【doc】水稻显性半矮秆基因对株高表达的影响及其对GA3的敏感性

【doc】水稻显性半矮秆基因对株高表达的影响及其对GA3的敏感性 水稻显性半矮秆基因对株高表达的影响及 其对GA3的敏感性 中国水稻科学(ChineseJRiceSci),2006,20(1):25,3O 水稻显性半矮秆基因对株高表达的影响及其对GA3的敏感性 程灿,.吴跃进,,刘斌美童继平吴敬德张瑛,吴瑾华袁勤3 (中国科学院安徽省离子柬生物工程学重点实验室,安徽合肥230031;0安徽省农 业科学院水稻研究所,安徽合肥230031;.上海市农业科 学院作物栽培育种研究所,上海201106;华中科技大学生命科学与技术学院,湖北 武汉430074~通讯联系人,E—mail:yiwu@ipp.ac.cn) ExpressionofPlantHeightandSensitivitytOGA3ofDominantSemi— DwarfingGeneinRice CHENGCan,,WuYue—jin,一,LiuBin—mei,TONGji— ping,WuJing-de,ZHANGYing一,WuJin—hua,YUANQin. (KeyLaboratoryofIonBeamB0Pg砌 PPrg,InstituteofPlasmaPhysics,ChineseAcademyofSciences,Hefei230031,China;Rice ResearchInstitute,AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei230031,China;.CropCultivationandBreedingInstitute,Shanghai AcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201106,China;CollegeofLzfeScienceandTechnology,HuazhongUniversityofScienceand Technology,Wuhan430074,China;Correspondingauthor,E-mail:yJwu@ipp.ac.cn) Abstract:Sixtallanddwarfnearisogeniclinesderivedfromadominantsemi— dwarfingmutantwerestudiedinplantheight traitsandsensitivitytoGA3.Theinternodeelongationwasinhibitedbythedominantsemi— dwarfinggene.Thelengthsfrom thebasalinternodetotheuppermostinternodeandthepaniclelengthindwarfnearisogeniclineswere97.2,53.3, 65.1,61.9and94.7ofthoseinthetallones,respectively.ComparedwithwildtypeY98148,dw arfmutantY98149 wasmuchmoresensitivetoGA3atboththeseedlingandadultstages,andshowedlowerendog enicGA3contentinplant,with about78ofthewildone. Keywords:semi—dwarfinggene;nearisogeniclines;sensitivity;gibberellin;rice 摘要:对具有显性半矮秆基因的6对高矮秆近等基因系的株高表达特性进行了比较.水稻显性半矮秆基因抑制了茎 秆节间的伸长,矮秆系倒4,5,3,2,1节及穗长分别为高秆系的97.2,53.3,65.1,61.9 和94.7.通过对Y98149 (突变体)和Y98148(野生型)在苗期和成株期对GA3反应的研究,发现Y98149较Y98148对外源赤霉素更敏感;内源赤霉素 测定结果显示显性半矮秆突变体内源赤霉素含量较低,是野生型的78. 关键词:半矮秆基因;近等基因系;敏感性;赤霉素;水稻 中图分类号:Q943;Q945.31;s511.O3文献标识码:A文章编号:i00i-7216(2006)01-0025—06 矮秆资源是水稻品种优良株型得以实现的基 础.2O世纪6O年代兴起的现代高产株型育种,几 乎全部与来源于低脚乌尖和矮仔占及其衍生系统的 半矮秆基因sd-1有关[1l.