癌胚抗原(CEA)诊断试剂盒
时间分辨免疫荧光分析法
标准操作规程
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癌胚抗原诊断试剂盒
时间分辨免疫荧光分析法
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1.原理
试剂盒采用双抗体夹心一步法：抗CEA单抗包被于96孔荧免板；依次加入标准品/样本、铕离子(Eu3+)标记的抗CEA单抗，标准或样品中的CEA与包被单抗及Eu3+标记单抗于微孔内发生免疫反应，在微孔表面形成夹心免疫复合物（包被单抗—CEA—Eu3+标记单抗）。洗涤去除游离的Eu3+标记单抗，加入荧光增强液，微孔表面免疫复合物上的Eu3+被荧光增强液解离，并形成稳定的荧光配合物，荧光强度与标准或样品中的CEA浓度呈正比例，通过标准曲线可得出样品中CEA浓度。
2.样本处理
使用血清或以肝素作抗凝剂的血浆。2～80C条件下样本可保存2天，–200C可保存更长时间。样本避免反复冻融。
若样本中CEA含量大于500 ng/ml，请用生理盐水稀释后再测量。
3.试剂
本科室使用苏州新波生物技术有限公司癌胚抗原（CEA）时间分辨免疫荧光法诊断试剂盒，试剂盒主要组分如下：
a. 癌胚抗原参考标准品：1套，6瓶，1ml/瓶
A：0ng/ml； B：2.5ng/ml； C：5 ng/ml；D：16 ng/ml；E：107 ng/ml；F：530 ng/ml
b. 铕标记物：1瓶，1ml
c. 实验缓冲液：1瓶，30ml
d. 浓缩洗液：1瓶（40ml，使用前用去离子水作1：25倍稀释）
e. 荧光增强液：1瓶，30ml
f. 微孔反应板：1块（12×8）
g. 吸头：20支
h. 说明书：1份
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4.仪器（用户自备）
4.1 时间分辨荧光分析仪；
4.2 微孔洗涤机；
4.3 微孔振荡器；
5.操作步骤
5.1 试剂的准备
⑴洗涤液：将40ml浓缩洗液和960ml去离子水在干净的洗液瓶中混合，作为工作洗涤液备用。
⑵铕标记：使用前一小时内，用实验缓冲液按1：50稀释铕标记（详见操作流程图）。
5.2 将实验缓冲液、标准品、待测样品和所需数量的微孔反应条平衡至室温（20～250C）。
5.3 吸取25μl的标准品和样品，按顺序加入相应微孔。
5.4 在各微孔内加入200μl已稀释的铕标记溶液，在室温下慢速振动120分钟。
5.5 洗板6次，将板条在洁净的吸水纸上拍干。
5.6 在每个微孔内加入200μl的增强液，慢速孵育5分钟。
5.7 确定微孔反应条已固定在时间分辨荧光测定仪上，开始检测。
6.结果判断：
6．1结果测定
用本公司ANYTEST2000时间分辨荧光测定仪或WALLAC公司时间分辨荧光测定仪（1230、1234、1420）测量时，检查程序的参数是否如下所示。如不符，请修改。
ASSAY TYPE（分析类型）：IFMA（时间分辨免疫荧光分析法）
FITTING METHOD（曲线拟和方式）：PLINE SMOOTHED（平滑样条函数）
X-AXIS（X轴）：LOG
Y-AXIS（Y轴）：LOG-B
BLANKS（背景孔数）：2
STANDARDS（参考标准点）：5
STANDARDS REPLICATES（参考标准点复孔数）：2
STANDARD CONC（参考标准点浓度）：2.5
STANDARD CONC（参考标准点浓度）：5
STANDARD CONC（参考标准点浓度）：16
STANDARD CONC（参考标准点浓度）：107
STANDARD CONC（参考标准点浓度）：530
UNKNOWN REPLICATES（待测样品孔数）：1
6.2结果判读：用本试剂盒对135份正常人血清进行检测，癌胚抗原测量值范围为0.3-5.5ng/ml。建议各实验室建立自己的正常值范围。
7．临床意义
CEA是一种分子量为180～200kD的糖蛋白，主要存在于消化道上皮组织、胰腺和肝脏，胎儿和成人消化道也产生少量CEA，但分泌到胃肠道而排出体外，而癌细胞分泌的CEA则进入淋巴液和血液。另外，CEA也见于羊水和胆道、肺、乳腺等组织。CEA检测的临床意义主要在于：
1） 恶性肿瘤的辅助诊断。不少恶性肿瘤，特别是胃肠道恶性肿瘤、肺癌、乳腺癌患者，其血清CEA浓度常见明显升高。
2） 病情预后和判断。肿瘤患者血清CEA含量增高程度常与肿瘤转移有一定关系，如：肺癌伴有肝转移时其中约85%可见CEA升高。
3） 疗效评估和预报复发。肿瘤患者经手术切除、抗癌药物治疗或放疗后病情好转时，血清CEA浓度一般逐渐降低；当治疗效果不佳时，CEA浓度不下降或升高。
4） 对肿瘤分期和病变程度的判断。如：血清CEA阳性与乳腺癌分期有关，Ⅰ期约14.8%阳性,Ⅳ期约73%阳性。
5） 与AFP联合检测用于肝癌的辅助诊断。部分继发性肝癌可见血清AFP检测呈阴性而CEA检测呈阳性的现象。
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8．参考值
癌胚抗原测量值范围为0.3-5.5ng/ml。建议各实验室建立自己的正常值范围。
9．注意事项
9.1 理解说明书，不要混用不同批号的试剂，不要使用过期的试剂。
9.2 尽量建立一个干净无尘的实验室环境，对实验的成功起到决定性作用。(因为尘土中含有很多金属离子，会影响实验结果)。
9.3 试剂盒与被测样本使用前必须达到室温。
9.4 振荡器按照《2510变频振荡器标准操作规程》设定需要的振荡频率。
9.5 微孔洗涤机按照《Egate2310全自动微孔洗涤机标准操作规程》在每天使用前应进行校正注液量和残自量，注意管道是否畅通。洗涤时，确认每孔必须是干的，洗涤液都注满微孔。洗涤后，每个孔必须是干的，如果仍有水则需拍干。
9.6 吸取增强液和铕标记物时，请使用干净的吸头，避免尘土等不必要的污染。加增强液时探头应悬空，避免碰到小孔边缘或其中试剂。
9.7 使用医用蒸馏水或去离子水配制洗液。
9.8 宜用干净的一次性容器配制铕标记物，应避免铕标记稀释液进入标记物原液中。
9.9 封片不能重复使用。
9.10 如需稀释标本，请用小牛血清稀释。
9.11 所有的样本和本试剂盒应作为潜在的传染原看待，按传染病实验室检查规程操作。
9.12 如对实验结果有疑问，应重复试验。
9.13 胆红素800u mol/L，甘油三脂20 mol/L，血红蛋白18g/dl对本试剂盒无干扰作用。
9.14 本试剂盒应置2—8℃保存，有效期参照瓶上所贴标签。
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