悬浮细胞图像的计数
方法
快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载
研究
( ) Vol . 28 No . 1 第 28 卷 第 1 期佳 木 斯 大 学 学 报 自 然 科 学 版
()Journal of J iamusi University Natural Science Edition J an. 2010 2010 年 01 月
() 文章编号 :1008 - 1402 201001 - 0009 - 05
?
悬浮细胞图像的计数方法研究
朱亚华 ( )福建师范大学软件人才培养基地 ,福建 福州 350007
摘 要 : 悬浮细胞计数一直是细胞培养技术的重要工具. 从悬浮细胞图像的灰度特点出发 ,探索并实现了适合悬浮细胞图像的计数方法 :通过预处理 ,Canny 边缘检测及形态学处理这三个步 骤来完成分割 ,对分割结果采用种子点法进行区域计数 ,再针对所有含有种子点的区域 ,计算其 内部灰度均值 ,用于区分区域是活细胞还是死细胞. 经实验证明 ,该计数方法误差小 ,速度快 ,很 大程度上减少了细胞计数的工作量.
关键词 : 悬浮细胞 ;灰度 ;种子点 ;计数
TP391 . 41 A 中图分类号 :文献标识码 :
0 1 悬浮细胞的特点引言
在灰度方面 ,悬浮细胞图片有两大特点 ,如图 细胞培养技术是当今生命科学各研究领域的
基础技术和基本技能 ,它广泛应用于细胞工程 、基 ( ) 1 b所示.
因工程和生物医学工程和干细胞研究等方面. 其中 () 1由于细胞载玻板的厚度不均匀 ,会使得显 优生和抗衰老的研究 ,肿瘤 、感染 、创伤和器官移植 微镜光学系统中的光线不均匀 ,进而造成显微图像 1 等问题的研究 ,都与细胞培养技术相关. 细胞培 2 中背景照度不均匀,一般情况下 ,整幅图像会出 养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞 ,用培
() 现中间亮 ,周围偏暗的情况 ,如图 1 a所示. 养基制成细胞悬液 ,在体外适宜条件下 ,使细胞生
() 长繁殖 ,并保留其一定的结构和功能特性的一种技 2活细胞为一个暗环 ,暗环上灰度低于暗环
内的灰度及暗环外的背景灰度 ,而死细胞为一个暗 1圆 ,暗圆上灰度低于暗圆外的背景灰度 ,并且活细 术 . 在细胞培养技术的研究中 ,为了观察悬液中
胞暗环内的灰度高于死细胞暗圆上的灰度 ,如图 1 细胞的繁殖情况 ,往往需要对所培养的悬浮细胞进
() c所示. 其中白色圆圈圈住的细胞为活细胞 ,黑色 行计数 ,并
记录
混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载
其中活细胞数及死细胞数 ,由此来
圆圈圈住的细胞为死细胞. 计算出细胞成活率.
由于死细胞为一个暗圆 ,暗圆上灰度低于暗圆 ( 细胞成活率 = 活细胞数Π活细胞数 + 死细胞
外的背景灰度 ,所以死细胞的灰度与背景的灰度差 ) 数3 100 % .
异较大 ,较容易被准确识别出来. 而想要准确识别 在传统的医学实验室中 ,通常采用细胞计数板
出活细胞的难度则较大 ,因为悬浮细胞整幅图像中 来计数 ,即在显微镜下用目测法来进行计数. 这种
间亮 ,周围偏暗 ,导致活细胞中暗环内的灰度并不 方法的缺陷在于不仅对计数处理速度慢而且常使
绝对高于暗环外背景的灰度 ,两者的灰度差异并不 得检验人员在长期工作中眼睛极易疲劳 ,进而造成
(明显. 因此 ,寻找一种适合的悬浮细胞识别方法 识 计数错误. 为了克服目测法的缺陷 ,一部分学者开
) 别出活细胞和死细胞将有利于细胞计数的进行. 始利用计算机图像识别技术来实现细胞自动识别
2 - 3 4 与计数 ,如血细胞计数,切片细胞计数,牛奶 2 悬浮细胞图像分割5 体细胞计数等 ,但这些细胞计数方法却难以对悬
浮细胞进行精确计数. 因此 ,探索一种适合悬浮细 由于整幅悬浮细胞图像一般会出现中间亮 ,周
胞的计数方法将是文章的主要任务. 围偏暗的情况. 在这种情况下 ,如果采用传统经典
? 收稿日期 :2009 - 11 - 09() 作者简介 :朱亚华1983 - ,女 ,福建漳浦人 ,福建师范大学软件人才培养基地助教 ,硕士 ,研究方向 :图形图像处理.
