不同温度下鱼类食品过敏原免疫学特性分析

不同温度下鱼类食品过敏原免疫学特性分析 不同温度下鱼类食品过敏原免疫学特性分 析 1486中国公共卫生2006年12月第22卷第l2期ChinPublicHealthDec2006Vo1.22N0.j2 文章编号:1001-0580(2006)12.1486.02中圈分类号;R155.55文献标志码:A 不同温度下鱼类食品过敏原免疫学特性分析 徐飞龙,吴海强,刘志刚 【论着】 摘要:目的研究鱼类食品在生熟状态下的过敏原组分,分析其热稳定性过敏原.方法4种新鲜鱼类经不同 温度处理后去鳞,内脏和鱼骨.在预冷丙酮中破碎,脱脂,Coca's液提取其生熟总蛋白.十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS@AGE)分离.考马斯亮蓝显色分析其总蛋白组成,用鱼过敏患者血清对不同温度条件下的鲩鱼总蛋白 进行免疫学特征分析.结果SDS~PAGE显示,生熟鱼总蛋白提取物中均含有多种蛋白,经高温处理后熟鱼总蛋白组 分相对减少.免疫印迹试验结果表明,加工温度,时间对鱼类食品过敏原有显着影响.结论鱼类食品中禽有热稳定 的过敏原,即使加工后仍具有致敏性. 关键词:食品过敏原;生熟鱼类;总蛋白;十二烷基硫酸钠+聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);免疫印迹 AnalysisOilimmunologicalcharacterizationofallergensextractedfromfishescookedatdif ferenttemperaturesX0Fei— long,?UHaiqiang,LIUZhigang.KeyLaboratoryofMicroorganismandG胁eEngineering,CollegeofLifeScience. ShenzhenUniversity(Shenzhen518060.Cina) Abstract:ObjectiveToanalyzetheheatstableallergensinrawandcookedfishes.MethodsFo urkindsoffisheswere cookedatdifferenttemperatures,groundanddegreasedincoldacetonewhenfishskin.hasletsandfishbonewereremoved. Then,totalproteinswereextractedbyCoca'Ssolution.Separatedbysodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectmphoresis (SDSPAGE),totalproteinsweredetectedwithCoomassieBrillantBlueStainingandanalyzedbywesternblotusingpa. tients'sera.ResultsBothrawandcookedfishtotalproteinscontainedanumberofvarlousproteinsdifferentfromeachoth. er.Componentsofthetotalproteinsextractedfromcookedfisheswerelessthanfromrawfishes.Westemblottinganalysis showedthatcookingtemperatureandtimehadremarkableeffectsonthecompositionoffishallergens.ConclusionThereare someheatstableallergensinfishes,Whichareallergicevenwhentheyarecooked. Keywords:foodallergens;rawandcookedfishes;totalprotein;SDS-PAGE;westernblotting 食品过敏是人们对食品产生的1种变态反应.在临床上 表现为荨麻疹,哮喘,腹痛和腹泻等多种症状.严重的可导致 休克【1].随着社会发展,人们饮食结构的变化,食品过敏发病 率日益增高,给人们的生命健康造成了巨大威胁.目前,食品 过敏已成为WHO和世界粮农组织(R)关注的重大卫生学 问题.我国鱼产品比较丰富,对其过敏的患者也较多.在深 圳地区,淡水鱼和海水鱼已成为最常见的食品过敏原之 一 .因此,本文选择鲩鱼,鲤鱼,鲈鱼和金线鱼为研究对 象.对不同温度条件下鱼类蛋白组分的变化以及致敏活性进 行研究. 1材料与方法 1.1材料4种鱼类均在深圳市南山区某超市购买.一抗 血清来自于深圳市人民医院,采用MASTCLA-1型过敏原测 定系统(美国Mast公司)对过敏原进行检测,阳性血清级别为 3级,阴性血清为0级.所用试剂均为分析纯. 1.2鱼的预处理和总蛋白的提取熟鱼的加工按以下条件 进行:鲤鱼,金线鱼,鲈鱼分别在RTE一211型恒温水浴锅(美 国NESLAB公司)中i00?沸腾加工i0min.鲩鱼在恒温水 浴锅中分7种方式分别加工.即70?1Omin,80?10min,90 *基金项目:广东省科技重点 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目(2003A3080502);广州市重点 科技计划项目(20027.2.E4021);深圳市科技计划项目 (200326) 作者单位:深圳大学生命科学院微生物重点实验窒.深圳518060 作者简介:徐飞龙(1980一),男.广东梅州人,硕士在读,研究方向: 过敏性疾病变异原的基础性研究. 通讯作者:刘志刚 10mini005min100C10rain,10020rain,100 60min.总蛋白提取参照文献[4],将4种生熟鱼类骨别去鱼 鳞,内脏和鱼骨,在预冷的丙酮破碎,脱脂,用Coca's液提取 总蛋白,冻干后一80?