cycle synchronization;flow cytometry 作者: 杨惠茹，(1986,) ，女，内蒙古人，在读硕士，研究方向:动物遗传繁殖与育种学。E-mail:yhr1979442@163.com 通讯作者:李金泉，(1957-)，男，内蒙古人，博士, 教授, 博士生导师,研究方向:绒山羊育种。E-mail: lijinquan_nd@126.com。 基金项目:本项目由国家863 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 (2013AA102506)、国家自然科学基金(31072005,31272421)和国家农业部现代农业产业技术体系(CARS-40-05)支持。