细菌的分离培养及培养性状的观察

细菌的分离培养及培养性状的观察 在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌 株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞 分裂、繁殖而产生的后代。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分 离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑 菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。 1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。 2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。 3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。 4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。 1. 平板划线分离法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有 混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经 培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。 但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太 薄，每皿约倾倒20 ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划 线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。 （1）连续划线法 以无菌操作用接种环直接取 平板上待分离纯化的菌落。将菌种 点种在平板边缘一处，取出接种 环，烧去多余菌体。将接种环再次 通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板， 在平板边缘空白处接触一下使接 种环冷却，然后从接种细菌的部位 在平板上自左向右轻轻划线，划线 时平板面与接种环面成30～40度 角，以手腕力量在平板表面轻巧滑 图4-1连续划线法 图4-2分区划线法 动划线，接种环不要嵌入培养基内划破 培养基，线条要平行密集，充分利用平 板表面积，注意勿使前后两条线重叠。 划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待 冷却后放置接种架上。培 养皿倒置于适 宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板 上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片 镜检为纯种后再接种斜面。 (2)分区划线法（四分区划线法） 取菌、接种、培养方法与“连续划 图4-3 划线分离示意图 线法”相似。分区划线法划线分离时平 板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最 大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70度。灼烧接种环，待在平板边缘上冷 却后，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70度，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37?恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。 2. 倾注平皿分离法 被检材料若含有两种或两种以上细菌时,可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后, 分散的细菌就被固定在原地形成菌落.这样也能达到分得纯种的目的。根据材料中存在菌数 的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适当稀释。其具体方法如下： 取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约50?，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以 同样方法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37? 温箱内培养24h。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个 平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。 3. 芽胞需氧菌分离培养法 如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于 80?水浴箱中维持15～20分钟，或85?加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的 细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。 4．利用化学药品的分离培养法 （1）抑菌作用 有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另外一些细菌没有抑制 作用，所以可利用这种特性进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素等化 学药品来抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离得到革兰氏阴性菌。 （2）杀菌作用 将病料如结核病料用15％硫酸溶液处理，其他杂菌均被杀死，而结核 杆菌因具有抗酸性而存活。 （3）鉴别作用 利用细菌对某种糖的分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某 种细菌。例如远藤氏培养基可以用来鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。 5. 实验动物分离法 被检病料中疑有某种病原菌存在，可将病料以无菌操作取出，放入灭菌乳钵或组织匀浆 器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下 或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。例如，疑 有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到 纯培养。 6. 琼脂斜面分离法 取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解 剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然后抽出接种环，不经烧灼，继续在第2管、第3管斜面上作同样划线。划毕，置37?温箱中培养。经此法分离培养后，第2管的菌落较第1管为少，第3管的菌落更少，如此较易得到单个菌落，达到纯培养之目的。 7. 琼脂平板涂布分离法 被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取 1～2滴置于平板中央，用灭菌的L形玻棒作均匀涂布。如估计细菌数很多，可直接用火焰灭菌的接种环钓菌，并做分 区划线。如为脏器病料，可先作成乳悬液再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙 后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布，此法适用于含菌量较少的病料的分离。 8. 营养肉汤分离法 当组织病料中含病原菌少，或有抗菌药残留时，用上述琼脂斜面或平板分离法可能无菌 落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37?培养，在肉汤中长出细菌后，再用琼脂斜面或琼脂平板分离。 细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧 菌，则需将培养环境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势， 才能生长繁殖。在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使 培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。