首页 干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,当它再作用于其他细胞时,使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力

干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,当它再作用于其他细胞时,使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力

举报
开通vip

干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,当它再作用于其他细胞时,使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,当它再作用于其他细胞时,使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力 重组鸭 α-干扰素基因的原核表达条件研究 生物科学2002级 张 瑶 指导教师 程安春 教授 +摘 要: 为了确定鸭重组干扰素基因工程菌BL21(DE3)/pET32a(DuIFN-α)的最佳表达条件~ 本实验对影响原核表达的IPTG使用浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度 及培养基进行优化,并利用抗性筛选对质粒稳定性进行了研究。诱导DuIFN-α...

干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,当它再作用于其他细胞时,使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力
干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,当它再作用于其他细胞时,使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力 重组鸭 α-干扰素基因的原核表达条件研究 生物科学2002级 张 瑶 指导教师 程安春 教授 +摘 要: 为了确定鸭重组干扰素基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 菌BL21(DE3)/pET32a(DuIFN-α)的最佳表达条件~ 本实验对影响原核表达的IPTG使用浓度、诱导时期、收获时间、培养诱导温度、葡萄糖浓度 及培养基进行优化,并利用抗性筛选对质粒稳定性进行了研究。诱导DuIFN-α基因原核表达 的最佳条件是:培养基为TB+5g/L葡萄糖~培养温度和诱导温度分别为37?和30?~诱导时 OD为0.8,1.2~IPTG浓度为0.2mmol/L~诱导培养时间为4,5h。经优化~最终目的蛋白600 的表达量能高达45%,各种优化条件对质粒稳定性未见明显影响。 关键词: 重组鸭α-干扰素~原核表达~表达优化 Studies on the Prokaryotic Expression Conditions of Recombinant Duck Interferon-α Expressed in E.coli Zhang Yao Biological Science, Grade 2002 Directed by Cheng Anchun (Prof. Ph. D) Abstract: To determine the optimal condition for the expression of E.coli BL21(DE3)/pET32a+ (DuIFN-α), IPTG concentration, induction time, harvest period, growth temperatures, glucose concentration and culture medium were optimized in this study and plasmid stability was study by the screening of resistance. The optimal inductive conditions are as follows: The culture medium is TB+5g/L glucose; The culture temperature and the induction temperature are 37? and 30? respectively; ODis 0.8~1.2; The concentration of IPTG is 0.2mmol/L and the induction time is 600 4,5h. By optimizing way, the percentage of the aim protein expression can reach 45%, but there was no signal