硕士论文--基于萤火虫萤光素的小分子生物发光探针的研究

硕士论文--基于萤火虫萤光素的小分子生物发光探针的研究 硕士论文--基于萤火虫萤光素的小分子生物发光探针 的研究 足 类 号: 单位代码: 密级: 学 号:.弓心 ?‖菇办孑 硕士学位论文 论文 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 目: 篮孑该必砍板览家协村\今占 鲨物醢宄探铆黟研雾 匀一纵黝彤的删删红锄批加切删肭 作者姓名 尘聱 学院名 称 兹笠醒 专业学位名称 蕴毖焦堂 指导教师釜碱磊越 导 合作 师 乒。,?年口厶月口‖日原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导 下,独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 或撰写过的科 研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文 中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名: 日 期:盈丝丝 签聱 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定,同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允 许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名:导师签目录 中文摘要 ?;符号说明? 第一章前言。 .生物发光及生物发光成像简介 ..生物发光简介? ..生物发光成像简介..基于生物发光的小分子探针的研究进展?. .过氧化氢探针的研究进展?. .氨肽酶探针的研究进展? .萤火虫萤光素酶底物的研究进展?. 第二章基于萤火虫萤光素的过氧化氢生物发光探针.过氧化氢生物发光探针 的合理设计. .活性氧生物发光探针的合成. ..实验试剂和仪器??. ..中问体以及探针分子的合成. .过氧化氢生物发光探针的活性研究. ..实验试剂和仪器??. ..实验方法??. .结果与讨论?. ..过氧化氢探针的体外活性测定??. ..过氧化氢探针的细胞成像研究??. .本章 小结 学校三防设施建设情况幼儿园教研工作小结高血压知识讲座小结防范电信网络诈骗宣传幼儿园师德小结 ??. 第三章基于萤火虫萤光素的氨肽酶生物发光探针.氨肽酶生物发光探针的合 理设计 .氨肽酶生物发光探针的合成??..实验试剂和仪器??. ..中间体以及探针分子的合成. .氨肽酶生物发光探针的活性研究 ..实验试剂和仪器??. ..实验方法??. .结果与讨论?. ..氨肽酶生物发光探针的体外酶活性研究 ..氨肽酶探针对细胞中氨肽酶酶活性的测定结果..氨肽酶探针对活体动物 体内氨肽酶酶活性的测定结果.本章小结??. 第四章萤火虫萤光素酶底物的合成及活性研究??. .萤火虫萤光素酶底物的合成. ..实验试剂和仪器??. ..目标化合物的合成?. .萤火虫萤光素酶底物的活性研究?. ..实验试剂和仪器??. ..实验方法??. .实验结果与讨论??. ..萤火虫萤光素酶底物的体外成像结果??。 ..萤火虫萤光素酶底物的细胞成像结果??. ..萤火虫萤光素酶底物的动物成像结果??. .本章小结??. 参考文献.. 致谢??.. 附蜀之??.. 附衰.??..??.. 附录攻读硕士学位期间发表学术论文情况? 附录化合物的?,?,?图谱.??..?... . ................................................. ..? ................................................... ....................................... . ............................................................... . ................................................................ . . ............................................... . ............................................................... ............. ............................................................... .. ................................................................. ............... . ................................................. ............................................................... .. :................................................................ ......................:: ..??. .. . ................................................................. .......................................... .?. . ............................................................... ........... ..?. ..?.. . ..??. .. .?. ..?. :;.... ..?.. .. ?.. ..? ..??. ..?.. ?.....??..?.....?....?..... . ....?.............?.....?.?.?.....??.... .. .?. .. / .............................. ............................... ............................... .. ...:??..?.....??.?....??..??..?....??..??.....?..??... .. . 山东 大学硕士学位论文 基于萤火虫萤光素的小分子生物发光探针的研究 中文摘要 专业:药物化学 研究生:李静 导师:李敏勇教授 生物发光是指生物体内的化学物质在酶的作用下产生可 见光的现象,该过程不依赖于机体对光的吸收,是将化学能转化为光能的过 程, 转化效率接近%。生物发光现象广泛存在于自然界生物有机体中,包括细菌、 昆虫和海洋生物等。 生物发光成像 ,是近几年来新兴的一种应用 生物发光原理进行的活体动物光学成像技术。与传统成像技术相比,生物发光成 像有着操作简便、直观、灵敏度高、非侵袭性和可用于深部组织成像等优点,因 此在复杂的生物有机体研究中具有巨大的应用潜力和商业价值。萤火虫生物发光 系统作为研究开始最早,研究最为透彻的一个生物发光系统,被广泛应用于生物 发光成像。萤火虫萤光素在、和存在的条件下,可被萤光素酶氧化, 释放出氧化萤光素、和,同时产生生物发光现象。如果对萤火虫萤光 素的结构进行改造,在’位置引入特定的取代基后,能够被用于特定生物分子如 半胱天冬酶、硫酸酯酶和弗林蛋白酶等的实时检测,很多探针也实 现了商业化。 本论文基于萤火虫萤光素的结构,分别设计了能够检测活性氧 的生物发光探针,以及 ,和氨肽酶 能够被萤光素酶氧化发光的的叠氮和三氮哗类化合物。 本论文主要包括三部分: .合成了个用于检测活性氧的生物发光探针,并对其生物活性进行了详 细阐述和验证。生物体生成的活性氧对于机体的生命活动,如生长调节和信 号传 导是不可或缺的,然而过量活性氧的存在却可以造成细胞损伤,引发如癌症、心 血管疾病、早老性痴呆、帕金森综合症等疾病。过氧化氢作为活性氧家族中的重 要成员,因此检测其活性对于研究过氧化氢在病理生理过程中发挥的作用具有重山东大学硕士学位论文 要的意义。本论文设计的过氧化氢探针由发光基团氨基萤光素、过氧化氢识别基 团硼酸以及可自动断裂连接臂三部分组成。这个探针对活性氧中的过氧化氢表现 出很好的选择性和识别活性,能够定性和定量的检测溶液和细胞中产生的微量的 过氧化氢,且能够对萤光素酶基因标记的..?细胞中产生微量的过氧 化氢进行生物发光成像。该探针能够实现对过氧化氢的可视化的实时非侵袭检 测,是一个很有潜力的生物发光探针。 .合成了个用于检测的生物发光探针,并对其生物活性进行评价。 在正常组织中广泛表达,但在肿瘤细胞表面高水平表达,与肿瘤细胞的生 长、侵袭、转移和新生血管的生成都有着密切的关系,是一种重要的肿瘤标记物。 因此合理地设计合成活性新型分子探针,对于研究药物的抗肿瘤机制以及 筛选以为靶标的抗肿瘤药物的都有十分重要的作用。该类探针由发光基团 氨基虫萤光素和底物两部分组成。通过实验证实,该类探针能够用于分子 水平、...细胞及接种...细胞的裸鼠体内活性的 定量检测。 .合成了个萤光素酶底物,并测试其成像性质。本研究对现今应用较为 广泛的萤光素酶底物氨基萤光素进行改造,设计了两个萤光素酶底物。分别将氨 基萤光素的’.氨基用叠氮基团和.三氮唑噻吩取代,经酶、细胞和动物水平成 像研究证实,这两个探针都可作为底物进行生物发光成像,对于拓展了生物发光 成像的应用领域具有很重要的作用。 关键词:生物发光,小分子探针,过氧化氢,氨肽酶,生物发光底物山东大学硕士学位论文?: :. : . , %. , , ,. , . ?,. ,, . ’ ?,,. , ,.. :, ..,山东大学硕士学位论文 ,。,’. ., .? :, . 谢 . ?... . ,. . . ,, , .. ?? , ,, . , , ??,?? ???, . . .’ . . 山东大学硕士学位论文 : ? , , , ,符号说明 氨肽酶生物发光成像电耦合器件二氯甲烷 .半胱氨酸盐酸盐 。 二甲基亚砜盐酸多柔比星乙酸乙酯 .电喷雾离子化质谱 胎牛血清萤火虫萤光素酶 一甲基吗啉 核磁共振 石油醚 感兴趣区域活性氧 叔丁基过氧化氢 三氟乙酸 四氢呋哺 薄层层析 ? 山东大学硕士学位论文 第一章前言 .生物发光及生物发光成像简介 ..生物发光简介 生物发光是生物体内的化学物质在酶的催化下将化学能 转化为光能的一种过程,这是一种特殊类型的化学发光,不依赖于机体对光 的吸 收,化学能转化为光能的效率很高,接近%。