细胞自噬增强双氧水对Jurkat细胞DNA的损伤.doc

细胞自噬增强双氧水对Jurkat细胞DNA的损伤.doc 细胞自噬增强双氧水对Jurkat细胞DNA的损伤 摘要:目的 研究细胞自噬条件下双氧水对Jurkat细胞DNA损伤的影响。方法 利用EBSS平衡盐溶液诱导Jurkat细胞自噬，并经WB确定，然后用50 mM双氧水处理1 h，单细胞凝胶电泳检测，荧光显微镜观察与casp软件分析DNA拖尾情况。结果 在EBSS诱导的Jurkat细胞发生了自噬，LC3-?/?比值升高，双氧水对细胞DNA的损伤出现尾距增长，具有统计学差异(P<0.05)。结论 细胞自噬发生后，增强了双氧水对Jurkat细胞的DNA损伤作用。 关键词:细胞自噬;双氧水;DNA损伤 细胞自噬(autophagy)是机体组织和细胞稳态的必需，缺失将伴随很多疾病的发生，包括:神经退行性疾病、肿瘤、心脏病、脂肪肝、糖尿病和克罗恩病等，是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程[1]。细胞自噬在肿瘤发生发展中关系密切，研究报道5-氮杂-2'-脱氧胞苷可诱导乳腺癌细胞自噬，其机制可能与其所诱导的DNA损伤有关[2]，DNA损伤是诱导细胞自噬的原因之一[3]。但也有报道认为，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-AM)能加强X射线对人下咽癌细胞的致DNA损伤作用[4]，体外实验显示，药物诱导的细胞自噬，往往伴随着细胞周期的停滞和DNA 的修复[5]。因此，有必要对细胞自噬与DNA损伤做进一步研究，了解细胞自噬的发生也有可能增强DNA的损伤。我们将利用饥饿诱导Jurkat细胞自噬后进行双氧水(H2O2)处理，观察细胞DNA损伤的情况。 1 资料 新概念英语资料下载李居明饿命改运学pdf成本会计期末资料社会工作导论资料工程结算所需资料清单 与方法 1.1一般资料 小牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI1640培养基(含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)购于杭州吉诺生物医药技术有限公司;兔抗LC3和Anti-rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)购于cell signaling公司、actin兔抗购于杭州华安生物公司;western blot凝胶电泳试剂购于武汉谷歌生物技术公司;PVDF膜为Millipore公司产品;Green-DNA Dye核苷酸胶体染料购于上海生工公司;低熔点琼脂糖为Amresco产品;H2O2购于国药集团化学试剂公司;EBSS平衡盐溶液为GIBCO公司产品;蛋白提取试剂盒购于碧云天生物技术公司;T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat为本实验室冻存细胞。 1.2方法 1.2.1细胞培养 细胞株Jurkat培养于含10%小牛血清的RPMI1640(100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素)的细胞培养剂中，置于37?、饱和湿度和5%二氧化碳孵箱中培养，待生长呈对数期时备用。 1.2.2饥饿处理 Jurkat细胞收集于离心管中，200g离心5 min去上清，然后混悬于EBSS液中，再同样离心去上清，最后加入EBSS，调节细胞浓度为1×106/ml，放置孵箱中3 h后回收细胞。阴性组为正常培养细胞。 1.2.3蛋白样品制备与western blot分析 按照蛋白提取试剂盒，根 据细胞数量加入相应的提取试剂，依次制备蛋白电泳样品，然后上样到12%分离胶的垂直电泳变性胶上，经电泳、转膜、封闭后，根据marker位置裁剪actin膜和LC3膜，分别进入相应抗体4?摇床过夜，然后TBST洗涤后，一同进入Anti-rabbit IgG(H+L)(DyLight 800)反应液中作用2 h，最后洗涤用Odyssey双红外荧光扫描仪观察结果，并进行条带综合强度(Integrated Intensity)分析。 1.2.4细胞H2O2处理 上述EBSS处理3 h后的细胞，取少量冲入细胞计数板计数，按照1×106/ml接种塑料细胞培养瓶，处理组加入H2O2至50 mM，继续于孵箱中培养1 h，另两组为非EBSS处理细胞的H2O2处理与未处理组。 1.2.5细胞凝胶火箭电泳 参照文献[6]报道稍做修改，收集细胞于离心管中，离心去上清，用PBS清洗细胞，调节细胞浓度至1×105/ml，取该细胞悬液加入到10倍体积的融化后37?保存的0.5%PBS配制的低熔点琼脂糖中，混匀涂抹到预先蜡笔划线的玻璃片上，然后转移到4?冰箱中，15 min后取出，侵入预冷的新鲜制备的裂解缓冲液中(2.5 mol/L NaCl，100mmol/L Na2EDTA，10 mmol/L Tris，1%肌氨酸钠，1%Triton X-100调整pH至10)，45 min后，用预冷的双蒸水浸泡10 min，共3次。最后玻片放置在水平电泳槽中，加入电泳液(1 mmol/L N EDTA，300 mmol/L NaOH)，液面淹没玻片，避光静置30 min，以20V电泳30 min。取出玻片置于双蒸水中洗涤3次，5 min/次。待凝胶周围干燥后，用蜡笔画线，再用pH 7.4 TE缓冲液以1:10000稀释Green-DNA Dye染色液覆盖凝胶，15 min后去液体。用荧光显微镜观察摄像。 1.2.6图像与统计分析 网上彗星分析软件免费 下载 课程表模板下载资产负债表下载英语单词下载学习机资料下载励志文章下载 CASP，对采集到的图像进行分析，用尾距作为DNA损伤指标，并用SPSS软件进行统计学分析。 2结果 经Western blot分析发现，EBSS处理组与对照组均出现了16KD和14KD两条带，但EBSS组里14KD的量要比16KD的高，在图中体现亮度更强(图1)，而对照组中14KD含量虽然也强于16KD，但差异没有EBSS组大，两组相对actin含量，EBSS组的16KD远少于Control组，而14KD则相反，经条带综合强度(Integrated Intensity)分析，14KD/16KD值(即LC3-?