6 的阈值分割算法分割图像 ,则容易出现将细胞错,如图 2 所示.难以获得理想的分割结果
分为背景 ,或将背景错分为细胞的情况 ,从而将更
虽然整幅悬浮细胞图像中间亮 ,周围偏暗 ,给,为了更准确地进行边缘检测 ,应先对图声“污染”
悬浮细胞图像的正确分割造成一定的难度 片进行预处理,但悬浮 . 消除噪声完再进行 Canny 边缘检 细胞图像还存在另一个特点 : 活细胞为一个暗环 , 测. 边缘检测过程中 ,由于与强边界不连通的弱边
暗环上灰度低于暗环内的灰度及暗环外的背景灰 界没被输出 ,所以部分细胞的边缘不会完全闭合 ,
需要进行闭合操作 ,可以采用形态学的“闭操作”进度 ,死细胞为一个暗圆 ,暗圆上灰度低于暗圆外的
背景灰度 ,即暗环上的灰度及暗圆上的灰度均低于 行处理. 因此 ,可以通过预处理、Canny 边缘检测及形
背景灰度. 这样 ,采用边缘检测方法就可以将暗环 态学处理这三个步骤来完成悬浮细胞图像的分割.
及暗圆标识出来 ,也就标识出了所有细胞. 2 . 1 预处理传统微分边缘检测的方法很多 , 主要算子有
Sobel , Roberts , Gaussian ,LOG ,Laplacian 等 , 而 Canny 在细胞图像的采集过程中 ,受显微镜视野中照算子是目前最好的微分边缘检测算子. Canny 算子 度不均匀 、人体会自觉或不自觉地运动等因素的影 之所以比较优越 ,在于它用两个不同的阈值来检测 响 ,图像中往往会出现一些不规则的随机噪声 ,这
8 强边界和弱边界 ,当一个弱边界和一个强边界连通将影响图像的质量. 而如果采用中值滤波算法, 时 ,在输出强边界的同时输出弱边界 ,否则弱边界 则可以有效地消除随机噪声 ,效果如图 3 所示. 可 不会被输出 ,这样做的目的是去除噪声对边界检测 以观察得出 ,经中值滤波处理后 ,活细胞暗环上的7 的干扰 , 同时又不会丢失弱边界信息. 而 Canny 灰度与暗环外的背景灰度差值增大了 ,同时 ,死细 算子同时检测强边界和弱边界的方法非常适合于 胞暗圆上的灰度与暗圆外的背景灰度差值也增大 悬浮细胞图像 ,因为活细胞暗环上的灰度值有些较 了. 因此 ,所有悬浮细胞边缘与背景的对比度大大 低 ,有些较高 ,较低的部分与暗环内 、外的灰度差值 提高了 ,这将有利于边缘检测的进行.较大 ,是强边界 ,而较高的部分与暗环内 、外的灰度
2 . 2 Canny 边缘检测差值较小 ,是弱边界 ,死细胞暗圆上的灰度也存在
类似的情况. Canny 算子是一种应用很广的边缘检测算子 , 由于细胞图像在采集过程中往往会被一些噪 它能同时检测强边界和弱边界的方法非常适合于
第 1 期朱亚华 :悬浮细胞图像的计数方法研究11
8 () 悬浮细胞图像. 该方法的步骤如下:由梯度方向 orient 计算出边缘方向 edgeDi2 5
() () 1采用平均值法将原图转化为灰度图.rection ,见式 5.
() () 2对灰度图进行高斯平滑滤波处理 ,高斯卷 6根据边缘方向 edgeDirection 计算左邻域灰
() 积核 Gaussian mask 见式 1. 度值 leftPixel 及右邻域灰度值 rightPoxel .
