离子交换色谱

离子交换色谱 色谱分离第一节 概述 第七节 离子交换色谱 一、色谱的基本概念 一、离子交换色谱相关理论 二、色谱法的分类 二、离子交换色谱介质离子交换剂第二节 常规柱色谱分离技术 三、离子交换色谱实验技术 一、常规柱分离技术分类 四、离子交换色谱的应用 二、装柱方法 第八节 亲和色谱 三、加样方式 一、基本原理 四、展开与洗脱 二、亲和色谱配体 五、柱填料 三、亲和吸附剂第三节 高效液相色谱 四、亲和色谱实验技术第四节 吸附色谱 五、亲和色谱的特殊类型 一、吸附色谱原理 六、亲和色谱的应用 二、吸附色谱影响因素 第九节 疏水作用色谱 三、吸附色谱填料 一、疏水作用色谱基本原理 四、吸附色谱的应用 二、疏水作用色谱介质第五节 反相色谱 三、疏水作用色谱实验技术 一、反相色谱原理 四、疏水作用色谱的应用 二、反相色谱介质 第十节 模拟移动床色谱 三、反相色谱流动相 一、基本原理 四、反相色谱实验技术 二、模拟移动床的应用 五、反相色谱的应用 第十一节 超临界流体色谱第六节 凝胶色谱 一、基本原理 一、凝胶色谱原理 二、超临界流体色谱法的色谱柱 二、凝胶色谱介质 三、超临界流体色谱法的流动相和改性剂 三、凝胶色谱实验技术 四、超临界流体色谱法的应用 四、凝胶色谱的应用 第十二节 高速逆流色谱 第四节离子交换色谱 离子交换色谱ion-exchange chromatography，IEC是发展最早的色谱技术之一。20 世纪 30 年代人工合成离子交换树脂的出现对于离子交换技术的发展具有重要意义，基于苯乙烯-二乙烯苯的离子交换树脂至今仍是最广泛使用的一类离子交换树脂。但它并不十分适合对生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等的分离，因为:?树脂交联度太大而颗粒内网孔较小，蛋白质分子无法进颗粒内部，只能吸附在 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面，造成有效交换容量很小?树脂表面电荷密度过大，使蛋白质在其上吸附得过于牢固，必须用较极端的条件才能洗脱，而这样的条件往往易造成蛋白质变性?树脂的骨架具疏水性，一旦与蛋白质之间发生疏水相互作用，也容易造成蛋白质变性失活。 20 世纪 50 年代中期，Sober 和 Peterson 合成了羧甲基CM-)纤维素和二乙氨乙基(DEAE-)纤维素，这是两种亲水性和大孔型离子交换剂。其亲水性减少了离子交换剂与蛋白质之间静电作用以外的作用力，而大孔型结构使蛋白质能进人网孔内部从而大大提高了有效交换容量，而纤维素上较少的离子基团有利于蛋白质的洗脱，因此这两种离子交换剂得到了极为广泛的应用。此后，多种色谱介质特别是颗粒型介质被开发和合成，包括交联葡聚糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酞胺以及一些人工合成的亲水性聚合物等，以这些介质为骨架结合上带电基团衍生而成的离子交换剂也层出不穷，极大地推动了离子交换技术在生化分离中的发展和应用。一、离子交换色谱相关理论 一基本原理 离子交换色谱分离生物分子的基础是待分离物质在特定条件下与离子交换剂带相反电荷因而能够与之竞争结合，而不同的分子在此条件下带电荷的种类、数量及电荷的分布不同，表现出与离子交换剂在结合强度上的差异，在离子交换色谱时按结合力由弱到强的顺序被洗脱下来而得以分离。离子交换色谱的原理和一般步骤如图 4.14 所示。 蛋白质、多肽、核酸、聚核苷酸、多糖和其他带电生物分子正是如此通过离子交换剂得到了分离纯化， 即带负电荷的溶质可被阴离子交换剂交换，带正电荷的溶质可被阳离子交换剂交换。 二基本理论 1 . 