关于水稻隐性矮生性的 遗传,国内外进行了大量研究,发现了一些与sd-1 不等位的隐性矮秆基因[2|12].水稻显性矮生性的 研究也有一些报道[13,l4l.与隐性矮秆资源相比, 显性矮秆资源无论是数量还是研究利用都较为薄 弱,这与已发现的显性矮秆种质资源的显性作用不 强,综合农艺性状较差有关[1,2,,0,.吴跃进等在 离子束诱变的后代中,发现了1份半矮秆突变体 (Y98149),该半矮秆 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 的农艺性状优良,其矮生 性表达受1对显性核基因控制,无胞质效应[.16]. 一 般认为矮秆基因对植株高度的影响是通过植 物内源激素表达来实现的.Ogi等[17]以农林29为 轮回亲本,将台中在来1号,Shiranui(不知火),矮 脚南特和CPSLO等4个带有sd-1基因的矮秆材料 转育成半矮秆近等基因系,结果表明sd-1基因抑制 了茎秆基部几个节间的伸长,这主要是因为节间细 胞分裂受到了抑制.本实验通过对构建的6对显性 半矮秆基因的高矮秆近等基因系进行比较,明确显 性半矮秆基因对株高表达的影响,同时还就显性半 矮秆基因与内外源GA3的关系进行了研究,以探明 显性半矮秆基因的表达机制. l材料与方法 1.1近等基因系的构建 以粳型水稻显性半矮秆突变体(Y98149)为母 本,与不含显性半矮秆基因的品系4008S, ZH2006S,南京11,WPP99090及华粳籼74杂交, 采用单籽粒法,不断在各世代的分离群体中选择 收稿日期:2005—02—01;修改稿收到日期:200508—26. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3037863);安徽省自 然科学基金资助项目(01041103). 第一作者简介:程灿(1980一),男,硕士. 表1供试的近等基因系 Table1.Nearisogeniclinestested. 中国水稻科学(ChineseJRiceSci)第2O卷第1期(2006年1月) 代号植株高度来源组合代号植株高度来源组合 CodePlantheightOriginCodePlantheightOrigin T1高秆TaIlY98149/4008SD1矮秆DwarfY98149/4OO8S T2高秆TallY98149/ZH2006SD2矮秆DwarfY98149/ZH20O6S T3高秆TallY98149/南京11Y98149/Nanjing11D3矮秆DwarfY98149/南京11Y98149/Nanjiang11 T4高秆TaIlY98149/WPP99090D4矮秆DwarfY98149/WPP99090 T5高秆TallY98148/华粳籼74Y98148/Huajingxian74D5矮秆DwarfY98148/华粳籼74Y98148/Huajingxian74 T6高秆TallY98148(野生型)(Wildtype)D6矮秆DwarfY98149(突变体)(Mutant) 矮秆植株,经过多代自交和选择后,除株高外其他农 艺性状已稳定,在F6代的3:1株高分离株系中选 择高矮秆单株,分别种成株系,选择出的纯合矮秆系 和纯合高秆系即为高矮秆近等基因系. 2004年正季将6对高矮秆近等基因系按高矮 秆分区单株种植,密度为16.7cm×20.0cm,土壤 肥力均匀,以避免生长竞争影响矮秆近等基因系的 生长.在植株倒3节问开始伸长时,每隔2d取样 10株,测量倒3,倒2和倒1节间的长度,观察节间 的动态变化.成熟时收获中间行20株,逐株记载株 高,节间及穗长,采取成对数据比较t测验进行统计 分析.各高矮秆近等基因系分别用代号T和D来 表示,其来源如表1. 1.2外源G试验 (1)参照朱速松等[]的方法,将Y98149(突变 体)与Y98148(野生型)种子用0.1HgC12消毒5 rain,经自来水冲洗后,再用蒸馏水冲洗3次,室温 下浸种24h,然后放入垫有吸水纸的瓷盘中催芽24 h.挑选萌发整齐一致的种子播于垫有两层滤纸的 培养皿中,分别加入浓度为10,20,30,40和50rag/ kg的GA3溶液10mL.赤霉素购自上海丽珠东风 生物技术有限公司,效价900U/rag.先将1mg赤 霉素溶解于少量的酒精中,再溶于1kg的去离子水 中即为1mg/kg的GA3溶液.以加入等量蒸馏水 的作对照.隔2d加入各种溶液5mL,自然温光,3 次重复,处理7d后测量苗高,进行统计分析.