difference on plasmid stability by screening of resistance. Key words: recombinant duck interferon-α; prokaryotic expression; expression optimization 1 干扰素(Interferon,IFN)是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,其由多种氨基酸组成,不含核酸,不被DNA酶或RNA酶破坏,对蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和V-8蛋白酶)敏感,能使其它细胞获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。哺乳动物的干扰素分为?型和?型两类,?型干扰素主要包括α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、ω-干扰素(IFN-ω)。?型干扰素具有相似的结构并享用同一类受体,IFN-α、β、ω主要是对病毒感染产生应答,诱导机体抗病毒蛋白的产生。?型干扰素又称免疫干扰素即γ-干扰素(IFN-γ),其受体与?型干扰素不同,对免疫系统有调节作用。在抗病毒方面,IFN可诱导几种抗病毒蛋白的产生 。其中研究得最为清楚的是2-5A合成酶,它催化一种特殊的寡核苷酸使一种干扰素诱导的潜伏的内切核酸酶RNaseL发生活化而产生降解病毒RNA的能力。另一种是dsRNA依赖的蛋白激酶PKR,它能灭活一种参与mRNA翻译的肽起始因子eIF2,抑制病毒蛋白的合成。这两种蛋白质都具有广谱的抗病毒作用。 [1]1957年,Isaacs和Lindenmann研究禽流感病毒时在鸡胚绒毛尿囊膜中发现了干扰素。之后,对干扰素的研究多集中在人类和哺乳类动物,并不断取得突破性进展。迄今为止,已有多种禽类干扰素基因被克隆和表达,但在禽类中目前只发现了IFN-α,IFN-β和IFN-γ。在对鸡 [2]干扰素的研究表明:鸡IFN-α在抗滤泡性口炎病毒,劳斯肉瘤病毒,新城疫病毒,传染性法式囊病病毒,传染性支气管炎病毒,马立克病毒和禽流感病毒等方面都有显著效果。然而,IFN的活力具有相对的种属特异性,即某一种属动物(或组织细胞)产生的IFN只能对同种属或种属非常接近的动物或细胞有保护力。许多年来对鸭干扰素的研究一直落后于其他干扰素。随着养鸭业的迅速发展,许多鸭的病毒性疾病如鸭瘟、病毒性肝炎等对养鸭业造成了严重的危害,并伴随着许多新的病毒性疾病出现,寻找这样一种广谱抗病毒药物已成为保障养鸭业健康发展的迫切要求。 对鸭干扰素的研究起步于1995年,Schultz等从绿头野鸭的基因组中克隆了α-干扰素基因(DuIFN-α),并通过细胞病变抑制法测定了其对流感病毒、水疱性口炎病毒和新城疫病毒等 、[34]的抗病毒活性,还表现出了对原代鸭胚肝细胞中DHBV复制的强烈抑制作用。从这以后干扰素在鸭病毒性疾病防治中展现出了积极前景。近几年国内学者对鸭α-干扰素也有了一定的研究,阮小飞,叶伟成等分别在对北京鸭α-干扰素和绍兴鸭α-干扰素的研究中表明了它有抗猪水 、[56]疱性口炎病毒及鸭瘟弱毒疫苗毒的活性。 我国是世界上饲养鸭数量最多的国家,其中麻鸭的饲养量占60,以上,因而对麻鸭 IFN-α 2 进行研究具有重要意义。干扰素的研究对构建动物干扰素基因重组疫苗,提高其免疫效力、降低病毒载体毒性以及基因工程重组干扰素作为抗病毒生物制剂等方面前景突出。为此,本实验室成功克隆构建了鸭干扰素原核表达载体,并进行了有效地表达。然而,在原核表达载体中,目的蛋白能否高效表达除了载体与表达菌株的良好匹配外,外界条件如诱导条件、培养基的营养成分,生长环境的温度、pH值和氧气含量以及诱导过程中质粒的稳定性等对表达也有着关键性的作用。为此,本实验旨在对已构建的鸭α-干扰素基因原核表达菌BL21(DE3)/ + pET32a(DuIFN-α)的培养条件进行研究,确定了鸭α-干扰素高表达的原核表达条件,为下游研究打下基础。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌种 + 重组大肠杆菌BL21(DE3)/ pET32a(DuIFN-α)由本实验室(四川农业大学动科院禽病防治研究中心)构建。 1.1.2 主要试剂及仪器 IPTG购自Takara公司;酵母抽提物,蛋白胨购自英国Oxoid公司;其余试剂均为国产分析纯。 LB液体培养基:胰化蛋白胨10g,酵母抽提物5g,NaCl 10g,溶于950mL双蒸水中,用lmol/L的NaOH调pH值至7.0,补加双蒸水至1000mL,高压灭菌。 LB+M9液体培养基:蛋白胨10g,酵母抽提物5g,NaC1 5g,NaHPO?12HO 12.6g,KHPO 242243g,NHC1 1g,1mol/L 的MgSO2mL溶于950mL双蒸水中,用lmol/L的NaOH调pH值至7.0,44 补加双蒸水至1000mL,高压灭菌。 