生物发光现象广泛存在于多种 生命有机体内,到目前为止,已经有众多的具有生物发光能力的生物种群被 发现, 包括细菌、真菌、海洋生物以及昆虫等约多个物种,涉及个.】。生 物发光的呈现绿色到红色不同颜色,波长范围在~ 之间。 不同的生物发光体系的萤光素酶和萤光素结构也各有差别。目前只完成为数 不多的几个物种的活性物质分离和分子结构确定,并被应用于哺乳动物的成像研 究。随着对生物发光研究的不断深入,越来越多的萤光素酶被分离提纯,其编码 基因也被克隆表达,如萤火虫萤光素酶、叩头虫萤光素酶、海肾萤光素酶、腰鞭 ,是 毛虫萤光素酶和细菌萤光素酶等。萤火虫萤光素酶 从北美萤火虫 的多肽 中分离得到的,相对分子质量为 链单节显性蛋白质,由个氨基酸残基构成,其中含有大量的疏水氨基酸残基。 它能够在,和存在的条件下催化氧化其底物一萤光素. 左右,是目前应用最为广泛 。萤火虫生物发光体系发光的发射波长在 的生物发光体系。叩头虫萤光素酶也利用一萤光素作为发光底物,发出橘黄色 或红色 的光。海肾萤光素酶利用腔肠素作为发光底物, 发射 的蓝光,不仅发射波长短,其强度也较弱,且腔肠素自身的氧化产 生较强的背景信号,在体内代谢很快,其应用受到了很大的限制.】。细菌萤 光素酶能够氧化还原性磷酸核黄素衍生物和长链脂肪醛,发出蓝光 。发光细菌的萤光素酶的底物不仅存在于发光细菌中,也存在于 正常的非发光细菌中,因此将编码细菌萤光素酶的基因转染到非发光细菌中 后,非发光细菌也可以发光。该技术被用于在时间和空间上的可视化连续观 察转染的细菌感染宿主的模式。 山东大学硕士学位论文 虽然每种发光体系的发光底物不尽相同,但其生物发光的机制确大致相同: 底物被萤光素酶催化氧化,产生含有激发态的电子中间体,当该电子由激发态返 回基态时将化学能转化为光能,释放出光子不同底物的光的颜色和波长不同。 年,等首次从北美萤火虫体内提取到萤光素酶,并确定了 它的晶体结构。萤火虫的生物发光机制也于同年被发现。萤火虫萤光素酶在、 和存在的条件下,通过两步反应氧化其底物萤火虫萤光素,生成氧化虫 萤光素、和,并释放出光子。第一步,萤火虫萤光素和在萤光素 酶的作用下形成萤光素一腺苷酸络合物,之后进一步被氧化和环化,生成二氧环 丁酮阴离子。。第二步该阴离子中间体被氧化裂解产生含有激发态电子的羰 基衍生物,随着激发态电子跃迁回基态,多余的能量以光量子的形式释放,从而 产生亮光,同时生成氧化虫萤光素、和】。萤火虫萤光素的发光机制 见图.。 占 , 粼广 ?顶粼脊 一 。眩徙了弋“。浏 奴粼贰 图.萤火虫的生物发光机制 ..生物发光成像简介 生物发光成像 ,是通过灵敏的光学检测仪器 监控萤光素酶标记的细胞或基因在活体生物内的活动和行为过程的一种新兴的 成像技术。生物发光成像技术具有操作简便快速、灵敏度高、能够实现实时动态 观测以及非侵袭性等优点。随着理论研究的深入,该技术已经逐步地应用到微生 物学、生物化学、环境科学、分子生物学、医学等多个学科和领域,成为了一种 重要的成像手段。生物发光成像技术在肿瘤生长监测和转移示踪、目标基因表达 的检测、蛋白.蛋白相互作用、药物高通量筛选、细胞内水平探测和研究细 菌病毒感染宿主过程等领域有着不可替代的技术优势。山东人学硕士学位论文 年,生物发光成像技术首次被应用于活体动物的研究,等 将带有细菌萤光素酶基因操纵子的鼠伤寒沙门菌感染老鼠,通过生物发光 的强度和位置评价抗生素的治疗效果。年,该课题组将萤光素酶底物注射 到表达萤光素酶的转基因小鼠体内观察到了生物发光现象。因此,可以将萤光素 酶基因作为 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因与目标基因相连,通过生物发光的强度来检测目标基因的表 达。这一标志性的研究开创了应用生物发光成像技术揭示生物学过程的先 河。自此,细菌及萤火虫萤光素酶被广泛应用于小动物活体生物发光成像技术。 目前已经建立了成熟的生物发光成像方法,主要是将萤光素酶基因整合到预 期观察的细菌、病毒、动物细胞或动物的染色体上,培育出能够稳定表达萤光素 酶的细菌株、病毒株、细胞株或转基因动物,将标记好的细菌株、病毒株或细胞 株接种到实验动物体内。在进行活体动物成像时,外源注射的.萤光素迅速分 布到组织和细胞中,产生持续稳定的发光现象。细胞或动物产生的光子可以被高 ,的相机所捕捉,并 灵敏度的具有电荷耦合器件. 通过软件系统进行后期的成像及数据分析。通过成像软件,可以进行伪彩色成像, 通过动物表面的成像颜色,直观地观测生物发光的位置和相对强度,也可以选定 ,,定量地计算出该区域发射的光子数。见 感兴趣区域 图.在相同的深度情况下,检测到的发光强度和细胞的数量有着良好的线性 关系,光强度反映出发光细胞的数量。另外,也可以通过对生物发光底物的修饰, 实现对生物大分子例如酶和多糖及具有生理活性小分子生物学功能的研究。 图.生物发光成像技术的应用山东大学硕士学位论文 自从发现了光的用途之后,动物活体成像就走进了科学家的视 野。目前存在的非侵袭性的成像方法包括磁共振成像?,正电子发射计算 机断层扫描,单光子电脑断层脑室造影扫描,荧光成像 和生物发光成像等】。荧光成像和生物发光成像有着非侵袭性、操作 简便、应用范围广等优势,被广泛应用于生物医学领域的成像研究。近年来,设 计合成性质优良的荧光探针和生物发光探针仍吸引着很多研究者的目光。荧光标 记物种类繁多,包括荧光蛋白荧光探针、量子点荧光探针、有机小分子荧光探针 和金属配合物荧光探针等,而且信号强度大,费用低廉,对仪器设备以及实验样 本的生理状态要求较低,作为分子探针使用范围广。