癌胚抗原(CEA)诊断试剂盒
时间分辨免疫荧光分析法
标准操作规程
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癌胚抗原诊断试剂盒
时间分辨免疫荧光分析法
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1.原理
试剂盒采用双抗体夹心一步法:抗CEA单抗包被于96孔荧免板;依次加入标准品/样本、铕离子(Eu3+)标记的抗CEA单抗,标准或样品中的CEA与包被单抗及Eu3+标记单抗于微孔内发生免疫反应,在微孔表面形成夹心免疫复合物(包被单抗—CEA—Eu3+标记单抗)。洗涤去除游离的Eu3+标记单抗,加入荧光增强液,微孔表面免疫复合物上的Eu3+被荧光增强液解离,并形成稳定的荧光配合物,荧光强度与标准或样品中的CEA浓度呈正比例,通过标准曲线可得出样品中CEA浓度。
2.样本处理
使用血清或以肝素作抗凝剂的血浆。2~80C条件下样本可保存2天,–200C可保存更长时间。样本避免反复冻融。
若样本中CEA含量大于500 ng/ml,请用生理盐水稀释后再测量。
3.试剂
本科室使用苏州新波生物技术有限公司癌胚抗原(CEA)时间分辨免疫荧光法诊断试剂盒,试剂盒主要组分如下:
a. 癌胚抗原参考标准品:1套,6瓶,1ml/瓶
A:0ng/ml; B:2.5ng/ml; C:5 ng/ml;D:16 ng/ml;E:107 ng/ml;F:530 ng/ml
b. 铕标记物:1瓶,1ml
c. 实验缓冲液:1瓶,30ml
d. 浓缩洗液:1瓶(40ml,使用前用去离子水作1:25倍稀释)
e. 荧光增强液:1瓶,30ml
f. 微孔反应板:1块(12×8)
g. 吸头:20支
h. 说明书:1份
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4.仪器(用户自备)
4.1 时间分辨荧光分析仪;
4.2 微孔洗涤机;
4.3 微孔振荡器;
5.操作步骤
5.1 试剂的准备
⑴洗涤液:将40ml浓缩洗液和960ml去离子水在干净的洗液瓶中混合,作为工作洗涤液备用。
⑵铕标记:使用前一小时内,用实验缓冲液按1:50稀释铕标记(详见操作流程图)。
5.2 将实验缓冲液、标准品、待测样品和所需数量的微孔反应条平衡至室温(20~250C)。
5.3 吸取25μl的标准品和样品,按顺序加入相应微孔。
5.4 在各微孔内加入200μl已稀释的铕标记溶液,在室温下慢速振动120分钟。
5.5 洗板6次,将板条在洁净的吸水纸上拍干。
5.6 在每个微孔内加入200μl的增强液,慢速孵育5分钟。
5.7 确定微孔反应条已固定在时间分辨荧光测定仪上,开始检测。
6.结果判断:
6.1结果测定
用本公司ANYTEST2000时间分辨荧光测定仪或WALLAC公司时间分辨荧光测定仪(1230、1234、1420)测量时,检查程序的参数是否如下所示。如不符,请修改。
ASSAY TYPE(分析类型):IFMA(时间分辨免疫荧光分析法)
FITTING METHOD(曲线拟和方式):PLINE SMOOTHED(平滑样条函数)
X-AXIS(X轴):LOG
Y-AXIS(Y轴):LOG-B
BLANKS(背景孔数):2
STANDARDS(参考标准点):5
STANDARDS REPLICATES(参考标准点复孔数):2
STANDARD CONC(参考标准点浓度):2.5
STANDARD CONC(参考标准点浓度):5
STANDARD CONC(参考标准点浓度):16
STANDARD CONC(参考标准点浓度):107
STANDARD CONC(参考标准点浓度):530
UNKNOWN REPLICATES(待测样品孔数):1
6.2结果判读:用本试剂盒对135份正常人血清进行检测,癌胚抗原测量值范围为0.3-5.5ng/ml。建议各实验室建立自己的正常值范围。
7.临床意义
CEA是一种分子量为180~200kD的糖蛋白,主要存在于消化道上皮组织、胰腺和肝脏,胎儿和成人消化道也产生少量CEA,但分泌到胃肠道而排出体外,而癌细胞分泌的CEA则进入淋巴液和血液。另外,CEA也见于羊水和胆道、肺、乳腺等组织。CEA检测的临床意义主要在于:
1) 恶性肿瘤的辅助诊断。不少恶性肿瘤,特别是胃肠道恶性肿瘤、肺癌、乳腺癌患者,其血清CEA浓度常见明显升高。
2) 病情预后和判断。肿瘤患者血清CEA含量增高程度常与肿瘤转移有一定关系,如:肺癌伴有肝转移时其中约85%可见CEA升高。
3) 疗效评估和预报复发。肿瘤患者经手术切除、抗癌药物治疗或放疗后病情好转时,血清CEA浓度一般逐渐降低;当治疗效果不佳时,CEA浓度不下降或升高。
4) 对肿瘤分期和病变程度的判断。如:血清CEA阳性与乳腺癌分期有关,Ⅰ期约14.8%阳性,Ⅳ期约73%阳性。
5) 与AFP联合检测用于肝癌的辅助诊断。部分继发性肝癌可见血清AFP检测呈阴性而CEA检测呈阳性的现象。
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8.参考值
癌胚抗原测量值范围为0.3-5.5ng/ml。建议各实验室建立自己的正常值范围。
9.注意事项
9.1 理解说明书,不要混用不同批号的试剂,不要使用过期的试剂。
9.2 尽量建立一个干净无尘的实验室环境,对实验的成功起到决定性作用。(因为尘土中含有很多金属离子,会影响实验结果)。
9.3 试剂盒与被测样本使用前必须达到室温。
9.4 振荡器按照《2510变频振荡器标准操作规程》设定需要的振荡频率。
9.5 微孔洗涤机按照《Egate2310全自动微孔洗涤机标准操作规程》在每天使用前应进行校正注液量和残自量,注意管道是否畅通。洗涤时,确认每孔必须是干的,洗涤液都注满微孔。洗涤后,每个孔必须是干的,如果仍有水则需拍干。
9.6 吸取增强液和铕标记物时,请使用干净的吸头,避免尘土等不必要的污染。加增强液时探头应悬空,避免碰到小孔边缘或其中试剂。
9.7 使用医用蒸馏水或去离子水配制洗液。
9.8 宜用干净的一次性容器配制铕标记物,应避免铕标记稀释液进入标记物原液中。
9.9 封片不能重复使用。
9.10 如需稀释标本,请用小牛血清稀释。
9.11 所有的样本和本试剂盒应作为潜在的传染原看待,按传染病实验室检查规程操作。
9.12 如对实验结果有疑问,应重复试验。
9.13 胆红素800u mol/L,甘油三脂20 mol/L,血红蛋白18g/dl对本试剂盒无干扰作用。
9.14 本试剂盒应置2—8℃保存,有效期参照瓶上所贴标签。
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