观察大鼠脑神经元c-Fos蛋白表达的方法
实验46 观察大鼠脑神经元c-Fos蛋白表达的方法
【目的要求】
1. 学会用免疫组织化学技术显示脑神经元中c-Fos蛋白表达的方法。
2. 了解脑内神经元c-Fos蛋白表达的特点。
【基本原理】
c-Fos蛋白是即刻早期基因c-fos转录翻译的产物,是一种核内磷酸化蛋白。基础状态下,c-Fos蛋白在中枢神经系统的水平非常低,然而各种应激状态下,c-Fos蛋白的表达能够被瞬时快速地诱导。中枢神经系统内c-Fos蛋白的表达依赖于应激源的内在特性、强度和持续时间。由于c-Fos蛋白的诱导表达能在很大程度上反映应激诱导的神经元活动情况,故其常被作为神经元激活的标志,并广泛用于示踪特定条件下的神经功能通路。实验中应用免疫学抗体与抗原特异性结合的原理识别c-Fos蛋白,并通过与抗体相联接的酶催化底物改变颜色使之显示出来,从而对其进行定位和半定量研究。大鼠不同脑区c-Fos蛋白的表达程度反映了神经元激活的空间模式。
【材料与器械】
大白鼠、常用手术器械、冰冻切片机、显微镜、24孔或48孔培养板或称量瓶(25×30)、移液器(10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL)、移液器枪头(10 μL、200 μL、1000 μL)、滴管、粘片剂处理的载玻片、盖玻片、小毛笔、染色缸、2%戊巴比妥钠、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PB,pH7.4)、0.01 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS,pH7.4)、4,多聚甲醛(0.1 mol/L PB配制)、20%蔗糖(0.1 mol/L PB配制)、防冻液(丙三醇:乙二醇:PBS = 2:3:5)、OCT包埋剂、3%过氧化氢/甲醇溶液、10%正常羊血清或牛血清白蛋白、30%Triton X-100、兔抗大鼠c-Fos抗体、生物素化羊抗兔IgG、链亲和素辣根过氧化物酶复合物、DAB显色液、Mayer’s苏木精染液、梯度酒精(75%、95%、100%)、二甲苯、中性树胶。 【实验步骤】
1. 麻醉大鼠
2%戊巴比妥钠(100 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠。
2. 脑组织的固定及脱水处理
左心室穿刺至主动脉升部,先灌流0.01 mol/L PBS约200 mL,快速冲洗血液,随后灌注冷的4,多聚甲醛约400 mL,先快后慢,持续约1 h。
取脑后,将其置于4%多聚甲醛(4?)后固定4,6 h,或储存过夜。然后将脑组织置于20%蔗糖(4?)中脱水,至脑沉底。若要较长时间保存脑组织,脱水后,放入防冻
液中,存于-20?冰箱。
3.冰冻切片
用OCT包埋剂包埋脑组织,将其固定在冰冻切片机的载物台上,-20?冰冻30 min。然后开始做连续恒冷冠状切片,脑片厚20,40 µm。切片按需要分部收集于0.01 mol/L PBS中。
通常收集三套切片:第一套切片进行c-Fos免疫组织化学反应;第二套切片用于免疫组化阴性对照实验;第三套切片中性红或焦油紫染色,用于核团定位。
4. 阻断内源性酶活性
漂浮的脑切片先用0.01 mol/L PBS漂洗3次,每次5 min(以3×5 min表示,下同)。随后,3%过氧化氢-甲醇溶液室温孵育30 min。之后,PBS充分漂洗,3×5 min。
5. 封闭处理
5%正常羊血清或2%牛血清白蛋白(含0.3% Triton X-100)室温孵育脑切片30 min。孵育完成后,吸出封闭液,勿冲洗。
6. 一抗(兔抗大鼠c-Fos抗体)孵育
兔抗大鼠c-Fos抗体(1:2000,sc-52,Santa Cruz Biotechnology Inc,USA)(含0.3%
正常羊血清)37?孵育2,4 h或4?孵育过夜。 Triton X-100和3%
阴性对照脑切片,用PBS、正常羊血清或牛血清白蛋白代替一抗孵育。
孵育完成后,0.01 mol/L PBS充分漂洗,3×5min。
7. 生物素化二抗孵育
适度稀释的生物素化羊抗兔IgG(含0.3% Triton X-100和3%正常羊血清) 常温孵育1 h,0.01 mol/L PBS充分漂洗,3×5min。
7. 酶标试剂检测
适度稀释的链亲和素辣根过氧化物酶复合物(含0.3% Triton X-100)常温孵育1 h,0.01 mol/L PBS充分漂洗,3×5min。
8. DAB显色
DAB显色液处理脑切片3,5 min,0.01 mol/L PBS漂洗终止显色反应。
9. 贴片、复染和封片
脑切片充分漂洗后,贴片,略干。苏木精染液轻度复染(必要时),自来水冲洗,自然干燥,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
10. 显微镜下观察或用图像分析系统对实验结果进行分析处理。
c-Fos阳性神经元的细胞核呈棕黄色或棕褐色,而阴性神经元的细胞核呈蓝紫色(图
46-1)。
图46-1束缚-浸水应激60 min诱导的大鼠脑干孤束核中c-Fos蛋白的表达(400×) 【注意事项】
1. 大鼠脑组织在冰冻切片前必须在蔗糖溶液内浸泡,直至沉底,因为冰冻过程中组织和细胞内形成的冰晶对神经元结构有破坏作用。
2. 抗体在使用前应先摸清其效价和最适稀释度。理想的稀释度应是,抗体稀释度达到最高,阳性结果清晰可见,而背景无色。
3. 一般可用0.01 mol/L PBS(pH7.4)作为抗体稀释液,但不宜存放过久。如欲久置则应以Tris-HCl缓冲液(pH7.6)稀释抗体。
4. 配好的抗体工作液保存于4?,切忌反复冻融。
5. 免疫组化染色必须要有严格的对照,尤其是阴性对照,以排除假象。
6. 注意正常羊血清封闭处理后,不可漂洗脑切片。
7. PBS漂洗脑切片要充分,且漂洗的PBS为一次性,防止交叉污染。
8. 复染时间不宜过长,否则影响抗原的观察。
【思考题】
1. 大鼠脑神经元内c-Fos蛋白表达的特点有哪些,
2. 为什么c-Fos蛋白的诱导表达被广泛用作神经元激活的标志, 【参考文献】
郭云良,姚维成,高焕民,范振芹. 2005. 神经生物学技术. 青岛: 中国海洋大学出版社 Kovacs KJ. 1998. c-Fos as a transcription factor: a stressful review from a functional map.
Neurochemistry International, 33 (4): 287,297
张均田,张庆柱. 2005. 神经药理学研究技术与方法. 北京: 人民卫生出版社
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