然而,作为一种更新兴的成 像方法,生物发光成像相较于荧光成像有着更多的优势。与荧光成像相比,生物 发光成像技术主要有以下几点优势: 特异性强,灵敏度高荧光发光基团的成像依赖于合适强度的激发光一 般小于 的激发,而在受到激发光激发时,皮肤、毛发和各种组织及食 物等都会产生自发荧光,因此其特异性相对较低、背景信号高;相比之下,萤光 素酶在哺乳动物体内无内源性表达,因此生物体本身没有自发光,不受细胞内其 他物质的干扰。而且生物发光是萤光素酶和底物的特异性氧化反应后将化学能转 化为光能的过程,不依赖于激发光的激发,背景信号低,特异性强。生物发光较 高的信噪比也大大提高了其检测的灵敏度。荧光成像技术只能检测到动物体内约 数量级的细胞,而生物发光成像能够检测数量级细胞。在进行深度组织 的成像时,一般选择生物发光成像。 精确定量萤光素酶基因标记的细胞能够稳定表达萤光素酶,发光稳定, 影响因素少,因此生物发光信号可以用于精确定量,生物发光强度与发光细胞的 相对数量呈现良好的线性关系;而对于荧光成像,由于激发光的强度、组织对激 发光和发射光的吸收和散射、机体的白发荧光以及发光细胞的深度等多重因素的 影响,使得其难以进行准确定量。 对机体损伤小生物发光成像是通过向稳定表达萤光素酶的细胞或动物体 内加入外源的萤光素进行成像。萤火虫萤光素对机体的正常生理活动无影响、毒 性低、扩散和代谢较快;而荧光成像需要对细胞、组织或者活体动物进行激发光 照射,可能会导致细胞和机体损伤,为便于观察,在进行深度组织成像时还需要 山东大学硕士学位论文 宰杀和解剖动物。 因此,设计合成合理的生物发光探针用于生物发光成像对于拓展我们对细胞 及生物体的了解具有十分重要的意义。 ..基于生物发光的小分子探针的研究进展 ...萤火虫萤光素酶与萤光素的结合机制 由于萤火虫萤光素.萤光素酶体系是研究开始最早,机理研究最为透彻的生 物发光体系,被广泛用于生物发光成像。本论文介绍了基于萤火虫萤光素进 行的 生物发光成像研究。 萤火虫萤光素酶的晶体结构的解析对生物发光机制的研究以及新的生物发 光底物的设计都有着十分重要的意义。年,北美萤火虫的萤光素酶 序列被确定。年,萤火虫萤光素酶的晶体结构被解析。萤光素酶蛋白由 两个结构域折叠而成,主要包含由残基所组成的.末端结构域,含有一 个扭曲的反平行的桶形 以及两个一平板,并 有一个一螺旋在旁侧;由残基?构成的一末端结构域,含有一个较小的 结构域图.。随后,萤光素酶和其底物一一 】共结晶结构也被解析出来,揭示了酶和底物结合 时构象的变化图.。在萤光素酶的三级结构的研究中发现,与生物发 光相关的氨基酸残基分别是、、、、、、、 和等,这些残基分别和相应的反应物结合进而催化发出黄绿色荧光 【。 山东人学硕学位论文 ? ,? ?? ? ? ,??? 图.萤火虫萤光素酶 :与其配体棍状的共结 晶复合物的三维结构飘带图,该图由软件制作;与萤火虫萤光 素酶相互作用示意图,该图由和软件制作 萤火虫萤光素在萤光素酶的作用下可以产生绿色到红色. 的可 见光,生物发光的颜色受到内部因素和外界因素的双重影响。不同的反应环境如 溶剂的极性、值、离子强度和环境温度等对发光的颜色都会有影响;另一个 影响生物发光颜色的重要因素是其发光中间体氧化虫萤光素的各种 异构体的理化性质,如电荷转移、酸碱变化、发射光谱等。编码萤光素酶基因的 一些关键氨基酸的定点突变会引起萤光素酶性质的变化,从而导致发射波长的变 化。山东人学硕士学位论文 ...基于生物发光的萤火虫萤光素小分子探针的设计原理和研究进展 瞄多圳?..//~‖、尸警。爰 图.基于生物发光的萤火虫萤光素小分子探针的设计原理 有研究发现,萤火虫萤光素的’位置是与萤光素酶结合的关键位点,在萤火 虫萤光素或氨基萤光素的’位置引入较大的修饰基团后,阻断了酶与底物的相互 作用,使其不能发光。只有与特定的生物活性物质如酶、多糖、过氧化氢等 作用时,修饰基团被切除,释放出游离的底物,酶促反应才能发生。生物发光的 强度与游离的萤光素酶底物直接相关,进而能够可视化定量的评价生物活性 物质 的作用强度如图.所示。目前,应用这种原理设计的探针得到了快速的发 展。?.四肽序列是半胱天冬酶.一的保守识别序列。 ...氨基萤光素可以被.识别并将该四肽基团水解,产生游 离的氨基萤光素,在、和存在的条件下被萤光素酶催化氧化,发射 光子。.的活性与降解产生的游离氨基萤光素的能力直接相关,从而与 生物发光的强度相关联。因此可以通过生物发光的强度评价.的活性。 半胱天冬酶的活性是检测细胞凋亡的一个重要指标,因此这个生物发光探针成为 一个检测细胞凋亡的有效手段。这种检测手段的灵敏度、检测速度和准确度比运 用荧光技术高将近一百倍,。这种原理也被用于其他酶如.、糜蛋 白酶、胰蛋白酶、弗林蛋白酶、谷胱甘肽转移酶和单胺氧化酶等的生物发光探针 的设计.。酶类生物发光探针可以实现对药物效能和治疗过程的快速、高效 的评价。生物发光探针也可以用于具有生理活性的小分子如过氧化氢的检测 。表.详细列举了目前已经报道的基于萤火虫萤光素结构的小分子探针及 其检测项目。 山东大学硕士学位论文 表.基于萤火虫萤光素的小分子探针的结构及检测项目 结构 检测项目 参考文献 / 【,,】 一一。×广】 ? .‰。洲 ? 弑协。 。? 谷胱甘肽转移酶 】 。醚矽吒刚 刚贫舻一 .,卜 单胺氧化酶 】 。旺×广。/ 、‖, 内酰胺酶 ?埝。陬。。。 彬。×删 “ 八以。 