保存备用. 1.3十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-)分 析依照文献[5]对生熟鱼类总蛋白进行垂直电泳分析,分离 胶浓度为15%.电泳完毕,用考马斯亮蓝染色,脱色后用凝 胶成像系统(美国PerkinElmer公司)收集图像. 1.4蛋白印迹(WesternBlotting)鉴定参照文献[5]方法改进, 生熟鱼类总蛋白经sPAGE后.电转移至硝酸纤维素(NC)膜 上.依次加血清和生物索标记的羊抗人IgE孵育,再与Strepta— vidin-HRP反应后,采用二氨基联苯胺(DAB)显色并拍照. 2结果 2.14种鱼类在生熟状态下蛋白组分的变化4种鱼类生熟 总蛋白经过SDS-PlA(,E电泳后,不同的鱼其总蛋白条带亦不 同,生鱼类总蛋白条带主要分布在10,55kD之闻.其中生鲩 鱼共有3l条蛋白带,主带为10条;生鲤鱼共有27条蛋白带, 主带为l2条;生鲈鱼共有42条蛋白带,主带为ll条;而生金 线鱼共有26条蛋白带,主带为8条.但熟鱼类(1oo?10mln) 的蛋白主带相对减少,在10,200kD之间均有分布.其中39 kD主要蛋白条带含量明显减少,而35kD和部分鱼类(如鲩鱼, 鲤鱼)70,150kD之间的蛋白含量明显增加,见图1. 2.2不同温度条件下鲩鱼蛋白及其致敏成分变化不同条 件作用下鲩鱼总蛋白SDS-PAGE电泳显示.生鲩鱼蛋白主带 中国公共卫生2006年12月第22卷第12期 ChinJPublicHealthDec2006Vo1.22No?121487 有10条,分子量分别为200,51,39,35,27,25.23,16,12和10 kD.生熟鲩鱼具有共同的电泳条带,如35,12,10kD等蛋白 带,但生鲩鱼39kD蛋白主带含量却明显减少,51,27,25kD 等蛋白随温度增加,时间延长逐渐消失了,而加热后的鲩鱼在 70,150kD之间的蛋白含量却较生鲩鱼增加,见图2. 取阳性血清作为一抗,正常人血清做阴性对照,对鲩鱼生 熟总蛋白进行免疫印迹分析,见图3.生鲩鱼与IgE结合的阳 1:蛋白marker;2:生鲩鱼;3:熟鲩鱼;4:生鲤鱼;5;熟鲤鱼 6:生鲈鱼;7:熟鲈鱼;8{生金线鱼;9;熟金线鱼 圉l4种鱼娄生熟总蛋白电泳圉 j 7O__蹬 55--榔 4O一 35_I撕 25_二 l5-I 10--奄g戢*静》‰u 1:预染mark~;2:生鲩鱼;3:7O?10min;4:8o?10min;5:90?10mill; 6:100?5min;7:100?10min;8:100?20min;9:100?60nan 圉3鲩鱼经不同温度及时间处理后总蛋白印迹圉 3讨论 常见食品过敏原主要由蛋白质组成,在高温时容易变性, 从而去除或降低过敏原的致敏活性[6].鱼类食品过敏原的分 子量主要在10,40kD之间,如鳕鱼的主要过敏原(Gadc1) 为12kDa7].有研究表明.罐装的金枪鱼和鲑鱼的致敏性比 生鱼的致敏性要低[8].本实验显示,4种生熟鱼类含有多种 蛋白成分,包括生熟鱼中都存在的热稳定蛋白和只存在于生 鱼中的非热稳定蛋白.还有一些蛋白只出现在熟鱼中,可能 是由于高温导致鱼自身蛋白酶变性,此类蛋白在提取过程中 没有被降解的缘故.另外.免疫印迹试验显示,鲩龟51, 39kD的过敏原在加热70?10min后迅速消失.它们属于非热 性带主要有5条(51,39,27.23,10kD),随温度的升高,时间的 延长,印迹条带逐渐减少,到完全消失.其中,鲩鱼加工70? 1Ornin时有3条阳性带(27,23,10kD),温度升高9O?(10min) 时剩2条阳性带(23,10kD),温度升高至100?10min时只剩 1条阳性带(10kD),加热100?时间延长至2Omin以上时阳性 带基本消失.而正常人均呈阴性反应,见图3. 15一r j0-- l:蛋白rmrker;2:生鲩鱼;3{70?10min;4:80?10mira5:90?10min; 6:100?5rain;7:100?10rain;8;100?2Orain;9:100?60min 圉2鲩鱼经不同温度及时间处理后总蛋白电泳圉 稳定过敏原.而鲩鱼27,23,10kD的过敏原加热到70?10 min时仍有印迹阳性带,属于热稳定过敏原,是熟鱼引起人过 敏的主要因素.鲩鱼10kD的过敏原加热到100?2Omin时 也基本消失了.说明加热一定程度可以去除过敏原的致敏活 性.上述结果表明,鱼类食品中含有热稳定过敏原,即使加工 后仍具有一定致敏性.这对进一步研究过敏原的致病机制,解 决食品的安全问题具有重要指导意义. 参考文献 [1]SichererSH.Munoz.FurlongA.BurksAW,eta1.Prevalenceof peanutandtreenutallergyintheUSdeterminedbyarandomdigit dialtelephonesurvey[J].AllergyClinImmunol,1999,103(4): 559—562. [2]梁桂珍,李放娟,侯穗波.等.1625例变态反应性疾病过敏原检 测结果分析[J].实用临床医学.2005,6(7):14—16 [3]李燕春.吴彩霞,张豁达.深圳地区荨麻疹,湿疹变应原检测及脱 敏治疗[J].中国麻风皮肤病杂志,2005,9(21):751—752 [4]乔秉善.变态反应学实验技术[M].2版.北京:中国协和医科大 学出版社,2002:47100. [5]胡川,刘志刚,林立丰,等.美洲大蠊主要变应原的纯化与免疫学 鉴定[J].寄生虫与医学昆虫,2005,12(3):163—167. [6]李欣,陈红兵.过敏原在食品加工中的变化[J].食品工业,2005, (1):5O一52. [7]JonathanBrostoff.StephenChallacombe,SaidElsayed.eta1.Food allergyandintolerance[M].2ndedition.London:Englend,2002: 425434+ [8]HefleSL.Impactofprocessingonfoodallergens[J].AdvExpMed Biol,1999,459:107—119. 收稿日期:20060323(文涛编辑郑新校对) .H加m87654322