() () 7如果 sum 小于 leftPixel 或 rightPixel ,则 sum 平滑后的图像分别与 Sobel 算子的水平和3
垂直方向卷积核进行卷积运算 , Sobel 水平方向卷 值设为 0 . 否则通过设置高阈值 HT、低阈值 LT 来
( ) 积核 GX Sobel mask 见式 2, Sobel 垂直方向 计算 sum 值 :如果 sum 大于等于 HT ,则 sum 值设为
() 255 ;如果 sum 小于 LT , 则 sum 值设为 0 ; 如果 sum 卷积核 GY Sobel mask 见式 3. 由水平卷积运
大于 LT 并且小于 HT , 检查该点的八邻域的灰度 算获得水平梯度值 sum X ,由垂直卷积运算获得垂
直梯度值 sum Y ,再通过 sum X 和 sum Y 计算总梯度 值 ,只要八邻域中有一个点的灰度值大于 HT , 则 值 sum. sum 值设为 255 ,否则 sum 值设为 0 . 并且规定 sum
() X 和 sum Y 计算梯度方向值为 0 时 ,该点代表非边缘点 ; sum 值为 255 时 ,该 4由梯度值 sum
() orient ,见式 4.点代表边缘点.
2 4 5 4 2 - 1 0 1
()4 9 12 9 4 - 2 0 2 2 GX Sobel mask =
5 12 15 12 5 - 1 Gaussian mask 5 5 = 0 1
4 9 12 9 4 1 2 1
()2 0 0 0 3 GY Sobel mask = 2 4 5 4
()1 - 1 - 2 - 1
X = 0 = 0 & sum Y 0 . 0 , sum
X = 0 90 . 0 , sum & sum Y ?0
()4 orient = ( () ( ) () (() ) ) π180 - atan floatsum Y X | 3 180Π,sum X < 0 & sum Y > 0 Πfloat| sum
( () (() ( ) ) () ) π180 - atan float| sum Y | Πfloatsum X Y < 0 3 180Π,sumX > 0 & sum
( () ( ) () ( ) ) () π atan floatsum Y ΠfloatsumX3 180Π,sum X 3 sumY ?0 & sum X ?0
0 ,0 ?orient < 22 . 5 ‖157 . 5 ?orient ?180
45 , 22 . 5 ?orient < 67 . 5()5 edgeDirection = 90 , 67 . 5 ?orient < 112 . 5
112 . 5 ?orient < 157 . 5135 ,
在 Canny 边缘检测过程中 , 图像经过平滑之,尽管有些边缘比较明显的去除了绝大部分的杂质
杂质也被标识出来 ,但在实验允许的误差范围内.后 ,边缘会有所扩散 ,因此必须采用非最大抑制来
降低非边缘的影响. 通过非最大抑制运算之后 ,只 2 . 3 形态学处理有比较明显的边缘信息最终能被保留下来 ,如图 4
所示 ,其中黑色部分的像素值为 0 ,是背景区域 ,白 在经过 Canny 边缘检测处理后 ,所有细胞的边色部分的像素值为 255 , 是目标区域. 通过实验检 缘都被标识出来. 但是 ,部分细胞的边缘却并未完 测可以看出 ,Canny 边缘检测处理的结果是较为理 全闭合 ,这就给后续的计数处理带来诸多不便. 为 想的 ,因为所有细胞的边缘都被标识出来了 ,并且 解决这一问题 ,我们可以对图像进行形态学处理的
闭操作 ,即“先膨胀后腐蚀”. 膨胀可以多次进行 ,直255 . 填充孔洞的时候 ,先统计所有连通的非目标区至细胞边缘闭合 ,如图 5 所示. 图 5 中的一些细胞 域的面积 ,总是会有一个或者几个面积特别大的区 存在内部孔洞 ,这对使用腐蚀来取得骨架的算法是 域 ,其他都是面积相对较小或者很小的区域. 较小
非常不利的 ,因为腐蚀外边的同时 ,内部的孔洞也或者很小的往往就是需要填充的孔洞了. 填充结果
开始扩大 ,很难得到正确的结果. 这时就需要使用 如图 6 所示.