TB液体培养基:蛋白胨12g,酵母抽提物24g,甘油4mL,溶于900mL双蒸水中,高压灭菌,冷却至60?加100mL灭菌磷酸钾缓冲液。磷酸钾缓冲液每升含KHPO23.1g,KHPO?3HO 24 242125.4g,高压灭菌。 固体培养基:在LB液体培养基中加入2%的琼脂,待冷却至50?时,加入终浓度100mg/L的氨苄青霉素混匀倾倒于平板上凝固后即为抗生素平板,不加氨苄青霉素的为普通平板。 3 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液:在900mL去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸(电泳级,pH8.3),然后加入50mL10%(w/v)的电泳级SDS储存液,用去离子水补至1000mL。 30%丙烯酰胺溶液:将29.2g丙烯酰胺和0.8gN,N/-亚甲双丙烯酰胺溶于60mL去离子水中,然后定容至100mL,并用0.45µm滤器过滤除菌,置棕色瓶中保存于4?备用。 10%SDS溶液:将10gSDS溶于水中,定容至100mL。 10%过硫酸铵:将1g过硫酸铵溶于水中,定容至10mL。 2×SDS 凝胶加样缓冲液:25mL 4×Tris-HCl(pH6.8),20mL甘油,4g SDS,2mL β-巯基乙醇,1mg溴酚蓝,加去离子水至100mL并混匀,置于4?保存。 SDS-PAGE(变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)蛋白染色液:将考马斯亮蓝R-250溶解于甲醇:水:冰乙酸,9:9:1的溶液中,配制成0.25,的浓度,待溶解完后用滤纸过滤备用。 SDS-PAGE(变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)蛋白脱色液:甲醇:水:冰乙酸,9:9:1。 TMBio-Rad公司凝胶电泳仪,Bio-Rad公司凝胶成像系统,SmartSpec3000核酸蛋白 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 仪。 1.2 实验方法 1.2.1 种子液的制备和DuIFN-α表达条件的优化 + 将冻存于-70?甘油管的工程菌BL21(DE3)/ pET32a(DuIFN-α)划线接种于抗生素平板上,37?培养至菌落长出。挑单菌落接种于5mL LB培养基中(所有液体培养基中均含氨苄青霉素200mg/L),37?培养过夜即为种子液。按以下条件采用递进方式优化。 1.2.1.1 IPTG浓度的优化 按1%接种量接种种子液于含4mL LB培养基的试管中,37?,190r/m,培养至OD为0.9600左右时加入终浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mM 的IPTG诱导至菌液OD基本稳定,分600别取样进行最终菌液OD的测定和SDS-PAGE蛋白质电泳,比较不同IPTG浓度对DuIFN-α表600 达的影响。 1.2.1.2 诱导时菌体密度的优化 按1%接种量接种种子液于含4mL LB培养基的试管中,37?,190r/m,培养至OD分别600为0.4,0.6,0.8,1.0和1.2左右时用终浓度0.2mM的IPTG诱导至OD稳定,分别取样进行最终600 4 菌液OD的测定和SDS-PAGE蛋白质电泳。 600 1.2.1.3 表达时间的优化 按1%接种量接种种子液于含4mL LB培养基的试管中,37?,190r/m,培养至OD为0.9600左右时加入终浓度0.2mM的IPTG诱导,分别于0.5h、1h、1.5h、2.5h 、3.5h 、4.5h 、6h 取样,进行SDS-PAGE蛋白电泳。 1.2.1.4 温度的优化 选择30?和37?作为温度控制条件。按表1组合对工程菌进行培养、诱导,取样测定菌液OD并进行SDS-PAGE电泳。 600 表1 工程菌培养、诱导的温度 优化条件(温度) 甲组 乙组 丙组 丁组 培养温度(?) 30 37 30 37 诱导温度(?) 30 37 37 30 1.2.1.5 葡萄糖添加浓度的优化 按1%接种量接种种子液于含4mL LB培养基的试管中,每支试管分别含终浓度为0、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L的葡萄糖溶液,37?,190r/m,培养至OD为0.9左右时加入600终浓度0.2mM的IPTG诱导,4h后取样测定菌液OD并进行SDS-PAGE电泳。 600 1.2.1.6 培养基的优化 按1%接种量接种种子液于分别含4mL LB、LB+M9、TB培养基的试管中,培养至OD600约为0.9时用终浓度0.2mM的IPTG诱导,表达4h后取样测定菌液OD并进行SDS-PAGE600电泳。 1.2.2 DuIFN-α重组蛋白的检测 取培养诱导后的工程菌液500μL,离心(8000r/min)3min,弃清液,向菌体中加入蒸馏水50μL和2×SDS凝胶加样缓冲液50μl,沸水中煮10min,离心(13000r/min)10min后,取上清液10μl进行12%SDS-PAGE(表2)蛋白电泳。