苞叶雪莲粗提物对EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用.doc

苞叶雪莲粗提物对EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用.doc 苞叶雪莲粗提物对EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作 用 摘要:通过确定Na2S2O4对EA.hy926细胞造成缺氧损伤的最佳浓度和时间点建立缺氧损伤模型，以只加Na2S2O4为对照组，添加不同浓度的苞叶雪莲(Saussurea obvallata)粗提物，从细胞形态和细胞生存率两个方面 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 其抗缺氧作用，分析苞叶雪莲粗提物对Na2S2O4造成EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用。结果表明，苞叶雪莲粗提物从1.25 mg/mL浓度开始呈剂量依赖性的增加了缺氧模型组中EA.hy926细胞的相对存活率，在10 mg/mL浓度下与Na2S2O4模型组相比，极显著增加了细胞存活率，是缺氧模型组的6.3倍，表明苞叶雪莲具有很强的抗缺氧损伤能力。 关键词: 苞叶雪莲(Saussurea obvallata);EA.hy926细胞;缺氧损伤 中图分类号:R282 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2016)01-0167-03 DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.044 高原环境因其海拔原因具有气压低、氧气稀薄、空气干燥、气候寒冷、紫外线照射强烈等一系列恶劣条件，并随着海拔的升高这些条件进一步恶化，为高原地区人们的生活、工作及身体健康造成负面影响。目前，国内外学者普遍认为，长期暴露在缺氧环境中会对人的认知功能产生一些影响，如感知觉、记忆力、思维力和注意力的下降等，并且对情绪情感和心 理运动能力都有负面反应[1]。苞叶雪莲(Saussurea obvallata)是菊科风毛菊属的植物。分布在印度、锡金、尼泊尔、克什米尔以及中国大陆的云南、甘肃、四川、西藏、青海等地，生长于海拔3 200,4 700 m的地区，在藏药中用于治疗癫狂、中风、脑溢血和偏瘫等神经性疾病[2]，现在学者认为苞叶雪莲水提物对小鼠的免疫系统和生殖系统及整体水平具有辐射防护作用[3-5]。本试验通过确定连二硫酸钠(Na2S2O4)对EA.hy926细胞造成缺氧损伤的最佳浓度和时间点建立缺氧损伤模型，以只加Na2S2O4为对照组，添加不同浓度的苞叶雪莲粗提物，从细胞形态和细胞生存率两个方面检测其抗缺氧作用，探讨苞叶雪莲粗提物是否具有对Na2S2O4造成EA.hy926细胞缺氧损伤的保护作用，为进一步细分该药中抗缺氧具体成分奠定基础和参考依据。 1 材料与方法 1.1 细胞株 EA.hy926细胞株购于中国科学院上海细胞库。 1.2 药材与试剂 苞叶雪莲粗提物:苞叶雪莲于2013年8月采自青海省贵德县，经青海省食品药品检验所藏药室骆桂法研究员鉴定，为菊科风毛菊属苞叶雪莲全草。将采集的苞叶雪莲研磨成粗粉经90%乙醇热回流提取，提取液浓缩至流浸膏(相当于10 g/mL生药)，使用时用生理盐水稀释;连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、三氯乙酸(TCA)，国药集团化学试剂有限公司;培养基(DMEM)、96孔板、培养瓶，Corning公司;胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶[0.25% Trypsin-EDTA(1×)]，Gibco公司;二甲基亚砜、磺酰罗丹明B (SRB)，Sigma公司。 1.3 试验方法 1.3.1 细胞的培养 复苏EA.hy926细胞，置于37 ?，5% CO2湿度饱和的培养箱中，用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基培养，0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化，在细胞处于对数生长期时进行试验。 1.3.2 缺氧模型的建立 将EA.hy926细胞10 000,20 000/孔接种于96孔板中，检测Na2S2O4造成细胞缺氧状态的最佳浓度，Na2S2O4可以很快清除缓冲液里的氧，使溶液氧含量为零。Na2S2O4用生理盐水配制成100 mmol/L母液，参考文献[6-9]以终浓度8 mmol/L为首浓度，2倍稀释，共做7个浓度，作用24 h。IncuCyte镜下观察细胞形态，用SRB法计算不同浓度的Na2S2O4对EA.hy926细胞的抑制率及半数抑制浓度IC50。首先，弃去培养基，每孔加100 μL浓度为30%的预冷TCA，置于4 ? 1 h固定细胞，用去离子水洗涤5次后，晾干，之后每孔加入100 μL浓度为0.04 mg/mL磺酰罗丹明B(SRB，1%冰醋酸配制)染色15 min，染色结束后用1%冰醋酸洗涤5次，去除未与细胞结合的SRB，晾干，最后每孔用10 mmol/L的Tris-base溶液150 μL溶解染料，置于摇床上至染料完全溶解均匀后，用酶标仪在560 nm波长下读取OD560 nm，抑制率=(对照组OD560 nm -给药组OD560 nm)/对照组OD560 nm×100%。IC50通过四参数曲线拟合法计算。