苗高 增长率一[(处理一对照)/x~照]×100. (2)参照朱速松等E18]的方法,将19/6的琼脂倒 入消毒的瓷盘中,使其表面平整.挑选Y98149(突 变体)与Y98148(野生型)生长一致的种子各50粒, 播于同一瓷盘中.浇以20mg/kg的GA3溶液,以 浇等量的蒸馏水作对照,2d后每天测量苗高,进行 统计分析. (3)参照刘建昌等[19]的方法,将Y98149(突变 体)与Y98148(野生型)单株栽插,密度16.7cm× 20.0cm,在圆秆拔节期,分别喷100和200mg/kg 的GA3溶液,每品种每处理20株,另20株喷清水 作对照.成熟期逐株测量处理与对照株高,对其差 异进行测验. 1.3内源GAs试验 (1)参考文献E2o一22-1并加以改进.于圆秆拔节 期取地上部分,取样量为20g.样品用液氮低温粉 碎,以预冷的80甲醇抽提3次,滤液用石油醚萃 取3次,水相用旋转蒸发仪在45.C条件下浓缩,去 净甲醇与残留的石油醚,用1mol/LHC1调浓缩液 pH值在2.8,3.0,用乙酸乙酯萃取3次,于42?下 旋转蒸干乙酸乙酯,用5mL1009/5甲醇溶解残留 物,0.22m滤膜过滤,然后进行高效液相色谱分 析. (2)色谱条件参考文献E2o3.色谱仪:LCQad— vantage;柱子型号:PhenomenexKromasilC18 (150×4.6mm,5/tL);柱温:室温;流动相:甲醇一 2乙酸一水(体积比为40:40:20)2mL/min,恒流 洗脱;检测波长:254nm.上样量为20L.GA3标 准品购于Fluka公司. 2结果与分析 2.1高矮秆近等基因系间节间长度及穗长的比较 高矮秆近等基因系间最明显的差异是株高,6 对近等基因系平均株高相差31.22cm,高秆系的平 均株高为111.74em(变幅为108.3,114.4em),矮 秆系的平均株高为80.52cm(变幅为78.2,83.9 em),矮秆系只是高秆系的72.06(变幅为 68..1,74.36).观察6对近等基因系的地上 部5个节间.矮秆系倒4,5,3,2和1节间长度分 别为高秆系的97.2,53.3,65.19/5和61.9%,6 对近等基因系间倒3,2和1节间平均长度差异都达 分别为14.78cm,8.26cm,6.63 到极显着水平, cm,倒4,5节间缩短不是很明显(表2).总体上看 矮秆系的各个节间长度及穗长都有所缩短,它们对 程灿等:水稻显性半矮秆基因对株高表达的影响及其对GA.的敏感性 表2高矮秆近等基因系节间及穗长的比较 Table2?Comparisonbetweentallanddwarfnearisogeniclinesoninternndeandpaniclelengt h. ,一分别为0.05和0.01显着水平(,测定).下同. ,Significantat0.05and0.01levelsaccordingtot-test,respectively.Thesameasintablesbelo w 抑制株高的贡献率分别为0.9,21.2,26.4, 47.2,4.4,尤其是最上部3个节间缩短最为明 显,矮秆系的穗长为高秆系的94.7,与高秆系的 穗长很接近(图1). 2.2高矮秆近等基因系间倒3,2,1节间动态变化 比较 由图2可看出,高矮秆近等基因系节间伸长时 间差不多,高秆近等基因系节间伸长比矮秆近等基 因系节间伸长速率快,节间的伸长趋势总体为刚开 始慢,然后伸长加快,到停止生长之前又变慢.节间 在开始伸长时,基部的居间分生组织开始活跃分裂, 上部的细胞伸长,节间开始快速伸长,节间伸长到最 终长度的1/2时,细胞分裂停止,节间下半部的细胞 伸长仍在进行E23].一般认为矮秆基因的作用能直 接导致水稻植株形态学或细胞学的变化,如节间变 短,细胞个数减少,从而使植株变矮[24l.所以高矮 秆近等基因系节间伸长实际上是细胞分裂过程,高 矮秆近等基因系节间伸长之所以出现差异,可能是 水稻显性半矮秆基因抑制了节间细胞分裂强度.曼 蚤 堇 羹 一麓长PaaicleI?g血 目倒1节阅1stinternodefromthet0p 巴倒2节阅2udiatemodefromthe00p ?倒3节阅蜘internodefromthet0p 口偶扣5节问4-5thiaternodefromthet0p 高秆Tall矮秆Dwerf 图1高矮秆近等基因系的节间长度 Fig.1.Lengthsofinternodesfortallanddwarfnearisogenic lines. 