填充孔洞的算法来更正. 在填充孔洞处理后 ,须对图像进行腐蚀操作.
9 这时可以多次腐蚀 ,直到得到理想的结果 , 如图 7填充孔洞的原理:通过 Canny 边缘检测处理
后 ,背景区域的像素值为 0 , 目标区域的像素值为所示.
在通过中值滤波 、Canny 边缘检测及“闭操作”的内部灰度均值具体方法为 :
() 这三个步骤完成对悬浮细胞图像分割后 ,得到的分 1根据种子点的位置特点确定细胞重心. 因 割结果较为理想 ,如图 7 所示 ,所有细胞都被识别 为距离值最大的那些点位于区域的中心 ,并且每个
区域的距离最大点数量极少 ,而种子点是距离最大 出来了 ,很好地提高了细胞计数的准确性.
点中的一个 ,所以种子点的位置可以近似看作细胞 3 悬浮细胞计数的重心.
细胞计数的常用方法有两种 : 一是链码跟踪 () 2根据悬浮细胞的统计特点确定细胞半径. 法 ;二是种子点法. 对悬浮细胞图像进行计数 ,种子 所处理的细胞大小比较均匀 ,99 %以上的细胞半径 点法有两大优点是链码跟踪法无法比拟的 : 第一 , 不超过 12 个像素. 种子点法的计数速度比链码跟踪法更快 ; 第二 ,在
() () () 3计算得到细胞内部灰度均值. 从 1、2两 细胞粘连的情况下 ,种子点法比链码跟踪法更容易
获取各个粘连细胞的重心. 个特点可以看出 , 每个区域可以被以种子点为中 10 () 种子点法的计数处理: 1对形态学处理完 心 ,以 12 个像素为半径的圆形完全覆盖. 在原图
( ) ( ) 的二值图像 见图 7做距离变换. 2搜索距离变 (( ) ) 见图 1 b上 ,针对每个区域 ,计算以该区域的种 ( ) 换图中距离值最大的种子点来形成线段表. 3对 子点为中心 ,以 12 个像素为半径的圆形范围内的 线段表进行检查 ,消除分裂区域中的较小者 ,使每 灰度均值. 计算所得到的灰度均值即为细胞内部灰 个区域最终只留下一个种子点 ,并建立种子点表.
度均值. () 4检查种子点的距离值是否超过某个阈值 ,如果
() 超过说明该种子点是杂质 ,应该滤除. 5按种子点 根据上面计算得到的灰度均值区分活细胞与表将种子点逐个绘制出来 ,并统计区域数. 死细胞 ,高于某一阈值的为活细胞 ,低于这一阈值
的为死细胞 ,计数结果如图 8 所示 ,其中白色圆圈
圈住的代表活细胞 ,黑色圆圈圈住的代表死细胞.
图 8 中 ,活细胞和死细胞都被搜索到了 ,并且正确 3 . 1 计算内部灰度均值地区分出了活细胞与死细胞.
种子点法有效统计出总的区域数 ,但是在区分 3 . 2 计数实验及分析区域为活细胞还是死细胞的准确性上仍不甚理想.
为了更为准确地区分活细胞与死细胞 ,须计算区域 以 100 张分辨率为 1280 3 1024 的悬浮细胞图 的内部灰度均值. 因为活细胞的暗环内灰度高于死 像作为计数样本 ,在 WindowsXP 系统下 , CPU 为 1 .细胞的暗圆上灰度 ,所以内部灰度均值高于某一阈
70 G ,内存为 256M ,采用 VC + + 进行编程 ,最长计 值的为活细胞 ,低于这一阈值的为死细胞. 根据种
子点的位置特点及悬浮细胞的统计特点 ,计算区域 数时间为 17 . 36s ,最短计数时间为 15 . 47s ,平均的
计数时间为 16 . 42s ,远远小于人工计数时间 ,并且
第 1 期朱亚华 :悬浮细胞图像的计数方法研究13
区分细胞与杂质的误差较小 , 最大相对误差为 4 .细胞面积相近的杂质 ,降低边缘区域细胞及粘连面4 % ,最小相对误差为 1 . 3 % ,平均误差为 2 . 9 % ,区 积较大的细胞的计数误差 ,将是后来研究的一种有
分活细胞与死细胞的误差就更小了 ,平均误差接近 益探索.