离子交换作用 离子交换剂由不溶性高分子基质、 荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成，在水溶液中，与功能基团带相反电荷的离子包括缓冲液中的离子、蛋白质形成的离子依靠静电引力能够吸附在其表面如图 4. 15 所示。这样，各种离子与离子交换剂结合时存在竞争关系。 无机离子与交换 剂的结合能力与离子所带电荷成正比，与该离子形成的水合离子半径成反比。也就是说，离子的价态越高，结合力越强;价态相同时，原子序数越高，结合力越强。在阳离子交换剂上，常见离子结合力强弱顺序为:LiltNaltKltRbltCs Mg2ltCa2ltSr2ltBa2 NaltCa2ltAl3ltTi4图 4.15 离子交换色潜中所进行的离子交换过程以阳离子交换树脂为例 — — — —在阴离子交换剂上，结合力强弱顺序为:F ltCl ltBr ltI 目的物与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液 pH， 它决定了目的物的带电状态，此外还取决于溶液中离子的种类和离子强度。起始条件，溶液中离子强度较低，上样后，目的物与交换剂之间结合能力更强，能取代离子而吸附到交换剂上洗脱时，往往通过提高溶液的离子强度，增加了离子的竞争性结合能.力，使得样品从交换剂上解吸，这就是离子交换色谱的本质。 2. pH 和离子强度 I 的影响 pH 和离子强度 I 是控制蛋白质离子交换行为、分辨率、回收率等的重要因素。 pH 决定了目标分子及离子交换剂的带电荷情况，因而是决定目的物是否发生吸附的最重要参数。分离时，应控制 pH 使得目标分子和离子交换剂带相反的电荷。一方面，离子交换剂有一个工作 pH 范围，在此范围内能够确保离子交换剂带充足的电荷;另一方面，溶液的pH 直接决定了目标分子带电荷的种类和数量，选择适当的 pH， 能够保证目标分子与离子交换剂带相反电荷而被吸附，同时如果 pH 距离目标分子等电点过远，则造成目标分子与离子交换剂结合过于牢固而不易洗脱。 在选择操作 pH 时还需特别注意目标分子的 pH 稳定范围，若超出此范围会造成目标分子活性丧失，导致回收率下降。特别是要考虑到由于道南效应 Donnan)的存在，离子交换剂表面 pH 与溶液 pH 是不一致的，离子交换剂是亲水的，其表面有一层水膜，水膜里可以看作是离子交换剂的微环境。在阳离子交换剂表面的微环境中，H被阳离子交换基团吸引而 —OH 被排斥，造成交换剂表面 pH 比周围缓冲液中低 1 个 pH 单位;而阴离子交换剂表面的 —微环境中， OH 被阴离子交换基团吸引而 H被排斥， 造成交换剂表面 pH 比周围缓冲液中高1 个 pH 单位。例如，某蛋白质在 pH5 时被阳离子交换剂吸附，实际上该蛋白质在交换剂表面是处在 pH4 的环境中， 若此蛋白质在此 pH 条件下不稳定将会失活。 大多数蛋白质在 pH4以下稳定性都会下降而使回收率很低。 由于溶液中的其他离子与目标分子竞争结合到离子交换剂上，因此离子种类和离子强度 I是影响月标分子结合和洗脱的另一重要因素。 低离子强度下， 目标分子通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上当竞争离子浓度即离子强度 I 逐渐升高时，目标分子逐渐被置换下来。绝大多数目的物在 1mol/L 的盐浓度下能够被洗脱，.因此在探索条件阶段，人们常把洗脱盐的终浓度定为 1mo1/L。事实上在溶液中盐类还常扮演稳定目的物结构的角色，另外，不同离子从交换剂上将目的物置换下来的能力是不同的，并且离子类型还会对分辨率和不同蛋白质的洗脱顺序产生影响。 3. 疏水相互作用和氢键 虽然目的物.与离子交换剂发生结合主要依靠相反电荷之间的离子键，但实际上此过程中还可能存在其他的作用力，常见的就是疏水相互作用和氢键。 疏水相互作用主要出现在使用带非极性骨架的离子交换剂时， 例如离子交换树脂，特别是聚苯乙烯树脂， 骨架带有较强的疏水性，能与目的物分子中的一些疏水性氨基酸残基之间通过疏水相互作用结合。