2.3不同浓度的GAs对Y98149(突变体)与 Y98148(野生型)幼苗的作用 用不同浓度的GA3溶液处理Y98149(突变体) 与Y98148(野生型)幼苗,两者的苗高都显着增长, 方差分析结果表明,处理与对照相比,苗高增长都达 到极显着水平(表3),但Y98149(突变体)与 Y98148(野生型)幼苗对GAs的反应不同.经1O, 2O,3O,4O和50mg/kgGAs溶液处理的Y98149(突 变体)幼苗分别比对照增高了100.0,88.7, 172.3%,150.2和176.6,而Y98148(野生型) 增高幅度相对较小,分别为35.4,67.9, 82.5,83.9和87.8.Y98149(突变体)在各浓 度的GAs处理下的幼苗苗高增长率都大于Y98148 (野生型),即Y98149(突变体)较Y98148(野生型) 对赤霉素敏感. 2.4GAs处理下Y98149(突变体)与Y98148(野生 型)苗高增长率的动态变化 本实验将Y98149(突变体)与Y98148(野生型) ——'?矮秆系倒3节问3tdiaternode~omthetopofdwarfNIL ——??一商秆系倒3节问3Idiaternode~omthetopoftanN —_-?矮秆系健2节问2edintemode~omthetopofdwarfNIL __-一高秆系健2节问2ndiaternode~omthetopoftanN --?-矮秆系倒1节问Istiaternode~mthetopofdwarfNIL -?高秆系饲1节问1ltJam丘om由0to口oft皿Nm 一* 一 .. 一 024681012141618202426翘30麓34 时间Time/d 图2高矮秆近等基因系节间的动态变化比较 Fig.2.Dynamicchangesofinternodelengthsintallanddwarf nearisogeniclines. 2121OO28 OOOOOOOO O2121113 88789942 54117778 1O3122O8 25616667 56452244 异一一一一一一.}Jk雌 乎 ????约竹O g,营等昌?毯厘社 ?????约O 中国水稻科(ChineseJRiceSci)第2O卷第l期(2006年1月) 表3Y98149(突变体)与Y98148(野生型)幼苗对不同浓度赤霉素的反应 Table3.EffectofGA3atdifferentconcentrationsonseedlingheightattheseedlingstageinmu tantY98149andwildtypeY98148 表4Y98149(突变体)与Y98148(野生型)成株期对GA3的反应 Table4.Ef~ctofGA3onplantheightinthemutantY98149andwildtypeY98148attheadultst age. 的种子播种于同一瓷盘中,用20mg/kg的GA3溶 液处理,以浇蒸馏水作对照,处理2d后每天测量苗 高,计算苗高增长率.由图3可知,Y98149(突变 体)与Y98148(野生型)随着GA3处理时间的延长, 苗高增长率呈现不同的变化.在4d内Y98149(突 变体)与Y98148(野生型)的苗高增长率趋势较为一 致.从第4天到第5天,Y98149(突变体)的苗高增 长率增加,而Y98148(野生型)的苗高增长率逐渐减 小.5d后Y98149(突变体)与Y98148(野生型)的 苗高增长率趋势又趋向一致,从第5天到第6天,苗 高增长率减小,6d后随着处理时间的延长,Y98149 (突变体)和Y98148(野生型)的增长率又逐渐增大. 总体上可以看出两者对GA3敏感性趋势较一致,但 Y98149(突变体)对赤霉素更敏感,即水稻显性半矮 秆基因对赤霉素敏感. 冰 甚 脊至 'g 童 图3赤霉素20mg/kg处理Y98149(突变体)与Y98148(野生 型)幼苗苗高增长率的变化 Fig.3.SeedingheightincreasingrateinmutantY98149andwild Y98l48treatedwithGA3at20mg/kg. 2.5Y98149(突变体)与Y98148(野生型)成株期 对GA3的反应 由表4可以看出,株高79.4cm的Y98149(突 变体)经喷100,200mg/kgGA3溶液后,其株高比 对照增加了5.3和8.0%.对比之下,Y98148(野 生型)的株高仅增加了3.0和2.0,表明在成株 期Y98149(突变体)较Y98148(野生型)对赤霉素敏 感.