人白细胞抗原_B27_HLA_B27_转基因小鼠的建立

人白细胞抗原_B27_HLA_B27_转基因小鼠的建立 中 国 兽 医 学 报 第 20 卷 第 3 期 V o l. 20, N o. 3 2 0 0 0 年 5 月C h in e se Jo u rn a l o f V e te r in a ry Sc ien ce 2 0 0 0 M ay () 人白细胞抗原- - 转基因小鼠的建立27 27BHL A B 1 2 1 1 1 1 2 (周轶琳, 乔贵林, 杨少峰, 吴启富, 刘 毅, 张玉勋, 殷震11 第一军医大学 中医系, )广东 广州 510515; 21 解放军军需大学 军事兽医研究所, 吉林 长春 130062 () () 摘要: 人白细胞抗原2B 27 HL A 2B 27与强直性脊柱炎 A S有强相关性, 为构建 A S 动物模型以用于其发病 机理和治疗的研究, 将 2基因与 2微球蛋白基因等量混合后, 利用显微注射技术注入昆明小鼠的27 HL A B Β2 1 370枚受精卵中, 再将注射后存活的 1 050 枚卵移植到 58 只假孕母鼠体内, 产仔 97 只。检测上述 97 只 PCR 转基因仔鼠, 结果 27 只为阳性。检测上述 27 份 阳性小鼠的基因组, 结果 8 只为阳性,So u th e rn b lo t t ing PCR 表明已成功地建立了 2转基因小鼠。27 HL A B 关键词: 2转基因; 小鼠27; HL A B () 文章编号: 100524545 20000320222203中图分类号: Q 78 文献标识码: A ()强直性脊柱炎 , L e itz 公司产品。 国 an k y lo sin g spo n dy lit isA S 112 实验动物 昆明种小鼠, 军需大学实验动物 是一种主要累及青壮年男性脊柱关节的慢性关节 中心提供。 疾病。 用淋巴细胞毒反应检测病人外周血淋巴细 113 () HL A - B27、Β2 -m 基因的制备 质粒 pHL A 2 胞中的人白细胞抗原22阳性率在27 27, B HL A B B 27 经 E co R I 酶切, 回收 615 k b 片段; 质粒 p Β2 2 95% 以上, 而正常人阳性率仅为 4% 。因此, 2HL A () 2经 、酶 切, 回 I I M ic ro g lo b u lin p Β2 m Sa l P vu 检测已成为诊断 的一项指标。的病因 27 B A S A S 收 15 片段。 纯化后溶于 中, 分离、纯化方k b T E 及发病机制迄今不明。 国内已有应用曲细精管注 1 法见文献2 。射法建立 2转基因鼠的报道。 本试验 27 HL A B 114 、的配制 小鼠卵的超排、公鼠的结 M 2M 16 应用受精卵显微注射技术制备了 2转基27 HL A B 扎、受精卵的显微注射, 见文献2 。 因小鼠, 以为 的研究提供精确的动物模型。A S 115 2 。 见文献小鼠尾基因组 D NA 的提取 116 PCR 检测 反应体系, 97?预变性 10 m in 1 材料与方法 , 进入循环, 其条件是: 96?变性 10 s, 66?退火 后 20 , 70?延伸 25 , 最后延伸 10 。在 117% 的ssm in111 试剂和仪器 质粒 227、2, pHL A p Β2 m Jo e l D 3, 4 教授惠赠。 、购自军需大学 , 琼脂糖凝胶上电泳检测结果 。 T au ro n g PM SGhC G 军事兽医研究所; 限制性内切酶, 购自宝生物工程 117 探针的标记 用 I 、双酶切质 X b a E co R I 有限公司; 酶, 购自东方科技公司; 蛋白胨、 RN A 粒 2回收约 700 的片段, 采用随机27, pHL A B bp 酵母浸出物, 公司产品; 聚合酶、G IBO T aq DN A 4 引物法标记探针 。 标记及检测方法详见试剂盒 4×购自 公司; 透明质酸酶, 购自 , dN T P P rom ega S 说明书。公司; 引物, 由宝生物工程有限公司 igm a PCR 合 成; 探 针 标 记 及 检 测 试 剂 盒, D IGDN A 118 将提取的转基因小鼠的 Southern blo tt in g 公司产品; 显微注射仪, 德Bo eh r in ge r M an n h e im 基 因 组 用 酶 切 过 夜, 在20 , DN A ΛgE co R I 017% 的琼脂糖凝胶上电泳, 凝胶的变性、中和、转 膜 按文献 4 进行, 杂交及检测按 检测试剂D IG 5′223′, 下 游 引 物 序 列 C GGC GGT CCA GGA GC T 为 5′223′。GGGT C T CA CA CCC T CCA GA A T PCR2 结果 产物约为 140 。利用上述引物对 97 只转基因仔 bp 211 目的基因的制备 鼠进行检测, 结果 27 只为 阳性。图 3 为部分质粒 2经 27 PCR pHL A B E co 检测结果。R I 酶切, 质粒 p Β2 2m 经 Sa l 、P vu 酶切后, 回 I I PCR 收、纯化 615 的 2基因、15 的 227 k b HL A B k b Β2 m (基因, 分别用无菌 210 ƒ, 0. 