过去数年

过去数年 Abstract 過去數年,中研院生醫所嚴仲陽老師研究室的研究集中在造血細胞凋亡調控的兩個基本問題:(1) 當存活因子去除後,凋亡訊息如何被啟動及傳遞,(2)細胞激素受體傳遞那些特異的抗凋亡訊息,目前有三個計劃與這兩個問題有關: 1. GM-CSF共同受體β鏈在細胞激素去除引發之凋亡扮演極重要的角色。受 體近膜區域DER對這功能是必要的。DER的訊息如何往下傳送是目前我 們的重要研究課題。 2. 第五介白質受體α鏈的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 達量決定抗凋亡訊息是否會被第五介白質活 化。人類造血前驅細胞活體外培養時需要添加幹細胞因子,可能肇因於受 體表達量不足而無法啟動抗凋亡訊息。受體活化後,無論IL5或SCF皆 以Bcl-2家族成員,Mcl-1,作為抗凋亡標的基因。 3. 轉錄因子CREB為哺乳類細胞中Ces-2/E2A-HLF結合序列的最主要的結 合因子。細胞激素活化後,CREB會受到PKA或Akt/PKB磷酸化並活化。 我們進一步證明PKA/CREB途徑是細胞激素抗凋亡訊息中重要的一環。 近日來,在計劃一的部分發現,一個被暫稱為gs3955序列所表現的蛋白質與DER訊息傳遞有極密切的關係。為了更了解gs3955在DER訊息傳遞中,與其他蛋白質之間有著什麼樣的互動,本次實驗利用Yeast Two-hybrid等分子生物學實驗技術,欲找出能與gs3955的表現蛋白相互作用的蛋白質。然而,經兩個月的實驗下來,卻頻遇瓶頸,少有所獲。 , Introduction 本次實驗 主要利用 Yeast Two-hybrid技 術 (如右圖所 示),在已知蛋 白 (bait) 前 接上GAL4 DNA-binding domain (DNA-BD), 並將未知的蛋 白序列 (library) 接於 GAL4 activating domain,若兩段蛋白序列有interaction,則AD和BD便能結合進入細胞核中,使位於UAS promoter後的reporter gene表現出來,使菌存活在具有選擇性的培養基上。 為更進一步了解gs3955序列與蛋白質間的interaction,實驗將gs3955序列分成兩部分,其一切除N端1/3,留下2/3的C端 (此部分稱C-ter),其二於切除C端1/3,留下2/3的N端 (此部分稱N-ter),實驗主要 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 如下: ,Yeast Transformation ,Pick colonies ,Selection three times ,β-galactosidase assay ,Yeast DNA purification ,Transform to HB101 ,Bgl ? check ,Retransform to yeast ,Sequencing , Materials 1、Yeast strain:L40 (-his、-trp、-leu、-ade、LYS2::lexA-His URA3::lex-lacZ) 2、Plasmid:pBTM116,pACT2 (圖示於後) 3、Competent cell:HB101 4、Yeast DNA purification kit 5、E. coli DNA purification kit 6、TE ( tris/EDTA solution pH:7.6): tris-base 200mM EDTA 20mM ddHO 2 7、Z buffer/X-gal solution: Z buffer 100mL β-mercaptoethanol (β-ME) 0.27mL X-gal stock solution 1.67mL 8、SD medium: a、 ddHO 780mL 2 b、 dropout(10×) 100mL c、 Nitrogen base w/o aa 6.7g d、 Stir e、 Autoclave of、 Water bath 56C,30’ g、 Glucose(20%) 100mL h、 Adenine 20mL、3AT(1M) 6mL。Stir medium: 9、M9 a、ddHO 770mL 2 b、-Leu DO(10×) 100mL c、Autoclave od、water bath 65C e、M salt(10×)* 100mL 9 f、Glutose(20%) 20mL g、CaCl 100λ 2 h、Thiaminl(1M) 1mL i、L-proline 4mL j、MgSO 2mL 4 k、Amp 1mL * M salt: 9 NaHPO 67.8g 24 KHPO 30g 24 NaCl 5g NHCl 10g 4 DdHO 1L 2 10、LB-amp: a、LB 膞囊 20個/L b、Stir oc、water bath 56C d、Autoclave e、Add Amp (in hood) 1mL 11、PBS: NaCl 160g KCl 4g NaHPO 28.8g 24 KHPO 4.8g 24 ?????? ddHO 20L 2 , Methods 本次實驗的library主要分成兩部份,一為lymphocyte的library,二為bone r) marrow的library。首先,在DNA-BD plasmid (pBTM116,TRP sequence,Amp r中嵌入gs3955 ( N or C-ter),在AD plasmid(pACT2,LEU sequence,Amp) 中放進library (lymphocyte or bone marrow),將此二個plasmid transform 至 L40中 (如下圖示)。 當L40成功被殖入pBTM116時,便能生長在含Amp但無TRP的培養基中;同理,當L40成功被殖入pACT2時,便能生長在含Amp但無LEU的培養基中。故當兩個plasmid同時被殖入L40,且gs3955與library中的蛋白質序列有強結合時,DNA BD-AD便能進入細胞核中,表現HIS gene與lacZ gene。