qPCR原理及应用

qPCR原理及应用 实时荧光定量PCR的原理和应用 2010.10 雅睿生物黄宝福 目录 ? 实时荧光定量PCR原理 PCR 荧光标记 绝对定量和相对定量 ? 实时荧光定量PCR应用 ? 实时荧光定量PCR发展 digital PCR,qPCR Array 实时荧光定量PCR原理 聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR) 1971年，Khorana提出:经过DNA变性， 与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因。 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚 合酶链反应(PCR) 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐 热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 聚合酶链式反应 Polymerase chain reaction (PCR) 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发 明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔 化学奖。 PCR ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5? 3? TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3? 5? DNA 解旋解链 结合引物 子链延长 PCR ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5? 3? TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3? 5? DNA 解旋解链 结合引物 子链延长 GGAUCG 5„ AUCGCG 5„ 3? 3? DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5? 3? TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3? 5? DNA 解旋解链 结合引物 子链延长 GGAUCG 5„ AUCGCG 5„ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3? ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 3? DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 PCR原理 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间(min) 温 度 (?) 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 D N A 变 性 形 成 2 条 单 链 子链延伸 DNA加倍 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 DNA 第一轮扩增 第二轮扩增 第三轮扩增 第四轮扩增 第五轮扩增 实时荧光定量PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程， 最后通过 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线对未知模板进行定 量分析的方法。 实时荧光定量PCR和常规PCR 常规PCR技术: 对PCR扩增反应的终点产 物进行定量和定性分析。无 法对起始模板准确定量，无 法对扩增反应实时检测。 实时荧光定量PCR技术: 利用荧光信号的变化实 时检测PCR扩增反应中每一个 循环扩增产物量的变化，通 过Ct值和标准曲线的分析对 起始模板进行定量分析。 荧光PCR特点 灵敏度高 特异性强 全封闭PCR过程，无需后处理 即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量 定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品 可实现一管多检 仪器自动分析，更快获得结果 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR原理 Ct值的定义: PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value Ct值的重现性 横轴:PCR反映循环数 纵 轴 : 荧 光 信 号 量 Ct值的特点: 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不 恒定; 值则极具重现性 实时荧光定量PCR原理-定量原理 ?理想的PCR反应: ? X=X 0 *2 n ?非理想的PCR反应: ? X=X 0 (1+Ex) n ? n:扩增反应的循环次数 ? X:第n次循环后的产物量 ? X 0 :初始模板量 ? Ex:扩增效率 实时荧光定量PCR原理-定量原理 在扩增产物达到阈值线时: X Ct =X 0 (1+Ex) Ct =M (1) X Ct :荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X 0 (1+Ex) Ct (2) 整理方程式(2)得: lg X 0 = - Ct×lg(1+Ex) + lg M (3) Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值 的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。 实时荧光定量PCR原理-定量原理 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即 Ct值越小。 浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以 计算出样品中所含的模板量。 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 C ( t ) V a l u e Copy Numbers Standard Curve 实时荧光定量PCR原理-相对定量 X Ct =X 0 (1+E x ) Ct,x =K x R Ct =R 0 (1+E R ) Ct,R =K R X Ct R Ct X 0 (1+E x ) Ct,x R 0 (1+E R ) Ct,R K x K R K = = = X 0 R 0 (1+E) Ct,x-Ct,R K = × (1+E) ?Ct K = × X N X N X 0 R 0 = E x =E R =E: (1+E) -?Ct K = × X N (1+E) -?Ct,q K = × X N,q (1+E) -?Ct,cb K = × X N,cb (1+E) - ? ? Ct ? ? Ct= ? Ct,q- ? Ct,cb 样本q的X N 除以 校准样本(Calibrator) cb的X N : 参比内标: 靶核酸: Ct,x-Ct,R: ?Ct= 实时荧光定量PCR原理-相对定量 Livak & Schmittgen, Method,2001,25:402-408 绝对定量和相对定量 ? 绝对定量:精确的计算初始反应的模板浓度 (DNA，RNA) – 病毒DNA或RNA的拷贝数 – 转基因的拷贝数 ? 相对定量:计算初始反应模板的相对含量 – 差异表达分析 – 芯片评估 – 转基因生物的检测 – 基因型检测 荧光标记 非特异性荧光标记: 1、SYBR Green ? 2、EvaGreen 3、LC Green 特异性荧光标记: 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor Q Q R SYBR GREEN I ? 能结合到双链DNA的小沟部位 ? 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green? 发荧 光，在此阶段采集荧光信号(一般设置在复性阶段)。 SYBR Green SYBR GREEN 熔解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT) -dI dT T m SYBR GREEN 熔解曲线分析 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，有杂峰 其他产物出现非特异性 荧光，因此定量不准确 非特异性产 物 SYBR GREEN法优缺点 对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优 点 容易与非特异性双链DNA 结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分 析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 缺 点 FRET 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基 团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长 (低能量)的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当 于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。 Taq man探针 与目标序列互补 端标记有 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光 (荧光共振能量转移原理，FRET) 酶有5′?3′外切核酸酶活性，可水解探针 Taq man 探针 ? 特异性荧光 双标记探针 ? Taq酶 5??3?外切 酶活性 Taq man 探针法优缺点 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区 域互补 重复性比较好 优点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺点 Molecular Beacon 分子信标 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 Molecular Beacon 分子信标 Molecular Beacon 分子信标 高特异性:对目标 序列 检测SNP最灵敏的试 剂之一 荧光背景低 优点 只能用于一个特 定目标 设计困难 价格比较高 缺点 高分辨率熔解曲线 High resolution melting cure(HRM) Reed et al. Pharmacogenomics (2007) 8(6), 597–608 实时荧光定量PCR应用 实时荧光定量PCR应用 基因扩增 扩增特异性分析 基因定量分析 基因检测 基因分型 分析 多态性分析 单/多基因表达研究 高通量基因表达谱研究 疾病的早期诊断 ? 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临 床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体 的免疫学检测存在较长的“窗口期”，比如 HCV的“窗口期”平均长达70天，不利于对疾 病的早期诊断;PCR方法直接检测病原体的 DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏 度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。 ? 病原体检测:确定病原体的种类和基因型， 以利于治疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 的确定 遗传疾病的早期诊断 ? 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、插入 突变、多基因突变等的检测，对产前诊断具 有其他方法不可比拟的优势，有利于优生优 育，提高人口素质。 药物研究 ? 任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价 其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的 被抑制程度，即病毒基因水平的高低和动态 变化来评价疗效，则较为直接和理想。 ? 新药筛选:药物作用靶标的研究，基因表达 的变化 ? 药效的评价:对服药后体内基因表达或病原 体载量的变化进行监控，更好的评价药效， 有助于治疗方案的改进 肿瘤的诊断 ? 可对原癌基因的突变和易位等作出检测; ? 可对原癌基因的mRNA进行定量分析; ? 有利于肿瘤的早期诊断，甚至癌前诊断; ? 探索癌变发生机理的研究提供参考; ? 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。 食品安全 ? 病原微生物检测:对食品中可能存在的病原 微生物进行定量检测，保护人民生命安全 ? 转基因食品检测 ? 动物疫病检测:为防止动物疫病的传播和人 畜共患疾病的控制提供检测方法 实时荧光定量PCR发展 Digital PCR qPCR Array qPCR array ? Gene Coponiea公司的All-in-OneTM Human Whole Genome miRNA Q-PCR Array ? Origene公司的TissueScan Tissue qPCR Arrays ? SABiosciences公司的RT2 ProfilerTM PCR Array System The End Thank You! 实时荧光定量PCR原理-定量原理