流式细胞仪原理 流式细胞仪原理及构造

流式细胞仪原理 流式细胞仪原理及构造 流式细胞原理及构造 流式细胞术发展史 纵观历史几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景不同科研领域的科学家的心血从流式细胞术的发明改进流式细胞仪的研制革新到今天的众多应用领域的拓展每一步都是诸如生物学生物技术计算机科学电子工程学流体力学激光技术高等数学临床医学分子生物学有机化学和物理学等学科知识综合运用的结晶而现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术定量细胞化学和定量荧光细胞化学的应用使其在生物学临床医学药物学等等众多研究领域的应用有了更加突飞猛进的发展而 1 这一切就要求我们的流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科的知识只有这样才能更好地将流式细胞仪应用到我们的临床和科研中去 流式细胞术发展史 ,,,,年 ,,,,,,,,,, 和,,,,,,,开始致力于细胞的计数 ,,,,年 ,,,,,,,, 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 ,,,,年 ,,,,,,,,,, 等引入显微光度术 ,,,,年 ,,,,, 提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 ,,,,年 ,,;,;,, 运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器 ,,,,年 ,,,,,;, ,,,,,,, 提出在悬液中计数粒子的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的专利 ,,,,年 ,,,,,,,,,, 用显微分光光度计的方法在,,和可见光光谱区检测细胞 ,,,,年 ,,,,,,,,,,,,,,,,应用分层鞘流原理成功的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 红细胞光学自动数器 2 同年,,,,,,和,,,,,描述一种全血细胞计数器装置成为流式细胞仪的雏形 ,,,,年 ,,,,,, 和,,,;,,,, 发明光电粒子计数器 ,,,,年 ,型,,,,,,,计数器 ,,,,年 ,,,,,,,,,等提出两个设想一是用分光光度计定量细胞成分二是结合测量值对细胞分类 ,,,,年 ,,,,,,,,, 和,,,,,,, 在,,,,,,,,的方法的基础上提出细胞分选的方法 ,,,,年 ,,, ,,,,,,,,,,,,,及其同事们在,,, ,,,,,,,,(即现在的,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,;, ,,,,) 发明第一台荧光检测细胞计 ,,,,年 ,,,,,,,,,, 研制出一个细胞分选器的改进型能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号 ,,,,年 ,,,,,, 和,,,,,,,, 提出了单克隆抗体技术为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础 从此大量的厂家不断研制生产出自己的流式细胞仪流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代科学家们仪器制造商们又纷纷将研究焦点转向荧光染料的开发细胞的制备方法和提高电子信号的处理能力上来进入九十年代流式细胞 3 术作为一门生物检测技术已经日臻完善而随之而来的就是应用领域的日趋广泛而今流式细胞仪已经深入到生物学医学药物学等的各个分支领域并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用 流式细胞仪构造和工作原理 一概述 流式细胞仪(,,,, ,,,,,,,,, 简称,,,)是一项集激光技术电子物理技术光电测量技术计算机技术以及细胞荧光化学技术单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器概括来说流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的快速的定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 和分选的技术从开始设想到第一台仪器的问世，科技工作者进行了不懈的努力随着各相关技术的迅速发展,,,技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具 ,,,仪器分为二大类一类为台式机其特点为仪器的光路调节系统固定自动化程度高操作简便易学易掌握另一类为大型机其特点为可快速将所感兴趣的细胞分选出来并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或板上同时可选配多种波长和类型的激光器适用于更广泛更灵活的科学研究应用 二流式细胞仪构造 ,,,的结构一般可分为五部分(,)流动室及液流 4 驱动系统; (,)激光光源及光束成形系统; (,)光学系统; (,)信号检测与存贮显示分析系统(,)细胞分选系统见图一 图 一 (一)流动室与液流驱动系统 流动室(,,,, ,,,,,,,或 ,,,, ,,,,)是仪器核心部件被测样品在此与激光相交流动室由石英玻璃制成并在石英玻璃中央开一个孔径为,,,,,,,,的长方形孔供细胞单个流过检测区在该孔的中心这种流动室的光学特性良好流速较慢，因而细胞受照时间长可收集的细胞信号光通量大配上广角收集透镜可获得很高的检测灵敏度和测量精度 流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包鞘液流是一种稳定流动操作人员无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦使样品流不会脱离液流的轴线方向并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等从而得到准确的细胞荧光信息 图 二 细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法流速与压力的关系服从 ,,,,,,,,,方程即,,(,, 5 ,) ,,, (忽略高度的变化)可见只要压力恒定就可得到恒定的鞘液流流速， 从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变 低速(,,,) 高速(,,) 图 三 从图二可以知道，真空泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力(压力的大小由工厂设定)，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度，但是，这并不是提高样本流的速度，而是改变了细胞间的距离，从图三可以看出，样本流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加 这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布(见图四)，中心处能量最高，因此当样本速率选择高速(,,)时，处在样本流不同位置的细胞或颗粒，受激光光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同这就会造成测量误差，当在检测分辨率要求高的实验时(如 ,,, ,,,,,,,,)应选用低速(,,,) (二)激光光源与光束成形系统 6 目前台式机,,,大多采用氩离子气体激光器 激光 (,,,,,， ,,,,, ,,,,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,) 是一种相干光源它能提供单波长高强度及稳定性高的光照是细胞微弱荧光快速分析的理想光源这是因为由于细胞的快速流动每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱与被照射的时间和激发光的强度有关因此细胞必须达到足够的光照强度 激光光束在到达流动室前先经过透镜将其聚焦形成几何尺寸约为,,,, ,,即短轴稍大于细胞的直径的光斑(见图四)这种椭园形光斑激光能量分布属正态分布;为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，台式机,,,的光路调节对用户是封闭的即安装时由工程师调试完毕后， 无需用户作任何调节， 所以用户操作十分方便 图 四 (三)光学系统 ,,,的光学系统是由若干组透镜滤光片小孔组成它 7 们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器 在,,,的光学系统中主要光学原件是滤光片(,,,,,,)主要分为三类长通滤片(,,,,,,,,,, ,,,,,,,,)短通滤片(,,,,,,,,,,, ,,,,,,，,,) 及带通滤片(,,,,,,,,,, ,,,,,,， ,,) (,)长通滤片长通滤片使特定波长以上的光通过特定波长以下的不通过如,,,,,滤片将允许,,, ,,以上的光通过而,,, ,,以下的光吸收或返回 图 五 (,)短通滤片与长通滤片相反回 特定波长以下的光通过特定波长以上的光吸收或返 图 六 (,)带通滤片带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过一般滤片上有两个数一个为允许通过波长的中心值另一为允许通过光波段的范围如,, ,,,,,,表示其允许通过波长范围为,,,,,,,,,,, 图 七 (四)信号检测与分析 当细胞携带荧光素标 8 记物通过激光照射区时受激光激发产生代表细胞内不同物质不同波长的荧光信号这些信号以细胞为中心向空间,,,度立体角发射产生散射光和荧光信号， 图八是以激发光光源波长,,,,,为例的示意图 图 八 ,(散射光信号散射光分为前向角散射(,,,,,,,,,, ,;,,,,,) 和侧向角散射(,,,,,,, ,;,,,,,)散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)因此被称为细胞的物理参数(或称固有参数) (,) 前向角散射前向角散射与被测细胞的大小有关确切说与细胞直径的平方密切相关通常在,,,应用中选取,,,作阈值来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒以避免对被测细胞的干扰 (,)侧向角散射侧向角散射是指与激光束正交,,,方向的散射光信号侧向散射光对细胞膜胞质核膜的折射率更为敏感可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息 