利用考马斯亮蓝法染色,脱色,经Bio-Rad 凝胶成像系统扫描成像后用Quantity One软件分析百分含量。 5 表2 12%分离胶和5%浓缩胶的配制比例 成分 12%分离胶 5%浓缩胶 去离子水 1.6mL 0.68mL 1.5mol /LpH8.8Tris-HCl缓冲液 1.3mL 0.13 mL 30%丙烯酰胺溶液 2 mL 0.17 mL 10%SDS溶液 0.05 mL 0.01mL 10%过硫酸铵 0.05 mL 0.01mL TEMED 0.002 mL 0.001 mL 1.2.3 质粒稳定性检测 6分别按1.2.1各项条件,在诱导结束时对菌液作1.0×10稀释,取10μL分别点样于普通平板和抗生素平板,静置待菌液被吸收后置37?恒温箱中培养16小时后观察, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 各自的菌落个数。 1.2.4 放大培养 按1.2.1工程菌的优化条件,用2500ml三角瓶,装液量为500mL对工程菌进行放大培养,观察表达情况。 2 结果与分析 2.1 IPTG浓度对表达的影响 IPTG浓度在0.1-0.8mmol/L之间,表达量无明显差异,但IPTG浓度为0.2mmol/L时,重组DuIFN-α表达量略高。IPTG可明显抑制工程菌的生长,随着IPTG浓度的增加最终菌体浓度减少,见图1。 2.14 2.122.1 2.08OD6002.06 2.042.02 0.10.20.40.60.8 IPTG浓度(mmol/L) A B 图1 IPTG浓度对重组DuIFN-α表达的影响 A.重组DuIFN-α在不同浓度IPTG诱导后的SDS-PAGE;B.IPTG浓度对重组DuIFN-α终浓度的影响; (1~6IPTG浓度分别为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L) 6 2.2 诱导时菌体浓度对表达的影响 取不同菌体密度诱导的样品经SDS-PAGE分析,诱导时菌体浓度对表达有明显影响,见图2。在OD0.25,1.2范围内,表达量和最终菌浓度随诱导时菌体浓度的增加而增加,但是600 菌体浓度超过1.2时表达量下降。 335 30225 20相对含OD6001量(%)15 1005123456701234567 A B C 图2 诱导时菌体浓度对重组DuIFN-α表达的影响 A.不同菌液浓度诱导后的SDS-PAGE;B.不同诱导浓度DuIFN-α的最终相对含量;C.诱导时和最终菌液浓度 (1~7的诱导OD分别为0.25、0.47、0.59、0.81、0.95、1.12、1.35, 8为marker) 600 2.3 表达时间的影响 不同表达时间工程菌DuIFN-α表达的影响见图3。从图3可看出诱导4h后表达量达到高峰,占细菌总蛋白的42%。继续延长培养时间,菌体浓度有所增加但目的蛋白基本保持稳定。 50 40 30相对含量 (%)20 10 03456789 A B 图3 不同表达时间对重组DuIFN-α表达的影响 A.不同表达时间DuIFN-α的SDS-PAGE;B.不同表达时间DuIFN-α的相对含量 (1为marker, 2未诱导, 3~9的表达时间分别为0.5h、1h 、1.5h、2.5h、3.5h、4.5h、6h) 2.4 温度对表达的影响 不同培养、诱导温度对DuIFN-α表达的影响(见表3、图4):经过优化,30?培养30?诱导最高表达量为26.2%,最终菌体浓度为1.950;37?培养37?诱导最高表达量为30.4%, 7 最终菌体浓度为2.091;30?培养37?诱导最高表达量为27%,最终菌体浓度为2.062;37?培养30?诱导最高表达量为36.3%,最终菌体浓度为2.145。 表3 温度对表达的影响 优化条件(温度) 30?培养--30?诱导(A-D) 37?培养--37?诱导(E-H) 30?培养--37?37?培养--30? 诱导(W,X) 诱导(Y,Z) 编 号 A B C D E F G H W X Y Z 诱 导0.440 0.640 0.904 1.064 0.669 0.900 1.072 1.162 1.000 1.000 1.000 1.000 OD 600 最终1.630 1.600 1.950 2.051 1.672 1.894 2.070 2.091 2.043 2.062 2.145 2.145 OD 600 最终相 对含量15.8 20.5 26.2 25.8 23.2 25.7 30.2 30.4 25.3 27 31.5 36.3 (%) A.37?培养诱导的SDS-PAGE B..30?培养诱导的SDS-PAGE C.不同培养诱导温度的SDS-PAGE 1:1.5h A; 2:1.5h B; 3:1.5h C; 4:1.5h D; 1:1.5h H; 2:1.5h G; 3:1.5h F; 4:1.5h E 1,4:37?