于 0 .
实践证明 ,本文采用的细胞计数方法不仅计数 参考文献 :
1 程宝鸾. 动物细胞培养技术 M . 广州 : 中山大学出版社 ,时间短而且相对误差小 ,取得了令人满意的结果.
2006 ,3 - 4 .
苑玮琦 ,张田文. 血细胞图像的计数方法研究J . 计算机应用 2 4 结论() 与软件 ,2005 ,17 5,61 - 64 .
Ma Yide ,Dai Rolan ,Li Lian. A Counting and Segmentation Method of 根据悬浮细胞图像在灰度方面的特点 ,探索适3 Blood Cell Image with Logical and Morphological Feature of Cell J . 合悬浮细胞图像的计数方法 ,实现了悬浮细胞的自 () Chinese Joumal of Electronics ,2002 ,19 1, 53 - 55 . 动识别与计数. 识别与计数过程 ,先采用中值滤波 刘锡民 ,白丽华 , 张庆则 , 等. 彩色切片细胞的识别与计数研 4 去除随机噪声 ,再用 Canny 边缘检测获取细胞的轮 ( ) () 究J . 山东师范大学学报自然科学版. 2003 ,18 2,32 - 34 .
刘俊丽 ,薛河儒. 基于图像处理的牛奶体细胞计数方法的研 廓 ,通过膨胀 、填充孔洞及腐蚀处理 , 闭合细胞边 5 ( ) 究J . 内蒙古农业大学学报 : 自然科学版. 2006 ,27 4,140 - 缘 ,至此 ,得到了比较理想的分割结果 ,接着用种子 144 . 点法进行计数. 经实验得出 ,计数的平均时间短且 陆宗骐 ,金登男. Visual C + + . NET 图像处理编程M . 北京 :
清华大学出版社 ,2006 ,215 - 241 . 6 平均误差小 ,克服了人工计数花费时间长 、眼睛容 樊亚春 ,耿国华 ,周明全. 用不变矩和边界方向进行形状检索 易疲劳等缺点 ,取得了理想的结果. 但实验仍未完 () J . 小型微型计算机系统 ,2004 , 25 4,659 - 662 . 7 周长发. 精通 VC + + 图像处理编程M . 第三版. 北京 : 电子 全消除误差 ,其主要原因在于细胞与杂质区分方面
工业出版社 ,2004 ,298 - 325 . 仍旧存在误差. 因为有些悬浮细胞位于图像的边缘 8 徐慧. 精通 Visual C + + 数字图像处理技术与工程案例M . 区域 ,细胞只有一部分出现在图像中 ,出现的面积 北京 :人民邮电出版社 ,2009 ,189 - 221 .
陆宗骐. CΠC + + 图像处理编程M. 北京 : 清华大学出版社 , 9 较小 ,容易错分为杂质 ; 还有一些杂质经过分割处
2005 ,353 - 360 . 理后 ,其种子点距离值处于细胞的判定范围内 ,较 10 容易错分为细胞. 此外 ,在消除分裂区域中的较小
者时 ,有些粘连面积较大的细胞的种子点会被消
除 ,导致漏数了部分粘连细胞. 因此 ,进一步剔除与
The Counting Method Research of Suspension Cell Image
ZHU Ya - hua
( )Soft ware College of Fujian Normal University , Fuzhou 350007 , China
Abstract : The counting of suspension cell is very important in cell cultivation. From the gray - scale character2 istics of suspension cell image to explore and realize the counting method is suitable for the suspension cell image . The segmentation was carried out through three step s : pre - processing , Canny edge detection and morphological process2 ing. The segmentations were counted using seed - point method. For all areas containing the seed point ,the gray mean value calculated for the area was the distinction between living or dead cells. The experiment proved that the error of the counting method was small , and the speed was fast . It considerably reduced the cell counting workload.
Key words : suspension cell ; gray scale ; seed point ; counting