腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因SREBP2过表达载体的构建与鉴定（可编辑）

腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因SREBP2过表达载体的构建与鉴定（可编辑） 腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因 SREBP2过表达载体的构建与鉴定 ,差孰燮 ????????::,/、州.. / 一?? 啊??膳 枷一冀豢篡釜》唧 艘 孱 研究资源 腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白基因过表达 载体的构建与鉴定 付常振”刘扬昝林森。”王虹成功王嘉力 西北农林科技大学动物科技学院杨凌:国家肉牛改良中心,杨凌 同等贡献作者 通讯作者,. 摘 要 固醇调节元件结合蛋白 ,属于碱性螺旋一环一 螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作 用。克隆秦川牛弧口雕的 船基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在 细胞水平上研究 蚴基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材 料,提取总并反 转录为,依据【收录的牛的髓基因. 】?序列设计 引物,克隆出艘基因编码区 ,全长。将蚴基因与穿梭载体连接构建 ?.础旧表达载体,用撇分别酶切线性化.胎和空白对照 ’?载体并转化含有骨架载体.的大肠杆菌廊玩感受态进行同源 重组,得到腺病毒重组载体?髓和?,分别用胁酶切后胶回收大片段,并将回 收产物转染细胞包装得到腺病毒?尺髓和.,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒 ,用绿色荧光蛋白 ,标记法测定显示一伽和?的病毒滴度 后 分别为×和.× 。将?朋尸和.腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒 / 的有效性,实时定量检测结果显示,侵染时研即基因的表达量提高了.倍。本研究成功 克隆了秦川牛的鼢基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功 能的研究提供了基础资料。 关键词秦川牛,固醇调节元件结合蛋白基因蚴,胆固醇,腺病毒. ? ?把配凇 巧 脓船 一‘?气. ? ’ 既 酣“吼 仕 田咄 ,; , 鲥 咄 劬 ,. 基金项目:“十二五”国家高技术研究发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 .,..、国家自然科学基金项 目 .、“十二五”国家转基因育种重大专项.和国家现代农业产业技术体系建设 专项 收稿日期:.. 接受日期:.. 万方数据 .? .尺船仔 缸 吣尬“淞 , 锄 如 跚獬口 , .行 砌 .仃 .尺 .脓脚 锄坶? ..一 研强冶 ? .仔 锄 仃 ?船腮 . 撕 仃 舰 ?仃? 吼 点恐沈屁 ? 一 ?船 . , . ? 一研留甜矽 一蚴 . 一 ? 跚江留 ? × .× / , 盯一.. . ” . 捌汜. 匆? . 阳船 , 觚 . 柚, 巧艘既”唿,,? 固醇调节元件结合蛋白 , 酸和甘油三酯的催化能力较弱 ., ,冱属于碱性螺旋. ; .,; .,; 环.螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,研究发现,.,; .,; .,; 家族能够通过与下游基因启动子中的也 锄.,:缸 .,。研究表 明础沼基因被激活后能合成更多的胆固醇来 ’一一’序列结合 .,: ,,直接激活多个基因的转录,调 代偿蚴的缺乏;而敲除蚴基因的小鼠 控胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂的合成与吸收, 则在 内全部死亡,表明 脚基因不能代偿 以维持动物细胞脂质的稳态 . 蚴基因的缺乏 .,。与其他 螺旋一环一螺旋亮氨酸拉链蛋白不同,以无 ; .,; , ; 活性的/.砸蛋白前体形式结合在 ,;? ., : .,。基因家族在 内质网上,胆固醇耗尽时能够促进和 脊椎动物中表达.日和脚两个基因。 释放,调控转运到高尔基体上解元,形成 胎『基因主要以职朋.『的形式存在,其转录 核型的,进入细胞核促进胆固醇合成相 活性结构域较短,属于较弱的转录因子,优先特异 关基因的表达 ,; 艘胎则拥有一 激活脂肪酸和甘油三酯的合成, .,; .,。而? 个长的转录活性序列,能够通过激活低密度脂蛋白 抑制醐僦基因表达后能够很明显的改善胆固 受体, 衄、乙酰 醇的积累 .,,表明职朋基因与胆 固醇的合成密切相关。 辅酶合成酶田? , 等基因,有效的调控胆固醇的代谢,而对合成脂肪 鉴于蚴基因在胆固醇的代谢过程中有 万方数据隙病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白基因舾过表达载体的构建与鉴定 .. 竺旧 口 ,勋 图印 分别酶切?和? ? ? ? ?