培养30?诱导 5:未诱导;6:4h A; 7:4h B; 8:4h C; 9:4h D 5:未诱导;6:4h H; 7:4h G; 8:4h F; 9:4h E 2,3:30?培养37?诱导. 2.535 3022537?30?相对含量1.52030?37?(%)15110最终OD6000.5500 D. 30?培养诱导和37?培养诱导的最终OD E. 30?培养诱导和37?培养诱导的最终相对含量 600 图4 培养诱导温度对重组DuIFN-α表达的影响 8 2.5 葡萄糖的添加浓度对表达的影响 LB培养基中添加葡萄糖对工程菌浓度和目的蛋白的表达量有明显影响,见图5。适量添加葡萄糖可提高表达产量,使目的蛋白表达量从18.4%提高到25.8%。随着葡萄糖浓度的升高,目的蛋白的表达量先升后降,最终菌液浓度下降,其中5g/L,10g/L葡萄糖的表达量较高。 302.5 252相201.5对 含151量最终OD600100.5(%)50 6543210654321 A B C 图5 葡萄糖浓度对重组DuIFN-α表达的影响 A.不同葡萄糖浓度的SDS-PAGE B.不同葡萄糖浓度下的最终OD C.不同葡萄糖浓度表达的相对含量 600 (1~6的葡萄糖浓度为25g/L、20 g/L、 15g/L、10g/L、5 g/L、0, 7未诱导, 8为marker) 2.6 培养基对表达的影响 通过SDS-PAGE分析表明在不同的培养基中目的蛋白的表达水平存在差异(见表4,图6),TB和LB+M9的表达水平高于LB,最终菌体密度以TB最高。 表4 不同培养基对表达的影响 培养基 最终OD600 相对含量(%) LB 2.053 36.8 LB+M9 2.215 42.8 TB 2.345 43.5 图6 不同培养基重组DuIFN-α表达的SDS-PAGE (1为marker; 2未诱导, 3、4为LB培养基, 5、6为TB培养基, 7、8为LB+M9培养基) 9 2.7 质粒稳定性检测 6 活菌计数观察在不同条件下的菌落数表明,在1.0×10稀释下点样10ul,抗性条件下的菌落数在10个左右,而非抗性条件下的菌落数在80个左右。各优化条件下抗性菌落数量无明显差别。 2.8 放大培养 按优化条件进行放大培养,菌体能高效表达与试管培养效果一致。 3 讨论与结论 3.1 大肠杆菌表达的影响因素 本实验采用的BL21(DE3)为蛋白酶缺陷菌株,在受T7lac启动子调控的原核表达系统中,诱导剂乳糖或乳糖类似物IPTG是表达的必要条件。在IPTG的诱导下,宿主菌能产生大量的T7RNA聚合酶,后者可特异性地识别pET表达载体中的T7强启动子序列,从而高效表达目的 [7]重组蛋白。外源基因的表达主要受内因的控制,同时也要受一些其他的外界因素影响,如诱导剂的浓度、诱导的时机、葡萄糖浓度的控制、培养基的选择、pH值及溶氧调节等。 3.1.1 IPTG的影响 诱导剂IPTG的添加量是原核表达中的一个基本条件。诱导剂浓度较低时,最终菌体浓度和目的蛋白的表达水平各自保持在一定范围内;浓度超过一定限度就会影响菌体代谢及蛋白表达水平,使最终菌体浓度随诱导剂浓度的升高而下降。本实验中,IPTG的浓度从0.1,0.8mmol/L对目的蛋白的表达没有明显的影响,但是IPTG浓度与最终菌体浓度有直接的关系,高浓度的IPTG要抑制菌体数量的增多,IPTG为较低浓度0.1mmol/L时最终OD为2.13,IPTG600为较高浓度0.8mmol/L时最终OD为2.06,并在低浓度和高浓度之间呈逐渐下降趋势。说明600 低浓度IPTG足以使启动子完全开放,而且目的蛋白的表达主要是在诱导后的前中期,IPTG对大肠杆菌具有毒害作用,而高浓度的IPTG可能会使细胞毒害致死,表现为最终OD的降600低。 3.1.2 诱导时期的影响 诱导时菌体密度的高低是影响目的蛋白的表达水平的重要因素之一。一般诱导时期在菌 [8]体的对数生长期或对数中后期。本实验中,将菌体OD控制在0.8,1.2时诱导可获得较高600 10 而稳定的表达量。当OD低于0.7时诱导,此时菌体数量还非常有限,诱导后重组菌的状态600 由生长转为目的蛋白的表达,极大地影响了表达菌体的繁殖和表达数量,最终菌体收获量及蛋白表达量过低;当诱导时OD极大高于1.2,菌体生长过度而开始老化,同时环境的恶化,600 引起菌体表达状态下降,表达目的蛋白的量也减少。 3.1.3 表达时间的影响 诱导后的持续表达时间也是原核表达的基本条件。本实验表明,菌体在诱导后0.5h内就有少量表达,0.5h~1h表达量增加较快也较多。这一阶段是菌体表达的主要时期,大量的菌体从生长转化为表达目的蛋白,但是2.5h,4h表达量就基本稳定了。4h后产生的大量的目的蛋白积累在菌体内,严重干扰了重组菌的正常代谢,可能造成菌体的相继自溶,菌体细胞裂解释放出生成的包涵体,裸露的蛋白质极易被降解,导致最终蛋白含量反而会下降。同时菌体浓度仍在升高,可能是由于携带质粒的菌大量死亡,同时氨苄青霉素的失效而失去了抗性筛选作用,不含质粒的菌得以正常生长,因而不带质粒的菌体占了总菌的极大部分。 