一 碱性磷酸酶 】 。‖。旺?“ 。“ .。‖舯 羧肽酶 ?涮\.。。 多聚糖 严“丫“ 】 冷。取减飞。。。 硫酸酯酶 麟驴。员?旺×广洲山东大学硕士学位论文 了圹。麟乜一 / 弗林蛋白酶 】 ?而。亡”取一 萤光素酶 妒誓 光敏探针 【】 础‖ 过氧化氢 【 扩。乜 ”“” ?协?。。电屿。 嗣卜? 细胞摄取和外排 ?】 一、斌~,?, 萤光素酶 帕乜? .过氧化氢探针的研究进展 活性氧,顾名思义,是指机体内或者自然环境中存在的,含有氧原子并且性 质活泼的物质的总称。主要包括:一种激发态的氧分子一重态氧分子或称单 线 态氧分子,;三种含氧的自由基超氧阴离子自由基,‘?;羟自由基,?; 氢过氧自由基?;两种过氧化物过氧化氢,;过氧化脂质?; 以及一种含氮的氧化物等。过氧化氢是活性氧家族中的一个重要成员。 生物体内自发产生的适量的过氧化氢在细胞信号转导、能量合成、细胞生长 调节、 重要生物物质的合成及细胞代谢等方面都起到了不可或缺的作用.】。但是, 过量过氧化氢的存在却可以损伤细胞,引发各种疾病和老化,如癌症、心血管 疾 病、早老性痴呆、帕金森综合征等.。因此,检测和研究过氧化氢对疾病的 山东大学硕士学位论文 早期预防与诊断、发病机理的探索都有着非常重要的意义。然而,由于活性氧本 身寿命较短,稳态浓度极低,反应活性高,且存在于体内难以被捕获和检测。因 此,设计合成选择性好、灵敏度高、具有生物兼容性的探针用来检测活细胞和组 织内的过氧化氢是具有挑战性的前沿课题之一】。 目前,检测过氧化氢的方法主要有电子自旋共振法、化学发光法、分光光度 法、荧光法和生物发光法等。其中,荧光法和生物发光法因操作简便,灵敏度高, 能够实时检测活性细胞内目标生物分子的行为等优点而备受青睐。更加吸引人的 是探针分子可以在不破坏生物活性的情况下进入细胞,与胞内靶点结合,并通过 借助于激光共聚焦成像或者活体成像技术,实现细胞内待测活性物质的“可视 化”,从而实现对它们在生命体内进行“实时在线”的检.。 ’,’自身无荧光,当它被过氧化氢氧 化成’,,即二氯荧光黄时,发出强烈荧光】。通 过检测的荧光值就可以知道检测物质中的过氧化氢的水平。随后,为了提 高探针的脂溶性和膜通透性,的双乙酸酯衍生物. 被合成,它可以自由穿过细胞膜, ’,’. 进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成。而不能通透细胞膜, 从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的 生成有荧光的,进而检测活性氧的水平。随后,基于这种氧化机理,很多 探针如, ;双氨基化合物 ,, 一一,一 】 ? ,,,,一 和 『等被设计合成并应用于的检测。 这类化合物对活性氧的选择性较差,它们的荧光响应是一种氧化机理,不仅 对细胞内活性氧有响应,而且对其他的氧化物质抛有响应,因此会产生较高 的背 景干扰。为了克服上述这些缺点,等在探针分子中引入硼酸酯或硼酸 基团作为荧光开关,设计了基于去保护机理的活性氧荧光探针,能够高选择 性的 检测中的过氧化氢。硼酸酯或硼酸基团能使荧光团的荧光淬灭,因此探针 自身无荧光;同时,硼酸酯基团能够特异性地被过氧化氢水解为羟基,从而产 生山东大学硕士学位论文 荧光物质,其机理如图.所示。因此,引入硼酸酯识别基团能够提高探针分子 对中过氧化氢的选择性和灵敏度。基于这种机理,不同的荧光团如荧光素 【.、香豆素【】、吩嗯嗪、氧杂葸酮,等直接或通过可断裂连接臂与硼 酸基团相连,衍生了多样化的具有不同性质的过氧化氢探针。这些探针选取 的荧 光团不同,导致其发光性质和组织穿透性不同,各有优势和劣势,适合于不同 条 件下对细胞或活体动物的过氧化氢测定。 一三旦?。 ? 岖 ? 一 /\ 。洲土韵三 ? 图.以硼酸酯作为开关的过氧化氢探针的作用机理 年,等人报道了一种新型的基于生物发光的过氧化氢探针 .。这种探针克服了传统荧光探针的缺点,具有很高的灵敏度和选择性,实 现了对细胞和小动物实时活体成像,为近年来过氧化氢探针的发展趋势。 利用生物发光原理设计的过氧化氢探针,能够利用小动物活体成像实现对细 胞内和活体动物体内产生的过氧化氢的实时在线的可视化检测,具有非侵袭 性、 操作简便、灵敏度高,特异性和选择性强、能够准确定量等优点。 .氨肽酶探针的研究进展 ,是一类膜型锌离子依赖性的外肽酶,能 氨肽酶 够从多肽链的.末端逐个地将氨基酸降解。它在很多正常组织中分布广泛,但 是在肿瘤组织高水平表达,因此也被称作肿瘤细胞标记物或相关抗原】。 它与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和新生血管的生成都有着密切的关系。 已经成为抗肿瘤药物研究的一个重要生物靶点。然而,由于受到酶活性检 测和评价手段的限制,准确了解在肿瘤发生发展过程中的作用以及以 为靶点的抗肿瘤药物的作用机制还存在一定的难度。随着人们对研究的不 断深入,对其检测的要求也不仅限于对体外酶活性的测定,在活体动物中 活性的测定也越来越受到重视。现有的检测的方法包括免疫标记法、同位 山东大学硕士学位论文 素标记法和荧光法。免疫标记法只能用于体外酶活性的检测,但不能实现活体内 的检测;同位素标记法能够实现活体检测,但存在放射毒性。荧光法毒性较低, 但是其检测结果往往会受到激发光强度的、探针浓度及检测深度等外界因素的影 响,也不能实现活体动物的酶活性的定量检测。