1 T E mm o lL T r isH C l ) 稀释至 210 过滤ƒ, 7. 5ƒ, mm o lL ED TA pH m gL 除菌, 分装后, 置- 20?备用。pHL A 2B 27 和 p Β2 2 的酶切鉴定结果及基因结构示意图分别见图 1m 和图 2。 图 3 扩增产物的 117% 琼脂糖凝胶电泳结果 PCR 11 阴 性 对 照; 2, 61 样 品; 71 阳 性 对 照; 81I19pU C DN A M sp 214 转基因鼠的 检测 分别 Southern blo tt in g 取 27 份 阳性小鼠的基因组 2010 用 , PCR ΛgE co 2和 2酶切, 在 017% 的琼脂糖凝胶上电泳, 将其转 27 的 酶 切 鉴 定 结 果 图 1 pHL A B p Β2 m R I 移至硝酸纤维素膜上, 以 标记的约 700 D IG bp ( ) 1121227;227 ;pHL A B pHL A B E co R I 片段为探针, 进行杂交检测, 结果有 8 份为阳性。 (31; 41212? ; 5I ƒΚDN A H ind p Β2 m p Β2 m Sa l )I P vu 3 讨论 双基因转基因动物的制备, 有以下 3 种方法: ( ) ( ) 1将 2 种基因连接转入受精卵; 2将 2 种基因 ( ) 分别转入受精卵, 所生的整合阳性鼠再交配; 3 将 2 种基因等量混合, 共同注入受精卵。本试验采 用的是第 3 种方法, 避免了复杂的基因构建过程, 同时还克服了外源基因在传代过程中的丢失现 象。据文献 5 报道, 2 种基因混合注射, 将共同整 合入宿主的同一位点, 所以只对 2进行 27 HL A B 了检测。 2和 2基 因 结 构 示 意 图 1227 2 图 HL A B Β2 m A HL A 基因结构; 12基因结构27 B B Β2 m 在转基因动物的整合检测中, 引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 PCR 十分重要, 它直接关系到检测的准确性。根据有关 212 通过显微注 HL A - B27 转基因小鼠的制备 射技术, 将上述制备的 HL A 2B 27ƒΒ2 2m 等体积混 3 合后注入小鼠受精卵的雄原核内, 共注射 1 370 , 我们选择了第 3 个外显子上的 1 对引物。报道 枚受精卵。将注射后存活的 1 050 枚卵移植到 58 它对 2是特异的, 对 2、2都 27 HL A B HL A A HL A C 只假孕母鼠输卵管内, 其中 7 只难产死亡, 产仔 不能产生非特异性扩增。但小鼠的基因组很大, 不 97 只。能排除有相同的氨基酸序列而出现假阳性扩增。 为排除内源性干 213 转基因小鼠的 检测 因 此, 我 们 又 用 、双 酶 切 2 I PCR X b a E co R I pHL A 获 得 的 700 片 段 在 3′端 非 翻 译 区, 对27, , 提高 PCR 检测的特异性, 根据文献 3 报道, B bp 扰 227 是特异的, 将其标记为探针, 对 阳在外显子 3 中设计上、下游引物。上游引物序列为HL A B PCR ? 1994-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. () 建立人白细胞抗原 2转基因鼠 [ ] 1 27 27B HL A B J 性小鼠基因组进行了 So u th e rn b lo t t in g 检测。 () 中国兽医学报, 1999, 19 2: 192.() 人I 类主要组织相容性复合体 是一 M H C 田小利, 陈兰英, 扈荣良 1 转基因动物原理、技术与 2 种糖蛋白, 由轻链和重链通过多肽链非共价连接 应用[]1 长春: 吉林科学技术出版社, 19951103,M 而成, 重链由 类基因编码, 轻链由 2I M H C Β2 m 105. 基因编码。在人类,称为 2是 , 27 M H C HL A HL A B , , 2e t a l., D om inguez O Co to E M a r t inezN ave s E 3 由 6 号染色体上的 2位点编码, 2位于HL A B Β2 m 227 [ . M o lecu la r typ ing o f HL A B a lle le s J 6 7 15 号染色体上。 据报道, 2在细胞表 27 HL A B , 1992, 36: 277, 282.Imm uno gene t ic s 面的表达水平依赖于宿主的 。 在小鼠, 2H M H C 4 萨姆布鲁克 弗里奇 曼尼阿蒂斯 1 分子克 , , J E F T 位于 第 2 称为 H 2, 位于第 17 对染色体上, Β2 2m 隆实验指南 [] 1 第 2 版 1 金 冬 雁, 黎 孟 枫, 侯 云 M 德, 等 译 校 1 北 京: 科 学 出 版 社, 19931304, 315, 对 染色体上。 