/?)Control组为2.01，EBSS组为3.06。然后经过H2O2处理，单细胞凝胶电泳分析，DNA损伤中空白对照组A拖尾很少，H2O2处理组B拖尾增加，而EBSS作用后的H2O2处理组C拖尾最长(图2)，经CASP软件分析采集50个独立完整的DNA图像数据，并对可疑数据进行取舍，最后两两比较发现，A组尾距为0.51?0.32，B组为7.49?5.19，C组为18.01?7.89，经统计学分析，两两之间均有明显差异(P 图1 不同处理的Jurkat细胞western blot分析 图2 单细胞凝胶电泳后DNA经Green-DNA dye染色(X200) 注:A为空白对照组，B为H2O2处理组，C为EBSS作用后的H2O2处理组 图3 Jurkat单细胞凝胶电泳后DNA尾距统计分析 注:A为空白对照组，B为H2O2处理组，C为EBSS作用后的H2O22处理组 3讨论 细胞自噬是继细胞凋亡后发现的新的细胞死亡方式，目前为止，已经发现了34个自噬相关基因Atg(autophagy related gene)，参与多种自噬信号通路，LC3分子是其中之一。LC3前体(ProLC3)首先加工成胞浆可溶性形式LC3-?，降解成形成LC3-?，LC3-?定位于前自噬体和自噬体，是自噬的标志分子，LC3-?/?比值的大小在一定程度上可评估自噬水平的高低[7]。我们的研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，饥饿应激下的Jurkat细胞表现出自噬特征(图1)，由于自噬是细胞自身正常现象，只是应激状态下更为强烈，因此阴性对照里，同样看到一定量的LC3-?，只是相对阳性组少些，LC3-?/?比值处理组大于阴性组。相关的研究认为，细胞自噬是细胞在营养缺乏或应激条件下，清除胞质内错误折叠的蛋白质、脂类、入侵的病原体以及受损的细胞器、回收代谢物质、降低活性氧(reactive oxygen species，ROS)的伤害、修复DNA损伤的一种自救和质控方式;在物质回收的过程中，异常的蛋白质和受损的细胞器残片在自噬小体 (autophago-some)中得以消化，消化后得到的氨基酸和葡萄糖等可被细胞再利用，因此，细胞自噬的重要生理功能在于促进处于逆境的细胞的存活，即本质上细胞自噬是一种促生存反应，尽管过度的自噬也可能导致细胞死亡，化疗和放疗可以杀死体内大部分的癌细胞，但一部分癌细胞可通过自噬方式，回收物质、保存能量，从逆境中生存下来，逃避凋亡的命运，体外实验显示，药物诱导的细胞自噬，往往伴随着细胞周期的停滞和DNA的修复[5]。 H2O2是一种结构简单的化学物质，被广泛应用于消毒，其蕴含在中风 和缺血治疗中的丰富生物意义尚在研究之中，已有报道H2O2处理细胞可以导致DNA损伤[8]。自噬是一种正常的生命现象，在自噬存在的条件下，H2O2的作用效果值得研究。我们在饥饿诱导Jurkat自噬的条件下，用H2O2继续处理细胞，发现H2O2对Jurkat细胞的DNA损伤增强(图2、3)，具有统计学差异(P<0.05)。已有的研究报道，DNA损伤是细胞自噬的原因之一，当DNA损伤时，会引起核p53移位，激活细胞周期监测点，细胞周期停止而自噬发生[3]。饥饿诱导自噬导致了活性氧的产生，从而导致DNA损伤[9]，这与我们的结果相一致，这在一定程度上也拓展了H2O2的作用效果，在H2O2使用过程中具有一定的指导意义。或者从另一方面看，H2O2可能阻止了药物诱导的细胞自噬伴随的DNA修复，尚需进一步的研究。 参考文献: [1]Mizushima N，Komatsu M.Autophagy:renovation of cells and tissues[J].Cell，2011，147(4):728-741. [2]梁文颖，熊静波，赵嘉佳.5-氮杂-2'-脱氧胞苷诱导乳腺癌细胞自噬与DNA损伤相关联[J].肿瘤，2012，32(7):495-500. [3]Kroemer G，Marino G，Levine B.Autophagy and the integrated stress response[J].Mol Cell，2010，40(2):280-293. [4]汤智平，许耀东，彭解人，等.3-甲基腺嘌呤对人下咽癌细胞的放射增敏效应及其机制研究[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2012，47(11):937-941. [5]何贤辉，欧阳东云.细胞自噬与高迁移率族蛋白B-1(HMGB1)介导肿瘤耐药的研究进展[J].暨南大学学报(医学版)，2011，32(2):126-130， 140. [6]谢广云，张杰肖，韩莹，等.碲化镉量子点对小鼠肝脏氧化应激及 DNA损伤效应初探[J].卫生研究，2012，41(1):31-34，39. [7]Klionsky DJ，Abdalla FC，AbeliovichH，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J].Autophagy，2012，8(4):445-544. [8]Benhusein GM，Mutch E，Aburawi S，et al.Genotoxic effect induced by hydrogen peroxide in human hepatoma cells using comet assay[J].Libyan J Med，2010，5. [9]Rodríguez-Vargas JM，Ruiz-Maga,a J，Ruiz-Ruiz C，et al.ROS-induced DNA damage and PARP-1 are required for optimal induction of starvation-induced autophagy[J].Cell Research，2012， 22(7):1181-1198.编辑/申磊