现代 HPLC 中仍有部分色谱介质以树脂为骨架。氢键主要出现在使用以亲水性高分子为骨架的离子交换剂，如以 Sephadex 或 Sepharose 为基质的离子交换剂，骨架糖链中的轻基、羧基等基团能够与目的物分子中带亲水侧链的氨基 酸残基之间形成氢键。 当目的物与杂质在电性质方面很接近时，这些额外的作用力在分离时起着决定性的作用，据此往往可实现分离。 4.离子交换动力学 离子交换的发生及进行的程度即离了交换平衡取决于离子作用， 而离子交换动力学则取决于离子交换剂的颗粒结构。 离子交换剂的骨架是具有网孔状结构的颗粒状凝胶， 而荷电功能基团均匀分布在凝胶颗粒的表面及网孔内部，可交换分子依据分子量的不同，不同程度地进人凝胶颗粒内部，将荷电功能基团上的反离子置换下来而自身结合到离子交换剂上。 从动力学角度分析，整个过程可分为 5 个步骤图 。4. 16) ?可交换分子在溶液中经扩散到达凝胶颗粒表面。 亲水性的凝胶和水分子形成氢键，从而在凝胶表面束缚了一层结合水构成水膜， 水膜的厚度取决于凝胶的亲水性强弱、色谱时流速的快慢，亲水性越强、流速越慢，水膜越厚，反之水膜越薄。可交换分子通过扩散穿过水膜到达凝胶表面的过程称为膜扩散， 速度取决于水膜两侧可交换分子的浓度差。 ?可交换分子进入凝胶颗粒网孔，并到达发生交换的位置，此过程称为粒子扩散，其速度取决于凝胶颗粒网孔大小交联度、交换剂功能基团种类、可交换分子大小和带电荷数等多种因素。? 图 4.16 离子交换动力学示意 以阳离子交换剂为例可交换分子取代交换剂上的反离于而发生离于交换。 ?被置换下来的反离子扩散到达凝胶颗粒表面，也即粒子扩散，方向与步骤?相反。?反离子通过扩散穿过水膜到达溶液中，即膜扩散，方向与步骤?相反。 根据电荷平衡的原则，一定时间内，一个带电分子进人凝胶颗粒，就有与该分子所带净电荷数相当数量的反离子扩散出凝胶颗粒。 上述 5 个步骤实际上就是膜扩散、粒子扩散和交换反应 3 个过程。其中交换反应通常速率比较快，而膜扩散和粒子扩散速率较慢，当溶液中可交换分子浓度较低时， 膜扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤; 当溶液中可交换分子浓度较高时， 粒子扩散过程往往最慢而成为整个过程的限制性步骤。 灌注色谱动力学角度分析，就是通过独有的二元孔网络结构，可使粒子扩散速率大大提高，从而使整个过程效率提高。 三离子交换的分辨率 同其他色谱分离一样，离子交换的效果常用两个目标峰的分辨率Rs来描述。 一个纯化系统能够达到的分辨率取决于该系统的选择性、效率和容量，这是柱色谱中的 3个最重要的参数。Rs 的解析表达式为: 1 a -1 k Rs N (4.7) 4 a 1 k式中 a ——选择性 N ——柱效率 k’——容量因子1.容量因子容量因子 k’又称保留因子，是色谱分离中常用的组分保留值表示法。k t R t 0) t 0 VR V0 / V0 ( / (4.8)式中 tR 和 VR——溶质的保留时间和保留体积 t0 和 V0——非滞留组分的保留时间和保留体积一般来说，容量因子 k’的取值与可交换分子在固定相离子交换剂和流动相缓冲液中的分配性质、色谱温度及固定相和流动相的体积比有关，而与柱尺寸和流速无关。 2. 柱效率 柱效率用在特定实验条件下色谱柱的理论塔板数 N 来表示，通常表示为每米色谱床所包含的理论塔板数，其计算公式: 2 V N 5.54 R W (4.9) h式中 VR——洗脱峰的洗脱体积 Wh——洗脱峰半峰高(h1/2)时对应的峰宽 柱效率下降会导致色谱时区带变宽，也就是洗脱峰的峰宽变大口导致区带变宽的原因之一是可交换分子在色谱柱床中发生纵向扩散，采用尺寸较小的凝胶颗粒作为离子交换剂的基质，可有效减小能够发生纵向扩散的距离，从而大大提高柱效率。