上述两种信号都是来自于激光原光束其波长与激光相同目前采用这两个参数组合可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞单核细胞和粒细胞三个细胞群体或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体 9 ,(荧光信号当激光光束与细胞正交时一般会产生两种荧光信号一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号称为细胞自发荧光另一种是经过特异荧光素标记细胞后受激发照射得到的荧光信号通过对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量 荧光染料可选用的荧光素有多种多样由于它们分子结构不同其荧光激发谱与发射谱也各异选择染料或单抗所标记的荧光素必须考虑仪器所配置光源的波长目前台式机,,,常配置的激光器为,,,,,通常可用染料有,，(,,,,,,,,, ,,,,,,),,(,,,;,,,,,,,,,),，,, (,,,,,,,;,,, ,,,,,,,;,,,,,,),,,,,(,,,,,,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,,,,,),,,等 (,)荧光信号线性测量和对数测量 荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路完成从图一可知当携带荧光素的细胞与激光正交时受激发出荧光经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管(,,,),,,将光信号转换成电信号有些厂家不采用光电倍增管(,,,)而采用线性放大光电转换器其优点是降低成本提高线性度但其最大缺点是响应速度慢造成仪器分析细胞速度降低最高不可能超过,,,,个,秒如果样本流速超过此速度会导致数据损失因此高档机器不采用此种方法电信号输入 10 到放大器放大放大器分两类线性放大和对数放大线性放大器即放大器的输出与输入是线性关系细胞,,,含量,,,含量总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量但在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器如果原来输出是,当输入增大到原来十倍时输出为,当输入增大到原来一百倍时输出为,等在免疫学样品中细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍甚至几万倍如用线性放大器将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群阴性群同时显示出来 (,)荧光信号的面积和宽度 所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量一般对,,,倍体测量时采用面积(如,,,,,)这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映,,,的含量当形状差异较大而,,,含量相等的二个细胞得到的荧光脉冲高度是不等的经过对荧光信号积分后所得到的信号值就相等 宽度(如,,,,,)常用来区分双联体细胞由于,,,样本极容易聚集当两个,,期细胞粘连在一起时其测量到的,,,荧光信号(,,,,,)与,,期细胞相等这样得到的测量数据,,期细胞比例会增高影响测量准确性图九是用小牛胸腺细胞测量得到的,,,分布曲线图九,中,,形成了小峰其中有一部分是因为,,期细胞粘连在一起形成假,,期细胞而图九,是通过设门(,,,,)将 11 双联体细胞排除其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号(,,,,,)要比单个,,期细胞大因此设门后才能得到真正的,,,含量分布曲线和细胞周期(图九,;)不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可作同样分析 , , ; 图九 (,)光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光素如(,,和,，,,)受激光激发而发射出两种不同波长的荧光时理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测到而不会检测到另一种荧光但由于目前所使用的各种荧染料都是宽发射谱性质虽然它们之间各自发射峰值各不相同但发射谱范围有一定的重叠从图十中可以看出阴影为探测器检测光谱的范围,，,,探测器会探测到少量的,,光谱而,,探测器则检测到较多的,，,,光谱克服这种误差的最有效方法是使用荧光补偿电路利用 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 已知样品或荧光小珠可合理设置荧光信号的补偿值图十一给出补偿前后模型图 12 图 十 图 十一 采用双激光立体光路技术， 就是为了减少各荧光间相互补偿， 其原理通过图十二可以知道: 点,通过透镜,成像在,,处， 而点,通过透镜,成像在,,处(在光电倍增管前放上一小孔， 作为空间滤波器， 排除其它杂散光信号， 从而确保了,点光源进不了,,点处， ,点光源也进不了,,点处， 因此就可避免有第一激光(,,,,,)激发出的,,,， ,,,， ,,, 和第二激光(,,,,,) 激发出的,,,间的补偿当然,,,， ,,,，和,,,是来自于同一点光源， 它们之间的补偿是不可避免的 图 十二 (五) ,,,测量数据的存贮显示与分析 