2 又分为 22、22、22、2 H H BH FH V H 502, 505.2、22等区, 当小鼠的 为 22、22时, 2 DH L H H BH F , , , e t a l.5 B eh r inge r R R R yan T M R e illy M P 外 源 基 因 2在 细 胞 表 面 的 表 达 为 高 水 27 HL A B Syn th e sis o f func t io na l h um an h em o g lo b in in 平; 当小鼠的 为 22时, 外源基因 22 27H H V HL A B 1[],1989, 245: 971, 973.t ran sgen ic m ice J Sc ience 在细胞表面的表达为中等水平; 当小鼠的 为 2 H , , , e t a l. 227 6 T au ro g J D L ow e L Fo rm an J HL A B in 22、22时, 外源基因 2在细胞表面 27 DL H H HL A B 22inb red and no n inb red t ran sgen ic m icece ll su rface 的表达为低水平。2与外源基因的混合基因共 Β2 m exp re ssio n and reco gn it io n a s an a llo an t igen in th e 同转入小鼠的受精卵, 可增强 227 在细胞HL A B 21[],ab sence o f h um an Β2 m ic ro g lo bu lin J J Imm uno l 表面的表达水平。 本试验所用的昆明种小鼠属远1998, 141: 4 020, 4 023. 交系小鼠, 背 景 不 清, 不 能 确 定 基 因 的 单 体2 2, , .H N ick e r so nN u t te r C L H o gen K L D av id C S 7 227 E xp re ssio n o f HL A B in t ran sgen ic m ice is 基因共同转入受精 型, 所以将 HL A 2B 27 与 Β2 2m ( ) 22co n t ro lled by gene sm app ing be tw een H D and 卵, 以获得 2整合阳性的转基因小鼠。 27 HL A B ( ) 22[ ] 1 , 1992, 35 3 : 199H L lo c i J Imm uno gene t ic s , 204.参考文献: 1 乔贵林, 周轶琳, 赵 君, 等 1 应用曲细精管注射法 27of Hum an L eukocy te An t igen B Con struc t ion of Tran sgen ic M ice ()- 27HL A B 1 2 1 1 1 1 2, 2, 2, 2, , 2,ZHOU Y ilin Q IA O Gu ilin YA N G Sh ao fen gW U Q ifu L IU Y iZHA N G Y u x u n 2(1. , , Y IN Zh en F a cu l ty of T ra d it ion a l C h in ese M ed ic in eth e F irs t A rm y M ed ic in e C ol leg e 2. 510515, ; , G u a n g z h ou C h in aT h e M il l ita ry V e te r in a ry I n s t itu teQ u a r te rm a s te r U n iv e rs ity ), 130062, of PL A C h a n g ch u n C h in a () : 27 227 A bstra c tT h e t ran sgen ic m ice o f h um an leu ko cy te an t igen B HL A B h a s b een gen e ra ted b y () 6. 5 22227 15 m ic ro in jec t io n o f th e m ix tu re o f k b HL A B gen e an d k b Β2 m ic ro g lo b u lin Β2 m gen e in to th e fe r t ilized egg s o f m ice. 1 050 o u t o f 1 370 m ic ro in jec ted egg s h ave b een t ran sp lan ted to 58 97 . p seu dop regn an t m ice an d o ff sp r in g w e re p ro du cedGenom ic DN A sam p le s f rom th e o ff sp r in g h ave b een de tec ted b y PCR an d so u th e rn b lo t t in g tech n iqu e s. T h e re su lt s show ed th a t 27 o u t o f 97 m ice 8 .w e re po sit ive b y an a ly sis o f PCR an d m ice w e re po sit ive b y so u th e rn b lo t t in g de tec t io n : 227; ; Key word sHL A B t ran sgen em ice