现代离子交换色谱介质中有些是以很小的颗粒作为基质的小于 3m) ，它们有非常高的柱效率，但它们往往是非孔型的，可交换分子只能结合在其表面，因而此种离子交换剂的交换容量会下降。另外，随着基质颗粒的减小，色谱分离时产生的背景压力会增大，不利于进行快速、 大规模的色谱。除基质颗粒大小外，实验技术是影响柱效率的另一重要因素，色谱柱床面不平整，柱床内有气泡等都会导致柱效率下降。因此色谱过程中操作条件的控制对色谱效果影响很大。3.选择性选择性是一个系统分离不同蛋白峰的能力，习惯用相对保留值 a 来表示，a 定义为 k 2 VR 2 V0 VR 2 a 4.10 k 1 VR1 V0 VR1式中 k1’和 k2’——洗脱峰 1 和 2 的容量因子 VR1 和 VR2——洗脱峰 1 和 2 的洗脱体积 V0 ——非滞留组分的洗脱体积从对分辨率的影响上来看，好的选择性往往比高的柱效率更为重要图 4.17。 影响到离子交换色谱时选择性的因素包括:离子交换剂上功能基团的性质和数量，pH 和离子强度等实验条件。由于上述实验条件是容易调控的， 因而人们更乐于通过控制实验条件来提高选择性，从而获得好的分辨率。 根据前面所述 Rs 的解霰泶锸娇芍颂岣咭桓龇掷牍痰姆直媛?RS 以达到满意的分离效果，必须满足以下条件:?agt1，当 VR1-V R2 时 a1，此时两峰完全重叠，分辨率为0，a 值越大，两洗脱峰相距越远，分辨率越高;?N 尽可能大，理论塔板数越大，柱效率越高，分辨率也越高;?k’?0，根据 k’的计算公式，当两种蛋白的洗脱体积 VR1 和 VR2均等于非滞留组分的洗脱体积 V0 时 k’,0，此时无法实现分离，分辨率为 0，选择合适的色谱条件，使得至少一种蛋白质在离子交换剂上发生吸附，就能满足 k’?0，增加 k’的值将提高分辨率 Rs，有利于分离。 二、离子交换色谱介质离子交换剂 离子交换剂是离子交换色谱的基础， 它们决定着分离过程的分辨率，同时还决定着分离的规模和成本，现代离子交换技术的进步得益于优质高效离子交换剂的研制和应用。 一基本结构 离子交换剂由水不溶性基质和共价结合在基质上的带电功能基团组成， 带电功能基团上还结合有可移动的与功能基团带相反电荷的反离子又称平衡离子。反离子可被带同种电荷的其他离子取代而发生可逆的离子交换， 此过程中基质的性质不发生改变。离子交换剂所带功能基团分为酸性基团和碱性基团两类，其中带酸性功能基团的离子交换剂在工作 pH 范围内解离放出质子而带有负电荷，能够结合溶液中带正电荷的离子阳离子，因此被称为阳离子交换剂;而带碱性功能基团的离子交换剂在工作 pH 范围内结合质子而带有正电荷，能够结合溶液中带负电荷的离子〔阴离子，因此被称为阴离子交换剂。 基质是一类水不溶性的化合物，理想的墓质应当满足以下条件:?有较强的机械稳定性，能适合高流速的需要;?具有亲水性，至少在颗粒表面应当是亲水性的;?高化学稳定性，在很宽的 pH 范围内保持稳定，耐去污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便色谱前后的清洗和消毒灭菌;?高的交换容量，以满足分离较大规模样品的需要;?球形，颗粒直径均匀;?价格尽可能便宜以降低分离成本。 二功能基团和酸碱性质 带电功能基团决定了离子交换剂的基本性质， 功能基团的类型决定了离子交换剂的类型和强弱，它们的总量和有效数量决定了离子交换剂的总交换容量和有效交换容量。 根据功能基团是酸性基团还是碱性基团，离子交换剂分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。此外，根据功能基团的解离性质，离子交换剂还可分为强型离子交换剂和弱型离子交换剂，强弱并不是指可交换分子与交换剂结合的牢固程度，而取决于带电功能基团的 pKa 值。