3.1.4 培养温度的影响 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。温度对菌体的生长和表达是一个综合作用的因素,高温和低温都有各自的优势和不足。在适合菌体生长的温度范围内,较高的温度使细菌代谢加快,有利于在短时间内提高菌体的生长密度,但是也会更快地积累代谢副产物,对菌体生长产生一定的抑制作用;较低的温度菌体生长更缓慢,但是对产物的表达有利。因此在不同培养阶段采用不同的温度培养有利于让菌体浓度和目的产物的表达量达到 [9]一致,并可以缩短培养周期。 本实验中,37?培养37?诱导在表达量上要高于30?培养30?诱导的条件,这可能是由于在37?培养,菌体的生长速度较快,能在较短的时间内达到一定的浓度而且菌体较为年青,此时进行诱导有能力在短时间内大量的表达目的蛋白,但是局限在于菌体代谢快易衰老以及蛋白过早的积累在体内引起不良影响,导致表达时间不能持久,后期的表达量增加缓慢;30?培养菌体的生长较慢,达到诱导浓度所需的时间较长菌体易老化,诱导后表达的速度缓慢,虽然菌体代谢减慢衰老也减缓,对菌体的伤害较小,但是菌体在还未达到大量表达时就已经老化,整体表达量就少。基于以上条件,分别对培养温度和诱导温度进行重新组合,结果是37?培养30?诱导表达量远高于30?培养37?诱导,这种培养方式表明37?有利于菌体快速 11 [10][11]生长,30?诱导有利于目的蛋白的缓慢形成,使菌体得以长时间大量地表达。陈建梁等有与之相似的结果,即在不同温度下培养,大肠杆菌的最适生长温度为37?,较低的培养温度对于包涵体的表达有利。 3.1.5 葡萄糖的影响 培养重组大肠杆菌所使用的培养基多为半合成培养基,利用葡萄糖、蔗糖和甘油作为碳源, 在原核表达中一个关键因素就是对碳源的优化。葡萄糖是大肠杆菌可以直接利用的一种能源物质,在目前最为方便和常用。然而葡萄糖的浓度对副产物乙酸的产生及菌体的生长有很大影响。当葡萄糖浓度较高时,由于培养基中溶氧水平较低,糖代谢循着无氧酵解途径进行,使糖代谢中间产物乙酸大量积累,导致pH值降低,抑制菌体的生长而降低产物的获得量[12][13]。而培养基中糖浓度超过某一阈值,即使在氧充足条件下也会生成乙酸。有研究表明:培养基中糖初始浓度为5~10g/L左右时,可获得理想的表达效果。本试验中分别添加不同浓度的葡萄糖于LB培养基中,试验结果表明葡萄糖浓度在5~10g/L时有利于菌体生长和目的蛋白的表达,超过10g/L目的蛋白的表达量和最终菌体浓度都下降且pH值降低至6.4左右。低浓度的葡萄糖能为菌体提供丰富的碳源,浓度过高要产生不利于重组菌生长的环境。以甘油代替葡萄糖作为碳源则可减少代谢副产物——乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度表达和外源蛋白 [14]的表达。 3.1.6 培养基的影响 培养基的组成和各组分的浓度和比例对菌体生长及表达影响很大。高浓度的培养基会造成溶液渗透压过高,细胞脱水死亡;浓度过低不能保证大肠杆菌的正常生长。合适的培养基是各种成分均衡,其中较为重要的是碳源和氮源比例,比例偏小会导致菌体生长旺盛而造成 [15]菌体提前衰老自溶,比例偏大则菌体数量少,不利于产物的表达。培养基中的无机盐也有 [16]2+不可忽视的作用。重组菌的质粒稳定存在与无机盐有关。文献表明,流加Mg对稳定细胞质粒有积极作用。同时培养基中磷酸盐的含量能影响重组大肠杆菌表达质粒复制的速率和菌体生长,磷酸根浓度过低,不能满足菌体的生长需要,最终密度较低,浓度过高,早期菌体 [17]生长过于旺盛,导致其较早衰老,菌体密度仍不能达到很高。在对培养基的优化条件中,LB培养基缺少无机盐和有效的缓冲体系,难以保证菌体的大量生长和表达以及适应外界环境 2+的变化。LB+M9培养基中有丰富的碳源、氮源和无机盐,并且含有适量的Mg,对细菌的生 12 长和质粒稳定性有很大的影响。TB培养基中酵母提取物的含量大大超过了LB和LB+M9培养基,磷酸钾缓冲液体系减少了外界环境的影响,同时又以甘油作为碳源减少葡萄糖效应带来的影响。 3.1.7 其他影响因素 除了以上的因素外,对其它的一些条件的优化也有利于提高整体效果。溶氧对菌体生长及产物形成都是重要的因素。溶氧量往往与装液量有关,装液量过大,进入摇瓶中的空气量就少,在大肠杆菌进入对数生长期后,易造成溶氧不足;装液量过少,营养物质的量不足, [18]会减少目的蛋白的表达量。 摇床转速也直接影响到培养过程中培养基中的溶氧量,在本实验中试管装液量在4mL ,转速在190r/min左右能获得较高的表达量。稳定的pH值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。在生长过程中,大肠杆菌可利用葡萄糖产酸,特别是产生大量乙酸,使pH值显著降低。有文献表明在基质中加入不同浓度的葡萄糖可使pH值下降到 [19]6.8~5.4。维持有效的缓冲体系,低浓度的葡萄糖和溶氧量的关系,创造一个良好的生长表达环境。 