目前,,,数据的存贮的方式均采用列表排队(,, 13 ,, ,,,,)方式因为目前,,,所采用的都是多参数指标荧光参数标记物已可多达,个采用,,,, ,,,,方式可大量地节约内存和磁盘容量当一个细胞被检测,个测量参数那么获取一万个细胞所占容量为,,,,,,个(字或双字)同时当只检测细胞一个参数时(如,,,)可灵活的关闭其他三个参数节省四分之三的空间 数据文件虽然有易于加工处理分析的优点但缺乏直观性数据的显示通常有一维直方图二维点图等高线图密度图等几种 ,单参数直方图 细胞每一个单参数的测量数据可整理成统计分布 以直方图(,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,) 来显示在图中横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值其单位是道数横坐标可以是线性的也可以是对数的纵坐标一般是细胞数 图 十三 左上图较低道数处为,,期细胞道数为,,期细胞两倍得是,,，,期细胞二者之间是期细胞右上图,,,,,,,为阴性细胞而,,,以上为阳性细胞 ,双参数数据的显示 14 双参数数据的显示是用于表达来自同一细胞两个参数与细胞数量间的关系， 常用的表示方法有二维点图(,,, ,,,,)， 等高线图(,,,,,,, ,,,,)， 二维密度图(,,,,,,, ,,,,) 在二维图中， ,坐标为该细胞一参数的相对含量， 而,坐标为该细胞另一参数的含量， 从双参数图形中可以将各细胞亚群区分开， 同时可获得细胞相关的重要信息， 左下图为,,,和,,,组成的点图， 从图中可以很容易把全血样本中淋巴细胞， 单核细胞及粒细胞区分开，从而可以分别分析各细胞亚群的统计数据， 右下图是通过设门分析(,,,,,, ,,,,,,,,)得到的,,,和 ,,,点图，设门可以是单参数设门，也可以是双参数设门，通过设门可调出其他参数的相关信息，被调出的信息同样也可以是单参数和双参数图十四就是通过细胞的前向和侧向散射光双参数点图，设门圈出标本中的淋巴细胞群体，再调出免疫荧光的点图 图 十四 南京医科大学分析测试中心 ,,,,:,,,,;,, 15 ,(,,,,(,,,(;,, ,,,,,,,,,,,, 等高线图 密度图 图 十五 流式细胞仪的主要技术指标 ,(荧光测量灵敏度 灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标一般以能检测到单个微球上最少标有,，,,或,,荧光分子数目来表示，一般现在,,,均可达到(,,,个荧光分子 ,(仪器的分辨率 分辨率是衡量仪器测量精度的指标通常用变异系数,, (,,,,,,;,,,, ,, ,,,,,,,,,)值来表示 ,,,,,,,,, (,是分布的标准误差,是分布的平均值) 如果一群含量完全相等样本用,,,来测量理想的情况下,,,,用,,,测量曲线表示为图十六,但是在整个系统检测中会带入许多误差其中样本含量本身的误差样本在流进照射光的微量变化再加上仪器本身的误差等实际得到的曲线为图十六, 16 图 十六,, 图 十六,, ,,值越小则曲线分布越窄越集中测量误差就越小一般的,,,在最佳状态时,,值均,,, ,,值的计算除了采用以上的计算 公式 小学单位换算公式大全免费下载公式下载行测公式大全下载excel公式下载逻辑回归公式下载 外，还可以用半高峰宽来计算半高峰宽指在峰高一半的地方量得的峰宽它与,,值有以下的关系 南京医科大学分析测试中心 ,,,,:,,,,;,,,(,,,,(,,,(;,, ,,,,,,,,,,,, ,,,半高峰宽,,,(,,,,,,,, 上述公式是建立在正态分布的条件下而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形故采用半高峰宽所计算得到的,,值要明显小于前统计公式得到的,,在实际情况中应引起注意 ,(前向角散射光检测灵敏度 前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小一般目前商品化的,,,可以测量到,(,,,(,,,左右 ,(,,,分析速度 分析速度以每秒可分析的细胞数来表示当细胞流过光束的速度超过,,,仪器响应 17 速度时细胞产生的荧光信号就会被丢失这段时间称为仪器的死时间(,,,, ,,,,)死时间越短我们就说这台仪器处理数据越快一般可达到,,,,个,秒,,,,,个,秒左右大型机已达到每秒几万个细胞 ,(,,,分选指标 分选指标主要包括分选速度分选纯度及分选收获率 分选速度指每秒可提取所要细胞的个数目前台式带分选的仪器它的分选速度约为,,,个,秒大型机的流式细胞仪最高分选速度可达每秒上万个细胞 分选纯度指被分选出细胞所占的百分比一般台式机和大型机的分选纯度均可达到,,,左右 分选收获率指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比通常情况下分选纯度和收获率是互相矛盾的纯度提高收获率降低反之亦然这是由于样品在液流中并不是等距离一个接着一个有序地排着队而是随机的因此一旦两个不同细胞挨得很近时在强调纯度和收获率不同条件下仪器会作出取或舍的决定因此选择不同模式要视具体实验要求而定 18 声明 本文中引用了大量国内国外的相关文献因大部分出处不明故在暂无法列出参考文献清单并在此仅向本文中引用文献作者表示真诚的谢意如有不妥之处请来电告知 南京医科大学分析测试中心 ,,,,:,,,,;,,,(,,,,(,,,(;,, ,,,,,,,,,,,, 百度搜索“就爱阅读”,专业资料,生活学习,尽在就爱阅读网92to.com,您的在线图书馆 19