由于Y98149(突变体)与Y98148(野生型)在成 株期较苗期对外源GA3钝感,所以成株期时的增长 率不是特别明显. 2.6内源GA3测定 从外源GA3实验获知显性半矮秆基因对赤霉 素敏感,为了进一步研究其敏感性,我们在植株体内 GA3合成高峰的圆秆拔节期取样,用高效液相色谱 对Y98149(突变体)与Y98148(野生型)内源GA3 进行了测定,色谱图如图4.从图中可以看出, Y98148(野生型)GA3的峰高明显高于Y98149(突 变体). 根据液相色谱图计算了所测样品中GA3的浓 度,结果列于表5.经过转化计算,得到野生型 Y98148体内GA3含量为528ng/g,突变体Y98149 的内源GA3仅为野生型含量的78,为412ng/g. 由此可以明确该基因的突变影响GA3的代谢合成 途径,使得内源赤霉素减少. 3讨论 通过对转育成的显性半矮秆基因的6对高矮秆 近等基因系进行比较,发现水稻显性半矮秆基因抑 制了茎秆节间的伸长,特别是倒3,2和1节问的伸 程灿等:水稻显性半矮秆基因对株高表达的影响及其对GA3的敏感性 > 皇 谴 鹫 图4测定GA3的色谱 Fig.4.ChromatogramsofGA3 1.o02.OO1OO2.OO 保留时间Retentiontime/rain 长,这样就使整个植株的重心降低,增强了植株的抗 倒力.Ogi等[17]利用带有sd-1基因的4份矮秆品 种转育成农林29近等基因系,通过比较认为sd-1 是由于抑制茎秆几个节间的细胞分裂,而导致节间 缩短.已有研究证明矮秆品种的赤霉素(GA3)含量 低于高秆品种,sd-1基因对GA3的反应敏感E25], sd-1基因影响GA3的含量和过氧化物酶活力E26]. 本实验就显性半矮秆基因对GA3是否也敏感进行 了探讨,通过对Y98149(突变体)和Y98148(野生 型)在苗期和成株期对GA3的反应比较,发现 Y98149(突变体)较Y98148(野生型)对外源赤霉素 更敏感;分蘖一拔节期内源赤霉素Y98149(突变体) 低于Y98148(野生型)都表明显性半矮秆基因和 sd-1基因一样都是通过调控赤霉素合成来影响水稻 植株高度的.但是显性半矮秆基因与sd-1基因是 通过什么相同或不同的途径影响了赤霉素合成,还 有待于进一步研究. 由图3我们可以看出,在2Omg/kg外源赤霉 素处理下,2,9d时Y98149与Y98148的苗高增长 表5内源GA3的测定 Table5.ConcentrationofendogenicGA3. 率的曲线较一致,总体呈先上升,再下降,再上升趋 势,但Y98149与Y98148之间还是存在一定的差 异,在处理4,5d时Y98149苗高增长率继续上升, 而Y98148的苗高增长率反而下降,在5,9d时 Y98149苗高增长率曲线变化与Y98148的苗高增 长率曲线变化趋势一致,先下降后上升且Y98149 苗高增长率始终比Y98148的苗高增长率高.刘斌 美等[27]利用RAPD技术对Y98149和Y98148进 行DNA指纹分析,结果表明野生型和突变体间的 遗传背景具有极大的相似性.可以认为Y98149与 Y98148两者株高差异是显性半矮秆基因造成的. 其作用机理与赤霉素代谢有关. 内源GA3测定结果表明野生型和突变体在内 源赤霉素的代谢水平上有一定差异,两者相差 22,对同期伸长的倒1,倒2,倒3节间长度影响变 幅为38.1,46.7.在植物体内赤霉素存在两 种形态:自由型和束缚型,在种子萌发时种子内束缚 型赤霉素转化成自由型赤霉素,自由型和束缚型之 间的转化受到其他激素影I11~E253.赤霉素在 ?劢m??侣伯??OOOOOOOOOO ?}f;?钙?:8?12伯?嗡?嘶? 30 Y98149,Y98148幼苗体内应有两种存在形式,即自 由型和束缚型,它们之间相互转化.自由型和束缚 型可能存在平衡.在外源赤霉素处理下,外源赤霉 素主要是通过弥补内源赤霉素来影响生长素水平, 进而促进苗高增长[24]. 通过对突变体与野生型株高构成分析,探明水 稻显性半矮秆基因抑制了倒3,2和1节间的伸长, 表明该基因在这些时期表达,在今后的研究中,可以 通过DDRT,PCR技术来寻找差异的mRNA片段, 通过3'RACE或5'RACE来获得全长eDNA序 列,从而为该基因的进一步定位,克隆打下基础. 参考文献: [1]朱立宏,顾铭洪,薛元龙.籼稻矮秆及其利用.南京农学院, 1980(2):I-7. 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