因此,合理地设计合成能够检测 活性新型分子探针,对于研究药物的肿瘤机制以及筛选以为靶标的抗 肿瘤药物的都有十分重要的作用。 .萤火虫萤光素酶底物的研究进展 萤火虫萤光素酶和萤光素酶底物有着较高的特异性。对萤光素结构的改造可能会 使其发光性质受到影响。而萤光素酶底物的单一性成为了生物发光成像技术推广 过程中的限制性因素。目前存在的萤光素酶底物主要是基于萤光素结构,尚未出 现结构全新的生物发光底物。萤火虫萤光素酶的天然底物.萤光素是在北美萤 火虫体内分离得到的。该结构具有两种构型,其中一.构型为有活性的构型, 而.构型为萤光素酶的竞争性抑黼】。近来有研究表明,.萤光素被辅酶 转化为.萤光素,产生生物发光现象。随后研究发现,.萤光素 ’.羟基被氨基取代后的氨基萤光素仍能与萤光素酶反应,产生生物发光。氨基 萤光素的生物发光发射光波长红移 红移至 ,且与萤光素酶具有 更强的亲和力。对萤光素酶与萤光素的构效关系研究发现’一氨基烷基化或者 环烷基化后仍能发射出可见光,。除此之外,.萤光素的苯并噻唑环和噻 唑啉环分别被苯并咪哗和咪哗啉环取代衍生的.萤光素类似物也能作为萤火虫 萤光素酶的底物发挥作用。另一类萤光素酶底物是将.萤光素或氨基萤光素 噻唑啉环中的硫元素用硒元素代替,使其发射波长分别红移至 和 。 图.详细列举了萤火虫萤光素酶底物的结构。.萤光素的类似物以及具有 新骨架的萤光素酶底物的发现能够拓展生物发光成像在生命科学领域的应 用,对 于整个成像领域的进步有着较大的推动作用。山东大学硕士学位论文 ?取广哪取广?叶“取烈广 ×,洲帅瓜汽。。旺/广州取? 图.萤火虫萤光素酶底物的结构 第二章基于萤火虫萤光素的过氧化氢生物发光探针 .过氧化氢生物发光探针的合理设计 , ‖ \ 图.过氧化氢生物发光探针的设计原理,该探针分子由三部分组成:能够被过 氧化氢识别的硼酸基团、能够产生生物发光的氨基萤光素以及将两者连接起 来的 可断裂连接臂 在过氧化氢探针的设计过程中,主要有两个重要部分需要考虑:对过氧 化氢具有较高选择性的识别基团的设计;具有较高灵敏度的报告基团的设 计。 此外,如何将结合基团和报告基团通过合理的方式相连也是在设计过程中需 要考 虑的一个重要因素。性质优良的过氧化氢探针应该具有以下特点:识别基团 必须能迅速响应并引起发光体性质和结构的变化;发光基团有着良好的组织 飞.山东大学硕士学位论文 相容性,发射波长较长,能够穿透组织。 在前期对过氧化氢探针大量调研的基础上,我们选择对过氧化氢的选择性高 的硼酸基团作为结合基团,而且水溶性的硼酸基团,有利于实现细胞和动物的成 像。同时考虑到上述生物发光成像的众多优势,我们选择氨基萤光素作为发光基 团。结合基团和发光基团通过可断裂连接臂苄氧羰基相连。研究表明,’ 位置是氨基萤光素与萤光素酶结合的关键位点,故该位置的化学修饰会影响底物 与酶的结合。因此,在位置引入可断裂连接臂和芳基硼酸基团的氨基萤 光素分子不能被萤光素酶氧化。而当其和过氧化氢相互作用时,硼酸被氧化成羟 基,引发电子重排和苄氧羰基的断裂,释放出氨基萤光素,继而经萤光素酶氧化 产生生物发光。因此可以通过生物发光的强度检测过氧化氢的浓度和在生理过程 中的作用如图.所示。所设计的探针分子通过生物发光成像实现对溶液、 细胞和动物水平过氧化氢的检测。 利用生物发光原理设计的基于萤火虫萤光素的过氧化氢探针,具有非侵袭 性,操作简便,灵敏度高,特异性和选择性强,能够准确定量等优点,能够利用 活体成像仪实现对细胞内和活体动物内过氧化氢的实时在线可视化检测。该 设计 思路具有良好的合理性和可行性。 .活性氧生物发光探针的合成 ..实验试剂和仪器 合成实验所用试剂:.氰基一.氨基苯并噻哗上海速博化学科技有限公司 .半胱氨酸盐酸盐.?、双频哪醇合二硼百灵威科技有限公司、 对溴苄醇韶远化学科技有限公司、西安凯利化工有限公司、四 氢呋喃、无水甲醇北京益利化学科技有限公司。除特殊说明外,其他常规试 剂均购于济南朝旭仪器设备有限公司。所有试剂均为化学纯或分析纯,使用 前经 过适当纯化处理。 合成用仪器:一旋转蒸发仪;.循环水式多用真空水泵 郑州长城科工贸有限公司;.集热式恒温加热磁力搅拌器郑州长城 科工贸有限公司;真空干燥箱上海树立仪器设备有限公司。 表征用仪器:熔点用熔点仪天津天光光学仪器公司测定,温度 山东大学硕士学位论文 删取沁一阶 凸取沁土 墨。百取粼广 妁氏。矿颧 山东大学硕士学位论文 乙酯溶解后用饱和溶液,饱和食盐水洗涤,无水硫酸镁干燥。滤除干燥 剂后,经柱层析纯化,洗脱液::,最后得白色固体,即为中间体。 真空干燥,称重. ,产率.%。 ,一鳓 .,,.,. ,,. ,/. ,,.,./. ,,.,. ,扣. ,, .,. ,,.,. ,,.,; .:/】.. 中间体.,,,.四甲基.,,.二氧硼戊环.一基苄基一氰基苯并噻唑基 氨基甲酸酯.的制备 氮气保护下,将中间体. ,双频哪醇合二硼. ,. 和醋酸钾. ,.,. ,. ,. 中,?反应过夜,监测至原料 溶于重蒸.二氧六环 完全反应,将反应液冷却至室温后用稀释,饱和食盐水洗涤,无水硫酸镁 干燥,滤除干燥剂后,旋蒸除去溶剂,经柱层析纯化,洗脱液::,得白 色固体,即为中间体?。真空干燥,称重. ,产率.%。 ,, ’. ,? .,,.,. .,./. ,,..,,.,.,,.,, .,; :/.,.. 目标化合物四....羧基.,。二氢噻唑一一基苯并噻唑..氨基甲酰基氧 甲基苯硼酸的制备 溶于二氯甲 氮气保护下,将已经制备的中间体.. ,. 