3.2 影响质粒稳定性的因素 +质粒的稳定性与外源基因的表达有很大关系,本实验中重组表达质粒pET-32a不稳定的 +原因可能是目的蛋白对E.coli BL21(DE3)具有细胞毒性。pET-32a来源于pBR-322,pBR-322 +[20]源于ColE1。ColE1、pBR-322、pET-32a都失去了分配功能区par。而天然质粒具有功能区par,可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离,并均等的分配到子代细胞中去。功能 ++区par对质粒pET-32a的稳定性是不可缺少的。缺少功能区par的pET-32a质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去,无细胞毒性时约98% E.coli BL21(DE3)会带有质粒。表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21(DE3)不具有生长优势,一般条件下,带有重组质粒的宿主菌的生长速率低于无质粒的细菌,而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去,破坏溶液中的Amp。这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力,造成大部分 [21]新生细菌无质粒而无法表达目的蛋白。本实验用活菌计数结合抗性筛选的方法发现不到10%的细菌能在抗性环境中生长,而这与最高达40%以上的表达量而言是不能解释这一现象的。这可能是由于高表达后的菌体会失去生长功能,甚至造成菌体的裂解。尽管如此,外界 +环境条件也会影响质粒的拷贝数,如葡萄糖、NH等因子的限量供应以及pH值的变化都会4 13 引起质粒拷贝数的下降,这可能与添加缓冲对的TB和LB+M9培养基能提高表达有关。包含 严重毒性基因的质粒将在通过cAMP介导由lacUV5启动子去阻遏的λDE3溶原菌中失稳,增 加T7RNA酶的基础表达。在培养基中加入0.5,1%葡萄糖可以有效地阻遏基础表达,控制毒 [22]性基因的干扰作用。避免或延缓质粒丢失情况。就菌株和载体来说,有实验表明,对lac [23]启动子的诱导方式可以影响质粒的稳定性,用IPTG诱导比用乳糖更易导致质粒的丢失。同 时一些研究者认为诱导外源蛋白的表达会使质粒不稳定,这可能是由于外源蛋白对宿主菌产 、[2425]生毒性。 3.3 结论 诱导DuIFN-α基因原核表达的最佳条件是:在含有葡萄糖5g/L的TB培养基中,37?培 养至OD0.8,1.2时转为30?诱导,IPTG浓度为0.2mmol/L,诱导培养时间为4,5h,最终600 目的蛋白的表达量能高达45%。 参考文献 [1] Isaacs A, Lindanmann J. Virus interference, I: the interferon. Proc R Soc Ser B.1957,147: 258-267. [2] 夏春, 吴丹, 阮小飞. 禽类基因工程重组干扰素研究进展[J]. 动物医学进展, 2003, 24(4): 39-41. [3] Schultz U, Kock J, Schlicht HJ, et al. Recombinant duck interferon: α new reagent for studying the mode of interferon action against hepatitis B virus[J]. Virology, 1995, 212: 641-649. [4] Schultz U, Summers J, Stzeheli P, et al. Elimination of duck hepatitis hepatocytes [J]. Journal of Virology,1999, 73: 5459-5465. [5] 阮小飞, 林常有, 杨天耀等. 北京鸭干扰素-α基因的分子克隆与表达[J]. 中国兽医杂志, 2004, 40(12): 11-13. [6] 叶伟成, 张存, 王一成等. 绍兴鸭α-干扰素基因克隆、表达及活性测定[J]. 浙江农业学报, 2005, 17(3): 115-119. [7] 吴一凡, 张双全, 高秀玉等. 乳糖诱导pET载体表达重组蛋白的研究[J]. 南京师大学报, 2002, 25(1): 89-93. [8] 邹锋, 郝飞, 宋志强等. HSPC016基因重组工程菌发酵研究[J]. 第三军医大学学报, 2005, 27(7): 904-906. [9] 涂桂云, 李敏. 基因工程菌高密度发酵工艺研究进展[J]. 工业微生物, 2004, 34(3): 49-52. [10] J.萨姆布鲁克, D.W.拉塞尔. 分子克隆实验指南(下)[M]. 北京: 科学出版社, 2002, 8: 1234. [11] 陈建梁, 关怡新, 崔志芳等. 重组牛凝血酶原-2在大肠杆菌中的表达及包涵体的制备[J]. 浙江大学学 报(农业与生命科学版), 2005, 31(1): 32-36. 