通过以上结果选定最佳破坏剂量和时间，拍照记录，选定模型浓度，用以进行后续试验。 1.3.3 细胞分组及检测 检测苞叶雪莲粗提物对缺氧状态下细胞的保 护作用，将EA.hy926细胞10 000,20 000/孔接种于96孔板中，细胞分为三组，阴性对照组、缺氧模型组和加药组。加药组加入苞叶雪莲粗提物，以10 mg/mL为首浓度，2倍稀释，共8个浓度，粗提物用二甲基亚砜(DMSO)溶解后用生理盐水稀释成试验所需浓度，加药后确保DMSO终浓度<0.1%，加入96孔板中预孵育2 h后，加入8 mmol/L的Na2S2O4建立细胞缺氧模型，作用24 h。IncuCyte镜下观察细胞形态学变化并拍照记录。达到最佳破坏时间后用SRB法检测细胞的相对存活率，相对存活率=给药组或缺氧模型组OD560 nm /阴性对照组OD560 nm×100%。 1.4 数据分析 试验数据以均数?标准差(x?s)表示，采用SPSS 19.0统计软件分析结果，组间差异采用两样本均数比较t检验，P 2 结果与分析 2.1 Na2S2O4对EA.hy926细胞存活的抑制结果 在EA.hy926细胞中加入不同浓度Na2S2O4作用24 h后，高浓度组细胞形态发生了明显的变化，细胞停止增殖、细胞膜皱缩、细胞形态不规则、部分细胞悬浮未贴壁、黑色代谢产物增加等(图1)。与对照组相比，细胞的生存能力剂量依赖性的减弱，说明Na2S2O4对EA.hy926细胞的增殖具有抑制作用，用SRB法检测抑制率可以看出，当Na2S2O4浓度降到2 mmol/L以下时，对细胞无明显的抑制作用(表1，图1)。根据不同浓度抑制率做四参数曲线拟合计算出Na2S2O4的IC50为3.021，表明在3 mmol/L Na2S2O4 下抑制了50%细胞的生存能力，因此在实际过程中选用大于IC50的浓度8 mmol/L进行后续试验，抑制率为88.81%，可以更大程度地体现出苞叶雪莲粗提物的保护作用。 2.2 苞叶雪莲粗提物对Na2S2O4造成细胞缺氧的保护作用 在EA.hy926细胞上用8 mmol/L Na2S2O4造成缺氧模型之后，加入不同浓度的苞叶雪莲粗提物，从细胞存活率和细胞形态两个方面观察其保护作用。苞叶雪莲粗提物10.00 mg/mL浓度下可极显著增加缺氧细胞的存活率(P<0.01)，与对照组相比的相对存活率是缺氧模型组的6.3倍，说明在该浓度下缺氧导致的细胞凋亡和增殖抑制这些负面作用被苞叶雪莲粗提物大部分中和，与缺氧模型组相比具有极显著差异(表2)。5.00、2.50 mg/mL苞叶雪莲粗提物可以保护细胞，与缺氧模型组相比，相对存活率增加，差异达到显著水平(P<0.05);当苞叶雪莲粗提物浓度下降到1.25 mg/mL以下时，保护作用不明显。 从细胞形态学变化上观察，苞叶雪莲粗提物可剂量依赖性地保护细胞，免于缺氧造成的细胞凋亡、萎缩、增殖抑制，其中10.00 mg/mL浓度下保护作用最为明显，细胞形态基本完整，悬浮较少，细胞代谢产物相对减少，细胞融合率显著增加。降低浓度后苞叶雪莲粗提物仍可以保护细胞形态完整，这种保护作用在0.08 mg/mL浓度下仍可从拍照图片中观察出(图2)。 3 小结 苞叶雪莲粗提物从1.25 mg/mL浓度开始呈剂量依赖性地增加了缺氧模型组中EA.hy926细胞的相对存活率，在10.00 mg/mL浓度下与Na2S2O4模型组相比，极显著增加了细胞相对存活率，是缺氧模型组的6倍以上，表明苞叶雪莲具有很强的抗缺氧损伤能力。这一结果在动物试验中已经初步得到了验证，其主要作用成分值得进一步分化探讨，力求得到抗缺氧有 效的单一组分，在临床应用中明确其成分，确定使用剂量和安全性。 参考文献: [1] 杨国愉，冯正直，汪 涛.高原缺氧对心理功能的影响及防护[J]. 中国行为医学科学，2003(4):116-118. [2] 田淑琴，张 琦，刘述皇，等.苞叶雪莲的药理研究[J].中药新药 与临床药理，1998(3):42-43，64. [3] 毕良文，李文辉，段 伟，等.苞叶雪莲水提物对辐射损伤小鼠防 护作用的研究[J].现代肿瘤医学，2009，17(7):1218-1221. [4] 郭 娜，李文辉，张国良，等.苞叶雪莲水提物对小鼠生殖细胞辐 射防护作用的研究[J].中国辐射卫生，2010(4):394-396. [5] 张国良，李文辉，郭 娜，等.苞叶雪莲水提物对小鼠免疫系统辐 射防护作用的研究[J].中国辐射卫生，2011(2):135-136，139. [6] 许蜀闽，王培勇，马红英.连二亚硫酸钠在建立培养细胞的无氧 环境中的应用[J].第三军医大学学报，2005(4):359-360. [7] 胡海燕，崔志慧，陈 翔，等.清心开窍方含药脑脊液对连二亚硫 酸钠所致PC12细胞损伤的保护机制研究[J].中国中药杂志，2013(9): 1314-1317. [8] SUN J， LI Y Z，DING Y H，et al. Neuroprotective effects of gallic acid against hypoxia/reoxygenation-induced mitochondrial dysfunctions in vitro and cerebral ischemia/reperfusion injury in vivo[J].Brain Research， 2014，1589(17):126-139. [9] AHN K，PAN S， BENINGO K，et al. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells[J].Life Sciences，1995，56(26):2331-2341.