现有的厌氧培养法很多，主要有生 物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。 （一）生物学方法 培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片， 或加热的肌肉、心脑等），因组织的呼吸作用，以及组织中可氧化物质的氧化而消耗氧气（肌 肉、脑磷脂中不饱和脂肪酸的氧化，碎肉培养基的应用），造成厌氧环境，以利于厌氧性细 菌的生长繁殖。同时，组织中所含的还原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-还原电势下降。 此外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一环境中，则环境中的氧被需氧菌消耗，造成厌 氧环境，也有利于厌氧菌的生长繁殖。 1. 动物组织及其他物质加入法 在液体培养基内加入肝脏、肾脏等动物脏器，因其中 的半胱氨酸的一SH基极不稳定，为强还原剂，所以可利用此培养基进行厌氧培养，在培养 之前将肝片肉汤加热，以驱出空气，冷却，然后接种培养。 2. 共栖培养法 将厌氧菌与需氧菌共同培养在同一个平皿内，利用需氧菌的生长繁殖 将氧气消耗后，造成厌氧环境利于厌氧菌生长。其具体方法是将培养皿的一半接种消耗氧气 能力极强的需氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。另一半接种厌氧菌， 接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37?恒温箱中培养2～3d， 即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。 （二）化学方法 利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，或还原氧化型物质，降低 氧化-还原电势。 1. 焦性没食子酸法 焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有3利于厌氧菌的生长繁殖。通常100cm空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化钠或氢氧化钾10m1。具体方法有下列几种： （1）平板培养法 将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约2cm的脱脂棉，置于平皿盖的内面中央，其上滴加0.5ml 10％氢氧化钠溶液；在靠近脱脂棉的一侧放置 0.5g焦性没食子酸，暂勿使两者接触。立即将已接种的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的 石蜡密封平皿四周。封毕，轻轻摇动平皿，使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸 接触，然后置37?恒温箱中培养24～48h后，取出观察。 （2）Buchner氏试管法（图4-4） 取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠 数个或放一螺旋状铅丝。将已接 种的培养管放入大试管中，迅速 加入2％NaOH溶液0.5ml，立即 将试管口用橡皮塞塞紧，必要时 周围用石蜡密封。37?培养24～ 48h后观察。 图4-4 Buchner氏厌氧培养法 图4-5 瑞氏厌氧培养法 （3）瑞氏厌氧培养法（图4-5） 将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧 灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。 （4）史氏厌氧培养法 用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另 一边置NaOH溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇 动底部，使氢氧化钠与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。 （5）平皿厌氧培养法 置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细 菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封闭后置温箱中培养（图4-7） （6）玻罐或干燥器法 置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿 或试管置于隔板上，并在玻罐内置美兰指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液于罐底，将焦 性没食子酸用纸或纱布包好，用 线系住，暂勿与氢氧化钠接触， 等一切准备好后，将线放下，使 焦性没食子酸落入氢氧化钠溶 液中，立即将盖盖好，密封，置 温箱中培养。 图4-6 史氏厌氧培养法 图4-7 平皿厌氧培养法 2. 李伏夫（B.M.JIbBOB） 氏法 此法是利用连二亚硫酸 钠（Sodium hyerosulphite）和碳 SO+NaCO+O?NaSO+NaSO+CO 22423224232酸钠以吸收空气中的氧气,释放二氧化碳造成厌氧环境。其反应式如下： 取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培Na养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻 3罐的体积每1000cm空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平 皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，可将平皿 重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐置于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭,如图4-8所示。 3. 硫乙醇酸钠法 硫乙醇酸钠是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原 氧化型物质，促使厌氧菌生长。其它可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C及半胱氨酸等。 （1）液体培养基法 将细菌接入含0.1%的硫乙醇酸钠液体培养基中，并加入美兰溶液作 为氧化还原的指示剂，37?培养24～48h后观察，在无氧条件下，美兰被还原成无色。 （2）固体培养基法 利用特殊构造的Brewer氏培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而 形成孤立的菌落。具体方法如下：先将Brewer氏培养皿干热灭菌，将溶化冷却至50?左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾入皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖 上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触（图4-9）。此时皿盖与培养基中央部 分留在空隙间的氧气被硫乙醇酸钠还原，美兰指示剂逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通， 仍呈蓝色。将Brewer氏培养皿于37?恒温箱内24～48h后观察。 图4-8 李伏夫氏厌氧培养法 图4-9 Brewer氏培养皿 图4-10 Mc1gtosh－ Fildes二氏厌氧罐 （三） 物理学方法 利用加热、密封、抽气等物理方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，造成厌氧环 境，有利于厌氧菌的生长繁殖。 1. 厌氧罐法 常用的厌氧罐有Brewer氏罐、Brown氏罐和Mc1gtosh－Fildes二氏罐（图4-10）。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。 通电，使罐中残存的氧与氢经受铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌 氧罐放入温箱培养。 2. 真空干燥器法 将接种好的平皿或试管放入真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度 真空后，替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱中培养。 3. 