医学实验动物学
——实验设计
姓名:骆成林
班级:2015级4班
专业:外科学(普外)
学号:406521215102
日期:2016年6月5日
肝癌的诊断检测及抗肿瘤药物研究
一、立
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
依据(研究背景、立题意义)
(一)研究背景
肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。据世界卫生组织2002年数据显示,全球每年新增病人约63万例,死亡人数约60万人,为癌症第三号杀手。我国年发病人数约35万,每年约有32万人死于此病,发病率和死亡率均占癌症中的第二位。HCC高死亡率的原因是早期转移和复发,尤其是HCC根治性切除术后的高复发率严重影响肝癌总体外科疗效。国内外较大系列的临床资料表明HCC术后的3年复发率为40% ~50%左右。肝细胞癌(HCC)是我国常见恶性肿瘤之一,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第三位,仅次于胃癌和食管癌。其发病率有上升趋势,严重危害人类健康与生存。
(2)、立题意义
和大多数恶性肿瘤一样,肝癌的发生是一个多因素多基因综合调控的过程。本实验通过对肝癌细胞CuZn-SOD的mRNA及其蛋白表达水平的检测,帮助临床对肝癌的诊断,并讨论青蒿素对肿瘤细胞的抑制作用从而指导临床治疗用药。
二、实验内容及方法步骤
(一)、大鼠肝癌模型的制备及观察研究
1. 实验材料与方法
1.1 实验动物与药品 ①动物 清洁健康的SD大鼠150只,体重150-200g。所有大鼠分别分笼单独饲养,给予相同
标准
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化光照,自由进食,定期打扫鼠笼,适应环境7天。之后全部大鼠按随机抽样法分为实验组(135只)和对照组(15只)。 ②方法 实验组饲以含DEN的饮水,连续喂养12周后改为自由饮水。对照组,常规自由饮水。每天观察动物的精神状态、饮食状况及背毛的变化等一般情况。于实验第4、8、12、16、18、20、22、24、25周,随机抽取模型组动物各10~ 15只,打开腹腔, 大体观察暴露肝脏, 记录肝脏的形态、颜色、质地。 1.2 常规切片制备与HE染色
1.2.1 主要试剂及设备 (1)常用试剂:① 0.01mol/L PBS溶液(PH:7.2-7.4);② 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液; ③4%多聚甲醛;④HE染(苏木精和伊红染液);⑤石蜡;⑥蒸馏水;⑦各浓度的酒精;⑧二甲苯;⑨戊二醛固定液等。 (2)设备:光学显微镜;制片机;刀台;超薄切片机;恒温烤片机;大中号毛笔;水浴箱;载玻片和盖玻片等。
1.2.2 切片制备 (1)取材与固定:分别选取实验组大鼠肝癌细胞和对照组大鼠肝脏细胞,一般切取组织块为0.2~0.3cm,用4%多聚甲醛固定液将所取标本固定24小时,以便观察研究所用。 (2)洗涤与脱水:用蒸馏水将渗入标本中的固定液洗去,再用90%、80%和70%酒精脱去组织中的水分。 (3)透明与浸蜡 (4)包埋与切片:用石蜡包埋组织,切片前的一般准备工作包括①石蜡组织切片机(或冰冻切片机)和恒温烤片机的调试;②大中号毛笔、切片刀的准备(必须保证切片刀锋利)等一般组织细胞学制片所必须充分准备的工作;③还需要对载玻片和盖玻片进行特殊处理。 (5)贴片和染色:将已切妥的切片放于温水中铺平,稍晾干后再烤片。 (6)封片:染色后用胶封片。
1.2.3 HE染色 石蜡切片染色程序:①切片脱蜡、二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5~10分钟;②无水乙醇5分钟;95%乙醇ⅠⅡ各5分钟;④75%乙醇 5分钟;⑤染细胞核(苏木素)3~5分钟;⑥水冲洗5~10分钟;⑦染细胞浆(伊红)1~2分钟;⑧95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5分钟;⑨二甲苯透明;⑩封片贴号。
1.2.4 分别用光学显微镜下观察实验组和对照组切片 结果预测: (1)肉眼病理观察:实验组肝脏体积明显增大,重量显著增加,表面不满大小不一、形态各异的结节;对照组肝脏无异常。 (2)光镜下观察病理切片:实验组可见肝细胞排列呈巢状,分化程度差异较大,血管多,间质少。癌细胞大小不一,形态各异。对照组肝细胞形态正常。 (二)、检测CuZn-SOD的mRNA表达水平和蛋白表达水平
CuZn-SOD可能是肝癌发生的相关基因之一,它在mRNA水平和蛋白水平的表达下降和肝癌的发生发展可能互为因果。肝癌细胞中CuZn-SOD的mRNA和蛋白表达水平均应明显低于癌旁组织,并且分化较低的肝癌组织的蛋白表达水平下调更显著。
1.1 实验动物与药品 (1)实验动物:大鼠肝癌模型 (2)药品:Trizol 试剂;链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化染色( SP) 试剂盒
1.2.1 借助于逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测肝癌细胞中的CuZn-SOD的mRNA的 基因表达水平。
1.2.2 分别选取实验组与对照组大鼠的肝脏组织细胞进行RT-PCR测序及免疫组织化学
分析
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①用Trizol 试剂经一步法提取组织总RNA, 再经RT-PCR合成cDNA。以管家基因B-actin作为内参照,后用凝胶成像分析系统进行半定量分析。 ②免疫组织化学染色 即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化染色( SP) 试剂盒进行免疫组化结果判断及半定量分析。 ③统计学处理。
(三)、实验讨论青蒿素对肿瘤细胞生长的抑制作用
青蒿素是我国首先发现的新构型的抗疟药,体内代谢活性产物为双氢青蒿素,抗疟活性高,毒性小。药动学研究证实青蒿素类药物在体内吸收快,分布广,排泄快。近年来发现青蒿素及其衍生物具有明显的抗肿瘤活性。
①提取实验组小鼠肝癌H22细胞株,进行传代培养,之后分瓶为新的实验组、阳性对照组和阴性对照组。
②向实验组培养液中加入青蒿素,阳性对照组中加入等量的丝裂霉素,阴性对照组不加任何试剂。
③细胞活力测定,分别计数三组培养瓶中的肝癌细胞数,根据计数结果,描绘细胞生长曲线。
④统计分析,针对计数结果进行统计学分析,尽量减少误差。
3、
动物实验模型设计
技术路线
青蒿素对肝癌的影响
检测CuZn-SOD的蛋白表达水平
检测CuZn-SOD的mRNA表达水平
分 析 实 验 结 果
四、实验预期结果
①大鼠肝癌模型制备成功;
②肝癌细胞排列呈巢状,分化程度差异较大,血管多,间质少。癌细胞大小不一,形态各异;
③肝癌细胞中CuZn-SOD的mRNA和蛋白表达水平均应明显低于癌旁组织;
④青蒿素对肿瘤细胞有抑制作用,青蒿素组肝癌细胞生长明显受到抑制。
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