烷和甲醇混合溶液. ,:。:,加入??. ,. 和. 的甲醇水溶液 ,。::, ,. , 室温避光搅拌 盐酸调节至?,旋蒸除去反应体系中的有机溶 剂。在蒸除有机溶剂的过程中不断有黄色固体析出。过滤,将滤饼用甲醇重 结晶, 得淡黄色固体,即为目标化合物。真空干燥,称重. ,产率为.%。 ? ,一比 .,,.,,.,, .?.,,.,.,,.,.,.,, .,。.,,.,.,,.,,.,., ’山东大学硕士学位论文 ,.,.,; ,嘲 .,.,.,.,., ? .,.,.,.,.,.,.,.,., . ,.,.; / .. . 【】., .过氧化氢生物发光探针的活性研究 ..实验试剂和仪器 实验试剂:超氧化钾、过氧化氢、次氯酸钠、过 氧化叔丁醇和过氧化氢酶购自阿拉丁试剂公司,盐酸多柔比星 ,安耐吉化学科技有限公司、重组萤光素酶 培养基、胰蛋白酶、澳洲胎牛 美国公司,货号、 血清。 除特殊说明外,其他常规试剂均购于济南朝旭仪器设备有限公司,实验用水 为去离子水。实验仪器和材料:光栅型多功能微孔板读数仪 、多功能酶标仪 、动物体内发光实时快速成像系统 ?、二氧化碳细胞培养箱 、台式离心机 、超净工作台.?,苏州安泰空气技术有限公司、倒置相差 显微镜、电热恒温水槽,北京长风仪器仪表有限公司、恒温 振荡器?,江苏太仓市实验设备厂、电子天平. 、酸度计 、个人微型高速离心机 、细胞培养瓶、孔全黑微孑板、孔全白微孔 板、孔透明底黑色微孔板、移液枪。 实验细胞:绿荧光蛋白和萤光素酶双重标记的人卵巢癌细胞... 及人前列腺癌细胞...由北京中科汇文遗传技术发展中心构建。 细胞培养:...细胞株在含%的 培养基中贴 壁生长,并置于?,%细胞培养箱内培养。 实验动物:周龄雌性/小鼠,购于北京维通利华实验动物技术有限山东大学硕 士学位论文 公司。 动物造模:采用肿瘤组织块法建立人卵巢癌的裸鼠皮下移植瘤模型。健康的 /小鼠,体重: ,周龄周,雌性,常规饲养,在小鼠两侧腋下接种...肿瘤细胞悬液. ,小鼠接 种约天后腋下 . 见肿瘤生长,荷瘤成功率。当肿瘤生长到. 时,收获肿瘤,切成约. : . 大小的肿瘤块。将肿瘤组织块进行皮下移植瘤的接种,接种部位为 裸鼠的左肢腋下。接种前以碘伏消毒穿刺部位,穿刺点距离接种的肿瘤部位 约 . ,拔出穿刺针时轻轻按压穿刺点处。接种后.周进行成像测定。 缓冲液的配制方法:.缓冲液的配制方法:准确称取. ,加去离 ? 子水溶解,用. .,后定容至 ,保存于。冰箱中即 的盐酸调节 可。 含. , .缓冲液的配制 , 方法:准确称取. 、. 和. ,加去离子水溶解,用 . .后,定容至 ,保存于?冰箱中即可。 的盐酸调节.磷酸盐缓冲液配制方法: ,. , .,. , , .,准确称. ,. ,溶于 去离子水中,用. 的盐酸调节 和. 溶液的值至.,最后加去离子水定容至 ,保存于。冰箱中即可。 ..实验方法 ...过氧化氢生物发光探针的体外选择性研究 探针对过氧化氢的荧光响应及动力学常数的测定 .,检测了所设计的过氧化氢生物发光 首先在接近生理环境的条件下 探针对的响应和荧光性质的变化,根据过氧化氢探针在降解前后荧光性 质的变化来测定其二级动力学常数。 过氧化氢探针荧光性质的测定:首先用 ?缓冲液配制浓度为 的溶液,包括、、、过氧化叔丁醇、?、 。和?,其中是由与其倍量的反应得到,?是由 和其倍量的反应得到的,?是由与其倍量的反应得到的。山东大学硕士学位论 文 用 . .缓冲液将过氧化氢探针配制的浓度为“的溶 的溶液,?恒温 液,加入到黑色的孔板中,同时加入等体积 摇床反应 后进行荧光光谱扫描测定九 。分别测定探针 作为阴性和阳性对照。 和氨基萤光素州的荧光性质九 将等体积的过氧化氢溶液、和 加入到浓度为山的过氧化氢 探针溶液中,设定 , ,测定其荧光值,每隔测定一 次,连续测定 ,计算过氧化氢与探针反应的二级速率常数。 探针对过氧化氢的选择性测定 为进一步测试探针的识别活性,分别测试了探针与不同反应后的生物 发光强度变化。 用 ?含. .分别将过氧 , , 化氢探针和配制成浓度为 和 的溶液。将此过氧化氢 探针溶液 和“溶液“加入到白色的孔板中, ?恒温摇床反应 ,然后加入 的萤光素酶溶液 含有 时测定其生 /。用酶标仪分别在、、、、、和 物发光强度。用等体积的缓冲溶液代替溶液,其他反应条件不变,作为空 为不同的实际生 白对照。相对生物发光强度值 物发光强度 与空白对照的生物发光强度的比值。 过氧化氢探针对不同浓度过氧化氢的响应测定 此外,为了进一步的验证过氧化氢生物发光探针的灵敏性,我们测定探针 .含. 对不同浓度的响应。用 和 配制浓度为、、、、、和 的过氧化氢溶液。将 过氧化氢探针溶液 和此不同浓度过氧化氢溶液加入到白色的孔板中,?恒 温摇床反应 ,然后加入 含有 的萤光素酶溶液 测定其生 /。用酶标仪分别在、、和 物发光强度。 活性氧对氨基萤光素生物发光性质的影响 为了验证活性氧对氨基萤光素和萤光素酶的反应活性的是否会产生影响,我 们测定了氨基萤光素与不同的活性氧的响应情况。将 的氨基萤光素溶液山东大学硕士学位论文 与此的溶液州加入到白色的孔板中,?恒 温摇床反应 ,然后加入 的萤光素酶溶液 .含有 测定其相对生物发光 “/。用酶标仪分别在、、、、、和 强度。 ...