14 [12] 王海波, 申烨华, 秦芳玲等. 大肠杆菌生产重组人干扰素-γ培养基的研究[J]. 西北大学学报(自然科学 版), 2003, 33(2): 174-178. [13] 李寅, 陈坚, 伦世仪. 高密度培养工程菌生产谷胱甘肽[J]. 中国医药工业杂志, 1999, 30(1): 1-4. [14] 杨汝燕, 李民 陈常庆. 重组大肠杆菌YK537/pSB-TK高密度培养过程中有机酸的RP-HPLC快速分析 [J]. 工业微生物, 1998, 28(3): 30-33. [15] 刘文波, 柴同杰.大肠杆菌高密度发酵研究[J]. 动物科学与动物医学, 2001, 18(1): 27-29. [16] 阮文权, 李玉忠, 杨邱明等. 重组大肠杆菌生产人表皮生长因子的发酵条件[J]. 无锡轻工大学学报, 2001, 20(5): 489-492. [17] 徐皓, 李民, 阮长庚等. 高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究[J]. 工业微生 物, 1998, 28(2): 20-25. [18] 靳挺, 关怡新, 姚善泾. 人γ-干扰素基因工程菌培养条件的研究[J]. 浙江大学学报(工学版), 2003, 37(6): 724-728. [19] 柴家前, 陆庆泉, 沈志强. 大肠杆菌高密度发酵研究进展[J]. 中国预防兽医学报, 2000, 22(6): 471-473. [20] 叶勤. 现代生物技术原理及其应用[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2003, 8: 100. [21] 赵方庆, 唐志红, 林凡等. 表达rAPC大肠杆菌的高密度发酵及纯化产物的抑瘤活性[J]. 高技术通讯, 2003, 2: 29-33. [22] 张锐, 孙美榕, 欧阳红生等. 真核基因在pET系统中表达出现的问题与拟解决的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 [J]. 生物技术, 2004, 14(2): 62-63. [23] Mari YM, Espinosa AE, Ubieta R et al. Effect of the selection marker on the viability and plasmid stability of two human proteins with neurotrophic action expressed in Escherichia coli[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 258: 29-31. [24] Zhang L, Falla T, Wu M et al. Determinants of recombinant production of antimicrobial cationic peptides and creation of peptide variants in bacterias [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 247: 674-680. [25] Tierny Y, Hounsa CG, Hornez JP. Effects of a recombinant gene product and growth conditions on plasmid stability in pectinolytic Escherichia coli cells[J]. Microbios, 1999, 97: 39-43. 致 谢 本文是在导师程安春教授和汪铭书教授的悉心指导下完成的。两位老师在繁忙的教学和科研工作中抽出许多宝贵的时间和精力对实验的选题、实验 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 以及论文写作等许多细节均进行了细致的指导,在此忠心地向他们表示感谢。同时也感谢师兄龚永强和师姐杨梅在实验中给予我的帮助。 最后要感谢我的家人和朋友在我的学习和生活中给予我的鼓励和无微不至的关心。 15 16
本文档为【干扰素是在特定的诱导剂作用下,由细胞产生的一种具有高度生物学活性的糖蛋白,当它再作用于其他细胞时,使其它细胞立即获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
该文档来自用户分享,如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服,我们会及时删除。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
下载需要: 免费 已有0 人下载
最新资料
资料动态
专题动态
is_321635
暂无简介~
格式:doc
大小:95KB
软件:Word
页数:24
分类:
上传时间:2017-11-27
浏览量:141