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离子交换色谱.doc

离子交换色谱

笨蛋丶硪不离开
2017-10-06 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《离子交换色谱doc》,可适用于高等教育领域

离子交换色谱一、实验原理:离子交换层析(IonExchangeChromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点当蛋白质处于不同的pH条件下其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质所以这类蛋白质被留在柱子上然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。离子交换层析是用离子交换剂作固定相利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。带电荷量少亲和力小的先被洗脱下来带电荷量多亲和力大的后被洗脱下来。二、实验设计离子交换剂缓冲液洗脱剂具体操作:、离子交换介质的选择:考虑目的分子的大小目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团功能集团的强弱目的分子稳定选择强交换介质。对于大多数纯化步骤来说建议开始的时候使用强离子交换柱可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。对于一个已知等电点的蛋白质可根据其等电点来选择。如果选用阴离子交换剂使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷可与阴离子交换剂结合。如果选用阳离子交换剂缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷可与阳离子交换剂结合。对于一个未知等电点的蛋白质可以先选择一个阴离子交换剂再选择一个中性的pH缓冲液将蛋白质样品透析至pH然后过阳离子交换柱根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH。如果目的蛋白再穿过液中说明目的蛋白在此pH条件下带正电荷可将缓冲液升高一个pH将蛋白质样品透析纸然后再过阴离子交换柱根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH。以此类推直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止也可用阳离子交换剂作类似的选择不过要注意pH的改变应向减小的方向进行。功能集团的强弱一般情况下在分离等电点pH为的目的分子尤其是当目的分子不稳定时需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。流动相(缓冲液)的选择:的溶液阳离子交换剂应选择阴离子缓冲液可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液可用乙二胺、Tris等起始缓冲液浓度应尽可能低这样可使色谱柱上吸附更多的分离物质。、色谱柱的选择通常选择粗短柱即高径比小的色谱柱。离子交换分离蛋白质是依靠吸附强弱不同发生吸附时蛋白质会优先结合在色谱柱的上部如果柱子过长增加了从吸附位置到收集位置的流程距离容易增加样品扩散导致峰值增加、折叠预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒以保证有较好的均匀度对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理使之成为带H或OH的交换剂型。阴离子交换剂常用"碱酸碱"处理使最终转为OH型或盐型交换剂对于阳离子交换剂则用"酸碱酸"处理使最终转为H型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层要适当加压装柱同时使柱床压紧减少死体积有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗直至达到充分平衡方可使用。、折叠加样与洗脱及洗脱组分的收集和分析加样:层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围同时要注意离子强度应低可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前以离心法除去。为了达到满意的分离效果上样量要适当不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算通常上样量为交换剂交换总量的。折叠洗脱:已结合样品的离子交换前可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全往往需要逐步改变pH或离子强度其中最简单的方法是阶段洗脱法即分次将不同pH与离子强度的溶液加入使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱纯度较差不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱两个容器放于同一水平上第一个容器盛有一定pH的缓冲液第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液两容器连通第一个容器与柱相连当溶液由第一容器流入柱时第二容器中的溶液就会自动来补充经搅拌与第一容器的溶液相混合这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算:C=C(CC)(V)AA式中A、A分别代表两容器的截面积:C、C分别表示容器中溶液的浓度V为流出体积对总体积之比。当A=A时为线性梯度当AA时为凹形梯度AA时为凸形梯度。洗脱时应满足以下要求:洗脱液体积应足够大一般要几十倍于床体积从而使分离的各峰不至于太拥挤。梯度的上限要足够高使紧密吸附的物质能被洗脱下来。梯度不要上升太快要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸会引起区带扩散而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。洗脱馏份的分析按一定体积(ml管)收集的洗脱液可逐管进行测定得到层析图谱。依实验目的的不同可采用适宜的检测方法(生物活性测定、免疫学测定等)确定图谱中目的物的位置并回收目的物。洗脱组分的收集和分析:通常色谱柱下端连接一个紫外检测器用于检测蛋白质组分的洗脱过程而后又连接着部分收集器用于收集洗脱液。、离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用mol:NaCl淋洗柱若有强吸附物则可用molLNaOH洗柱若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生也可用乙醇洗涤其顺序为:molLNaOH水乙醇水NaOH水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用氯已定(洗必泰)阳离子交换剂可用乙基硫柳汞()。有些产品建议用叠氮钠。三、举例:离子交换层析法分离氨基酸原理:所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液分别属酸性氨基酸(pI)、碱性氨基酸(pI)用强酸型阳离子交换树脂Dowex在一定洗脱条件下洗脱将它们分离。组氨酸pH天冬氨酸pH器材:层析柱沸水浴等试剂:DowexmolLNaOHpH柠檬酸缓冲液氨基酸混合液茚三酮混合液目数:离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex为目DowexμmDowexμmDowexμm(代表二乙烯苯的百分含量)操作:、层析:将Dowex装柱后用molLNaOH清洗树脂分钟再用pH柠檬酸缓冲液平衡分钟。(方法同凝胶层析法)加样滴。当样品进入树脂后加入pH柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集每管收集ml(控制流速滴分钟)。当第一峰一出现换用molLNaOH作洗脱液直至第二峰收集完毕。用pH柠檬酸缓冲液再平衡分钟再生。、检测:从第二管起每收集管中加入ml茚三酮显色液充分混合沸水浴分钟自来水冷却观察氨基酸与茚三酮的显色反应若生成紫色混合物则说明收集到氨基酸。优点:、具有开放性支持骨架大分子可以自由进入和迅速扩散故吸附容量大、有亲水性对大分子的吸附不太牢固用温和条件即可洗脱不致引起蛋白质变性和酶的失活、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高可用于分离和制备。缺点:由交换层析介质决定不同蛋白质相互分离效果也不确定这种分离也易造成各蛋白峰的重叠造成分离纯度的下降。优点:、具有开放性支持骨架大分子可以自由进入和迅速扩散故吸附容量大、有亲水性对大分子的吸附不太牢固用温和条件即可洗脱不致引起蛋白质变性和酶的失活、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高可用于分离和制备。缺点:由交换层析介质决定不同蛋白质相互分离效果也不确定这种分离也易造成各蛋白峰的重叠造成分离纯度的下降。

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