强型离子交换剂带有强酸性或强碱性功能基团，其 pKa 值很低或很高，远离中性，因此解离程度大，在很宽的 pH 范围内都处于完全解离状态;弱型离子交换剂则带有弱酸性或弱碱性功能基团，其 pKa 值与强型交换剂相比靠近中性，工作 pH 范围较窄，超出此范围会造成解离程度下降，带电荷数量明显减少。当色谱 pH 远离 pKa 时，无论是强型还是弱型离 子交换剂都能牢固吸附可交换分子。结合上述两种分类方法，离子交换剂可以分为强酸型强阳、强碱型强阴、弱酸型弱阳和弱碱型弱阴四种。 表 4.7 列出了较为常用的离子交换功能基团的名称和种类。强酸型离子交换剂中最常用的是磺基，弱酸型最常用的是羧基，强碱型最常用的是季铵基，弱碱型最常用的是氨基。除了磷酸基外，其他功能基团一般都只带单个正电荷或负电荷。三离子交换剂的部分性质 1..粒度 用于生化分离的离子交换剂的颗粒直径一般都在 3300m 林二范围内。基质颗粒大小直接关系到分离效果，细颗粒的介质常适用于分析型分离，大颗粒介质适合于制备型分离。除颗粒大小外，基质颗粒的均匀程度对分离效果的影响也很大，颗粒直径越均一，分离效果越好。 2..交联度和网孔结构 离子交换剂的基质是通过交联剂将线型大分子交联形成网孔状颗粒。 不同的离子交换剂使用不同的离子交联剂，例如，聚苯乙烯树脂使用二乙烯苯作为交联剂，葡聚糖和纤维素交换剂使用环氧教丙烷作为交联剂， 琼脂糖交换剂使用二嗅丙醇作为交联剂。 交联度的大小影响着离子交换剂的很多特性，包括机械强度、膨胀度、网孔大小、交换容量等。一般交联度越高，网孔的孔径越小，交联度越低，网孔孔径越大。离子交换常用介质具有网孔状结构，色谱分离时往往具有分子筛和离子交换双重功效。 3.电荷密度 电荷密度是指恭质颗粒上单位表面积的取代基功能基团的数量，它决定着离子交换剂的交换容量、膨胀度等性质。对小分子进行离子交换时，离子与功能基团按 1?1 的物质的量之比结合，交换剂上功能基团密度越大，工作能力越强，高电荷密度的离子交换剂具有优势。但蛋白质类大分子进行离子交换色谱时，决定交换容量方面，交联度比电荷密度重要得多。 如果基质颗粒孔径太小以致蛋白质分子不能进人颗粒网孔。即使颗粒表面电荷密度很大，交换容量也不高。此外，蛋白质类分子带电荷数量往往较多，与交换剂上功能基团结合不是1:1 的物质的量之比关系，而是多点结合，过高的电荷密度会导致蛋白质在离子交换剂上结合过于牢固而难以洗脱，极易造成蛋白质变性，回收率下降。因此，适合蛋白质类分子离子交换的介质电荷密度往往较低。 4.膨胀度 又称吸水值， 是指当干态的离子交换剂在水溶液中吸水后造成体积膨胀的程度， 通常用每克干胶吸水膨胀后的体积mL来表示。影响离子交换剂膨胀度的因素如下。 ?基质种类。一般来说，具亲水性基质的离子交换剂膨胀度要大大高于具有疏水性基质的离子交换剂，前者膨胀度可达到 60mL/g 干胶，而后者有时在溶液中体积变化非常小。 ?交联度。无论是哪一类离子交换剂，其膨胀度都随着交联度的增加而下降。 图 4. 18 显示了 4 种基于交联葡聚糖凝胶 Sephadex 的离子交换剂在不同交联度下的膨胀度情况，由于 Sephadex G -25 交联度高于 Sephadex G-50 所以相应的 Sephadex A-50 和 SephadexC-50 交换剂膨胀度分别高于 Sephadex A-25 和 Sephadex C-50。 ?带电基团的强弱。在相同交联度的情况下，Sephadex A-50 和 Sephadex C-50 系列的离子交换剂比它们的基质 Sephadex G-50 膨胀度大得多，原因在于功能基团带同种电荷，相互排斥而扩展了凝胶颗粒的体积， 同样的道理，强酸型和强碱型离子交换剂由于带电荷数量多于相应的弱酸型和弱碱型离子交换剂，其膨胀度相应地也比后者高口 ?溶液的离子强度和 pH 对于某种特定的离子交换剂，膨胀度不是常数，其数值受到溶液离子强度和 pH 值的影响.