因此,在成功殖入pBTM116與pACT2的L40中,當library與gs3955有強結合而表現出HIS gene與lacZ gene時,便可藉由選擇性培養基(-TRP、-LEU、-HIS、Amp、ade)與β-galactosidase filter assays的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 篩選與確定出和gs3955有強結合的library sequence。 詳細的Transformation、Yeast DNA purification與competent cell 製作的protocol 附件於後 , Results A、 lymphocyte library 66663.4×10 0.8×10 2.0×10 2.2×10 N-ter Transformation Efficiency (-Trp, -Leu SD 6666plate) 4.1×10 2.6×10 2.4×10 3.0×10 C-ter 240 clones 128 160 160 N-ter Pick colonies 240 clones 44 48 48 C-ter 1 clone 63 48 32 N-ter First selection (-Trp, -Leu, -His, 3AT 6mM) 0 clone 0 0 0 C-ter 1 clone 63 48 32 N-ter Secondary selection (-Trp, -Leu, -His, 3AT 6mM) 0 clone 0 0 0 C-ter 1 clone 63 48 32 N-ter Tertiary selection (-Trp, -Leu, -His, 3AT 6mM) 0 clone 0 0 0 C-ter 1 clone 62 46 32 N-ter β-galactosidase assay 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 39 40 32 N-ter Yeast DNA purification 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 0 3 1 N-ter Transform to HB101 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 0 0 0 N-ter Bgl ? check 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 0 0 0 N-ter Retransform to yeast 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 0 0 0 N-ter Sequencing 0 clone 0 0 0 C-ter B、 bone marrow 6666 1.7×10 3.1×10 2.3×10 3.1×10N-ter Transformation Efficiency (-Trp, -Leu SD 6666plate) 3.5×10 1.9×10 2.8×10 3.2×10 C-ter 150 clones 121 147 145 N-ter Pick colonies 150 clones 118 106 77 C-ter 31 clone 21 35 19 N-ter First selection (-Trp, -Leu, -His, 3AT 6mM) 5 clone 1 0 15 C-ter 31 clone 21 35 19 N-ter Secondary selection (-Trp, -Leu, -His, 3AT 6mM) 5 clone 1 0 13 C-ter 31 clone 21 35 19 N-ter Tertiary selection (-Trp, -Leu, -His, 3AT 6mM) 5 clone 1 0 13 C-ter 31 clone 21 35 19 N-ter β-galactosidase assay 0 clone 0 0 5 C-ter 28 clone 20 35 19 N-ter Yeast DNA purification 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 2 0 3 N-ter Transform to HB101 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 1 0 0 N-ter Bgl ? check 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 0 0 0 N-ter Retransform to yeast 0 clone 0 0 0 C-ter 0 clone 0 0 0 N-ter Sequencing 0 clone 0 0 0 C-ter , Discussion 在本次實驗中,每每將DNA由Yeast抽出轉殖入HB101使其大量複製,卻 中生再也無法從HB101中抽出DNA來。有時是因為被轉殖的HB101無法在M9長;有時卻疑似污染,造成M plate上長滿了雜菌。就算是從中挑出長的好的9 plate內的菌落,依然抽不出DNA來。這詭異的現象造成實驗長時間處於瓶頸。就算是更新重作competent cell, HB101,結果仈然與上述相當。後來推測可能是 o因為competent cell的stock已受污染或死亡 (因儲存stock的-70C的冰箱層一度 o壞掉,讓溫度上升至-20C),實驗室因此決定換一批新的stock,但此時我已經回到新竹準備開學了。 在開學後與帶我的學姐聯絡討論的結果,除了與stock有關外,似乎與實驗設計的過程亦有關係,這部分學姐便沒再多說了。 