加热密封法 将液体培养基放在阿诺氏锅内加热10min，驱除溶解液体中的空气，取出，迅速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培养基液面覆盖一层0.5cm的无菌凡士林石蜡。置37?培养24～48h后观察。 4. 高层琼脂柱法 加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50?左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。在琼脂凝固前，迅速以 无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入准备好的玻璃管内（长约15 cm，一端塞小胶塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高压灭菌备用），装至4／5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置37?恒温箱中培养。长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将 琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌接种环钓取独立菌落作厌氧纯培养。 () 在细菌培养中，有少数细菌（如牛型布氏杆菌）在含有5～10％二氧化碳的环境下才能生长。最简单的二氧化碳培养法是烛缸法：将接种细菌的培养基置玻璃干燥器或其他可以密 闭的玻璃缸内，在其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂上凡士林以防漏气），约1min左右蜡烛自然熄灭，此时缸内氧气已被消耗，缸内所含二氧化碳约5～10％。注意蜡烛勿太长，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃过热而破裂。也可用化学物质作用生成二氧化碳气体如 碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸。 将划线分离培养37?24h的平板从温箱中取出，挑取单个菌落，经涂片、染色镜检， 证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，所得培养物即为纯培养 物，再作其它各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下： 1. 接种环移植法 两试管斜面移植时，左 手斜持菌种管和新鲜空白琼脂斜面各一管，使管 口互相并齐，稍上斜，管底握于手中，松动两管 棉塞，以便接种时容易拔出（图4-11）。右手食 指和拇指执接种环，烧灼接种环，以右手小指扭 开一管的棉塞，无名指扭开第二管的棉塞。棉塞 头向掌心内，将试管口通过酒精灯火焰灭菌，待 冷却后将接种环插入菌种管中，钓取细菌少许取 图4-11 斜面接种时试管的拿法出接种环立即接种在新鲜空白琼脂斜面上，不要 碰及管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲 线或直线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌后，塞好棉塞。接种完毕，将接种环烧 灼灭菌后放下接种环。用蜡笔在试管上标明细菌名称和接种日期，置37?温箱中培养。斜面接种无菌操作过程如图4-12所示。 2. 吸管或注射器移植法 欲移植定量的液体培养物或表面有液体石蜡油的厌氧菌培养 物，可以利用吸管或注射器移植，其操作方法是以无菌吸管或无菌注射器吸取培养物，代替 接种环进行移植。 明 胶穿 刺和 琼脂 柱穿 刺方图4-12 斜面接种无菌操作程序 法基 本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基中。要从培养基表面 的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。 （一）细菌在固体培养基上的生长表现 1. 琼脂平皿上的生长表现 细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细 菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细 菌。如葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落； 炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样构造；肠道 杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌， 形成细小露珠状菌落。观察菌落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜 进行检查。观察的主要内容有（图4-13，图4-14）： 1 2 3 4 5 6 7 8 图4-13 菌落的形状、边缘和表面构造 1． 圆形、边缘整齐、表面光滑；2．圆形、边缘整齐、表面有同心圆；3．圆形、叶状边缘、表面有放 射状皱褶；4．圆形、锯齿状边缘、表面较不光滑；5．不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹； 6．圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；7．毛状 ；8根状 1 2 3 4 5 6 7 8 图4-14 菌落的隆起度 1．扁平状； 2．低隆起；3．隆起；4．台状； 5．脐状；6．纽扣状；7．乳头状；8．褶皱凸面 （1）大小 菌落的大小，规定用毫米（mm）表示，一般不足lmm者为露滴状菌落； 1～2mm者为小菌落；2～4mm者为中等大菌落；4～6mm或更大者称为大菌落或巨大菌落。 （2）形状 菌落的外形有圆形、不规则形、根足形、葡萄叶形。 （3）边缘 菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状等。 （4）表面性状 观察其是否平滑、粗糙、皱襞状、旋涡状、荷包蛋状，甚至有子菌落等。 （5）隆起度 表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤状者。 （6）颜色及透明度 菌落有无色、灰白色，有的能产生各种色素；菌落是否有光泽， 其透明度可分为透明、半透明及不透明。 （7）硬度 黏液状、膜状、干燥或湿润等。 （8）溶血情况 若是鲜血琼脂平皿，应看其是否溶血、溶血情况怎样。 2. 琼脂斜面上生长表现（图4-15） 将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上 （自底部向上划一直线），培养后观察其生长表现。 3．琼脂柱穿刺培养中的生长表现 将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培 养后观察其生长表现，如图4-16所示。 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 （二）细菌在明胶柱穿刺培养中图4-15 琼脂斜面直线接种培养的菌落表现 的生长表现 图4-16 琼脂柱穿刺培养的菌落表现 取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细1． 线状；2．棘状；3．珠状； 1．线状；2．棘状；3．珠状；4．扩散状；5．根状 菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱， 4．绒毛状；5．根状 置22?温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相 同，其形式如图4-17所示。 （三）细菌在液体培养基中的生长表现（如图4-18所示） 将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培 养后观察其生长情况，主要观察其混浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等。 1. 混浊度 细菌接种在液体培养基中经适当培养后其表现性状不同,有均匀混浊,轻度混浊或培养基保持透明（表面有菌膜或底部有沉淀物）。 2. 沉淀物 细菌在液体培养基中所形成的沉淀有：颗粒状沉淀、粘稠沉淀、絮状沉淀、 小块状沉淀。另外还有不生成沉淀的细菌。 3. 表面性状 主要是细菌在液体培养基中培养后,有无菌膜或菌环形成等。 4. 颜色 有的细菌在生长繁殖过程中能产生色素,色素能溶于水,所以细菌在液体培养基中培养后,所产生的色素会使培养基的颜色发生变化。 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 图4-18 细菌在肉汤中生长表现 图4-17 细菌明胶柱穿刺培养生长表现 1．絮状；2．环状；3．厚膜状；4．均匀状 1． 不液化；2．火山口状；3.芜箐状； 4.漏斗状；5.囊状；6.层状