过氧化氢生物发光探针的细胞活性研究 上述反应检测了过氧化氢探针对溶液中过氧化氢的识别活性,为进一步证 实该过氧化氢探针能够检测细胞中产生的微量的过氧化氢,我们对过氧化氢 探 针的细胞活性进行了测试,主要包括对细胞外源性过氧化氢及细胞自身产生 的微 量的过氧化氢的检测。 过氧化氢探针对细胞外源性过氧化氢的成像研究 本实验选取...细胞株进行活性测试和成像研究。 .将处于对数生长期的单层细胞,消化离心后,用培养基吹打均匀。进行 细胞计数,根据计数结果,用培养基配成×/的细胞悬液。 .在黑色的孔板中每孔加入此细胞悬液,相当于×/孔,空白 。 组不加细胞,于?,%细胞培养箱中孵育 .吸去培养基,并用洗涤后,分别加入此不同浓度的过氧化氢 溶液终浓度为.? 和此过氧化氢探针溶液终浓度肚, 后进行成像。 过氧化氢探针对细胞内源性过氧化氢的成像 下一步我们开展了对过氧化氢探针检测活细胞中内源性过氧化氢的研究。 众所周知,盐酸多柔比星是一种高效、广谱的抗肿瘤药物。它能够通过刺激 细胞产生过氧化氢,从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。因此,本实验选取阿霉 素作为刺激物,刺激细胞产生内源性过氧化氢。 过氧化氢探针可能会通过两种途径被降解,产生生物发光:探针穿 透细胞膜进入细胞中,被细胞内的过氧化氢水解,释放氨基萤光素,产生生物 发 光;探针被细胞外的过氧化氢水解为氨基萤光素后再穿透细胞膜,与细胞 内的作用,产生生物发光。为了验证上述两种推断,我们在细胞中加入过 氧化氢酶。过氧化氢酶是存在于细胞中的能够将氧化过氧化氢水解为水和氧气的 酶,能够清除细胞中产生的过氧化氢。外源性加入的过氧化氢酶不能穿透细胞膜山东大学硕士学位论文 进入细胞中,只能水解细胞问质中的过氧化氢。因此,可以降低细胞间质中过氧 化氢的水平,但是不会降低细胞内过氧化氢的水平。 我们将..?细胞与盐酸多柔比星孵育,从而刺激细胞 中的过氧化氢浓度上升。外源性加入过氧化氢酶能够清除细胞间质的过氧化氢。 .将处于对数生长期的单层细胞,消化离心后,用培养基吹打均匀;进行 细胞计数,根据计数结果,用培养基配成/的细胞悬液。 .在黑色的孔板中每孔加入 细胞悬液,相当于/孔,空白 组不加细胞,于?,%细胞培养箱中孵育。 .在孔板中分别加入 不同浓度的溶液终浓度为... ,孵育 ,刺激细胞中产生过氧化氢。 /,以清除细胞 .向孔板中分别加入此过氧化氢酶 外产生的过氧化氢。对照组加入灶培养基。将孔板置于?,% 。 细胞培养箱中孵育. .倒掉培养基,用洗涤后,加入 过氧化氢探针溶液 , 之后用活体成像仪进行细胞成像。 .结果与讨论 ..过氧化氢探针的体外活性测定 ...荧光性质和动力学常数测定结果 反应前后荧光光谱变化如图.所示。由图可知,过氧化氢探针本身的 荧光很弱,当以 /波长激发时,其最大发射光谱在 ;当与过氧化氢 作用后,其最大发射光谱的波长红移至 ,且其荧光强度增加了约.倍。 所合成的探针荧光性质与氨基萤光素有着很大的差别。在氨基萤光素的’.氨基 位置引入苄氧羰基硼酸,会引起物质荧光性质的改变。由于硼酸基团对荧光的淬 灭作用,探针自身仅有很弱的荧光,当探针与过氧化氢反应后,硼酸基团能够被 选择性切除生成羟基,进一步发生分子内的电子重排,生成氨基萤光素,从而能 够产生很强的荧光。从图中我们还可以看出,过氧化氢探针不仅对过氧化氢有 响应,而且对和亦有响应,荧光强度分别增大了.倍和.倍。对其 它活性氧无响应。图.显示了氨基萤光素的最大发射光谱在 ,与探针 山东大学硕士学位论文 水解后光谱性质相同,在一定程度上说明探针被水解为氨基萤光素。 ?卜?? ?. /‘\二堂主。 / 蚕一 \ ‘ 、 , 景 \ 毛 \ ., 毒 \ 害 ‘\ 主 爹卜 ./ 。。么二?一二一“ 舯 图.氨基萤光素虚线和探针实线的荧光性质,浓度“,九 : 对探针荧光性质的影响,探针浓度为 ,溶液浓度 为 ,; . . . . . . . . . 图.伪一级速率常数’与浓度的线性关系 根据探针与过氧化氢反应前后荧光性质的变化可以测定过氧化氢和探针 反应的二级动力学常数,探针的荧光发射峰为 ,在 处的荧光强 度随着反应的进行而逐渐降低,而在 处的荧光强度逐渐增大。 荧光法测定的反应伪一级反应速率方程为。/瓢.’,其中。为反应时 间时的 处的荧光强度,眦;为 处的起始荧光强度,’为伪一级 反应速率常数。二级反应速率常数’,其中为过氧化氢的浓度,计算得: .?. 。一。 ...过氧化氢探针对不同的选择性测试结果 从图.中可以看出,在加入萤光素酶 后,探针对的响应值 是空白组的倍,对的响应值是空白组的倍,对的响应值是空白组 山东大学硕士学位论文 的.倍,对、?、‘、?的几乎无响应。由此可见,探针对 和具有较好的识别活性和选择性,是较有潜力的识别探针。 图.过氧化氢生物发光探针在加入萤光素酶后不同时间对不同类型的 响应,每组数据重复三次 ...过氧化氢探针对不同浓度过氧化氢的响应结果 由图.可知,探针的生物发光强度在一定范围内随过氧化氢的浓度增加而 增加,且在过氧化氢浓度为. 的范围内时,相对生物发光强度和过氧化 氢浓度呈现良好的线性关系.。 该过氧化氢探针在溶液的测定结果显示了对良好的选择性,且测定 通过生物发光的强度定量检测溶液中过氧化氢的浓度变化。 山东人学硕十学位论文 ...活性氧对萤光素酶生物发光过程的影响 从图.中可以看出,不同的对氨基萤光素和萤光素酶的生物发光性 质无明显的影响。但是加入后,随着时间的延长,相对生物发光强度随着时 间的延长有了明显的下降,推测可能是影响了萤光素酶氧化氨基