附件 Competent Cell ( Each step all on ICE) o1、 culture single colony (DHα) to 3mL LB, 37C o/n 5 o2、 transfer to 250mL LB 37C culture ( 2 ~3hr) to O.D = 0.4 ~ 0.5 600 3、 transfer to centrifuge tube (500 c.c.) 4、 ice bath 30’ 5、 spin down the cell (4K, 10’) 6、 super. Discard 7、 add 30mL RF1 solution (on ice) 8、 resuspension cell pellet gently 9、 ice bath 1.5hr 10、 spin down the cell (4K,15’), super. Discard 11、 add 6mL RF2 solution 12、 resuspension cell pellet gently 13、 aliquot to microtube (100λ/each) 14、 dry ice to freeze o15、 80C o/n Yeast transformation (Library screening) oC, in media YPAD , o/n 1、 culture 50mL L40 yeast strain 302、 OD > 1 600 3、 Transfer to 300mL YPAD media 4、 OD = 0.33 ~ 0.35 600 o5、 3000 rpm. , 10’, 20C 6、 super. discard (be careful to pellet) 7、 1×TE, pH = 7.5 50mL, wash o8、 2400, 5’, 20C 9、 TE/LiAc 1mL resuspend (100λ 10×TE + 100λ 10×LiAc, 800λ ddHO) 2 o10、 RT, 靜置10’ 11、 取100λ菌液至eppendorf 12、 ssDNA 10λ/each tube 13、 PEG 40% 600λ/each tube o14、 Vortex, 30C incubate 30min 15、 Vortex, DMSO 70λ/each tube, invert 2 ~3次 (DMSO需避光) o16、 42C heat-shock 15min (invert twice) 17、 ice bath 2’ 18、 14000, 5” 19、 super. discard 20、 200λ YPAD, resuspend pellet 21、 transfer to new tube containing 2mL YPAD o22、 recover 3hr, 30C 23、 2400 rpm, 5’ 24、 super. discard 25、 1×TE 300λ 26、 留一管做efficiency,剩下全塗15cm plate o27、 30C, incubate 3 days Efficiency: 1、拿一管菌液,僄明體積 (about 400λ) 2、取20λ菌液加至180λ 1×TE o3、再從中取20λ加至180λ 1×TE,2管,incubate 30C, 3 days 4、公式: E (cfu〃λ /μg) = (cfu × total volum(μl))/(菌的volume(μl) × [DNA] (μg/λ)) Yeast DNA purification 1、 6ml -L/SD culture o/n 2、 spin 5000 rpm. , 5’ 3、 suspension discard 4、 repeat until all sample are spun 5、 suspension discard 6、 add 300λ lysis buffer suspend. 7、 Add 1/2 glass beads. a 8、 Add 300λ phenol/chloroform 9、 Vortex 10’ 10、 14000 rpm. , 10’ 11、 suspension change to new tube (此時溶液分三層,上層為水 + DNA,中層是變質的protein,下層為有機層) 12、 add TE 100λ (each tubes contain 5λ EtBr) 13、 add phenol/chloroform 300λ 14、 vortex 1’ 15、 spin 14000 rpm. 5’ 16、 suspension change to new tube 17、 repeat once (step12 ~ step16) 18、 add TE 50λ 19、 chloroform/IAA 400λ 20、 vortex 1’ 21、 spin 14000 rpm. 5’ 22、 suspension change to new tube b23、 add 1/10 V NaOAc, 2.5×V 100% EtOH 24、 dry ice 30’ -> clot 25、 上下invert 至融化 o26、 spin 14000rpm. 10’,4C 27、 suspension discard, 檢查有無白色 pellet c28、 add 1ml 70% EtOH, 上下invert 數下 29、 spin 14000 rpm. 5’ 30、 suspension discard, dry 1’30” 31、 10λ ddHO resuspend 2 d32、 測OD值 [Transfer to HB101] 33、 add 100λ HB101 competent cell (on fire) 34、 ice bath, 30’ oC, 1’30” 35、 heat cshock, 42 36、 ice bath, 2’ 37、 add 900λ LB o38、 37C incubate 1h (recover) 39、 5000 rpm, 5’ 40、 discard suspension 41、 100λ M medium suspend 9 o42、 plate on M plate. Culture at 37C, 1.5day 9 43、 長出來的菌每盤挑3顆養在LB/Amp 4 c.c. for E.coli DNA purify. NOTE: a、 phenol/chloroform 可溶解脂質(有機溶劑),使protein變質,離心後變質 的protein停留在水層與有機層之間。 +- b、 NaOAc, NaDNA ? 中和電性,容易聚集沉澱;EtOH ? 極性大,易 結合水分子,使溶解在水中的DNA沈澱出來。 c、 70% EtOH ? 洗去DNA上殘留的鹽和有機物質 d、 OD:DNA OD:protein OD:RNA 260280320