五田:劬力力幢 : ;:勋凡,硒 酶切?;~ 图尉强基因克隆 :蜘凡脚口酶切.船 陀 冠脚心蛆 :;: ? :肛曰基因产物::双酶切蚴质粒; ?凡/.珊口;?: ’’?二尺点曰 : 扩增蚴基因;~:硒凡 :: ?凡,肋口 口酶切船尸质粒 / : 尺;: 的?序列完全匹配,说明基因克隆成 艇曰;: 仃 ;: 功,可以进行下一步实验。船 ;: 舳 . ?凡? .?啪穿梭载体构建与鉴定 脚 用硒 分别酶切穿梭载体空载 重要的负反馈调控作用,研究.蛐朋基因在前体 ?约 和穿梭载体? 脂肪细胞、肝细胞等组织细胞中调控胆固醇代谢的 和 .约 图,与预期结 机制,对平衡牛肉中胆固醇含量,改善牛肉品质,提 果一致,结合测序结果分析表明穿梭载体 高牛肉质量具有重要的借鉴意义。应用病毒介导 ?尺朋构建成功,可与腺病毒骨 的过表达技术,包装增殖获得过表达病毒,以实现 架载体重组。 对牛脂肪、肝等原代细胞的高效侵染及持续过表达 . 来研究该基因的功能尚未见报道。因此本研究以 一蚴彤和?病毒重组体构建 与 鉴定 秦川牛脂肪组织为实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ,克隆得到秦川牛 .朋基因,与腺病毒穿梭载体. 提取一咫尸和?腺病毒重组质 连接,然后与腺病毒骨架载体?同源重 粒,用几 酶切鉴定,电泳检测均为条条带,大 组,构建重组腺病毒表达载体,在细胞中包装 小分别约为和. 图,与预期结果一致,测 增殖得到高滴度病毒,为研究.日基因的功能 序结果同样说明?尺和.腺病毒 提供了基础资料。 重组质粒构建成功,可以进行腺病毒的包装。 结果与分析 .秦川牛蚴彪基因的克隆 扩增艘基因,产物大小为 图,胶回收符合目的大小的片段并与 图砌 酶切重组质粒?和?脚 连接,构建肥尸基 一 ., ?疆 /.硒 酶切检 因克隆载体.朋,用邱 廿 测并测序验证,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析, :九一饿凡;~: 酶切.;: 得到条条带分别是 和 ,其迁移率与 尸缸酶切艇曰 预期一致图。结合测序结果分析,本研究克隆 :日;~: ? ? 的秦川牛脚基因序列与公布的牛;~:一口 万方数据农业生物技术学报 。。 酣 。。。 图病毒侵染牛前体脂肪细胞 绿色荧光表达情况郫 ? ? 一舯、,邶:侵染..病毒;:侵染.病毒 : ? 脚;: 如 勺 图腺病毒的包装与增殖 ?跚 翡蚰. ? 腺病毒包装转染细胞 ,绿色荧光星星点点零散分布; 繁萝 : ? 靛笋 :转染 ,局部绿色荧光出现葡萄串样聚集箭头所指;: 巽专 。 转染 ,大量细胞病变变圆脱壁,形成大量细胞空斑箭头 配 加 所指;:高滴度腺病毒侵染细胞 绿色荧光密集 ? 一船尸 分布 病毒侵染类别 : ;: 血 图醐删基因相对表达量;:明船曰门 , 以为内参基因刚相对表达量,侵染..;: .朋病毒的细胞船廖基因的表达极显著高于侵染 病毒的对照组,:差异极显著.., . ?正沼和?腺病毒的包装、扩增 ? 柚 肋日 及滴度测定 . 一.尺 用户乜 分别酶切.脓删和? ,幸年: ., 腺病毒重组质粒,胶回收约 的片段并 转染细胞包装病毒。转染 ,荧光倒置显 ,绿色荧光密集铺满整个培养容器,约 就有 微镜观察,细胞生长状态良好,绿色荧光星星点点 %细胞病变脱壁。用标记法测定收集的高 图;转染 ,绿色荧光点数明显增多,并在局 滴度病毒的病毒滴度,结果显示,一.朋和空 部出现葡萄串样聚集如箭头所示,在绿色荧光聚 白对照?的病毒滴度依次为×和.× 集中心处有些细胞开始变圆,逐渐脱落:转染 /。 ,绿色荧光量有很大提高,大量细胞病变变圆脱 .病毒有效性的鉴定 壁,形成大量细胞空斑图 ,如箭头所示,待约 待 培养皿中细胞生长融合度约%时, %细胞脱落,收集细胞与培养液,将细胞悬液反 即得到一职邪和? 各取止一船和?病毒悬液侵染 复冻融、离心收集上清, 第代病毒悬液。重复“侵染一冻融一收集”等 生长状态良好的牛前体脂肪 细胞, 观察绿色荧 步骤提高病毒滴度并收集高滴度病毒,一?保存 光表达,绿色荧光蛋白在细 胞中已经表达,说明腺 备用。用高滴度病毒侵染细胞 时图 病毒对牛的前体脂肪细胞成功侵染图。 提 万方数据取总并反转录,实时定量检测.础沼 ,。本研究采用的一腺病毒载体 系统是由等创建的,操作简单,重组效率 基因的表达量图,结果显示渊基因的表达 量相对于空白对照提高了.倍。说明病毒包装 高,病毒纯度高,对人体相对安 全。 成功,并且能有效转录姗基因。 本研究中我们将构建的穿梭载体? 船以及空白对照载体? 讨论 尻 与骨架载体一的重组实验在 大肠杆菌中进行,这样大大提高了重组效 牛的脓基因定位于号染色体上, 率,更容易得到病毒重组体 .,。提取全长 ,区全长 口,翻译 腺病毒重组质粒,用凡 酶切线性化并回收质粒 个氨基酸残基,由于基因区序列相对较 大片段,然后转染细胞包装病毒,第一代病毒 长且含量接近%,这些均不同程度增加了 为提高包装成功率,得到 的包装一般需要~ , 扩增基因全序列的难度。为提高扩增效 高质量病毒,应去掉质粒中包含的内毒素,防止其 率,得到基因区全序列,首先应当注意在组织 在细胞中积聚,影响病毒的包装。由于第一代病毒 样品采集、总提取与反转录过程中防止 包装时间较长,在这期间更换或添加新鲜培养基更 的降解,再者为得到基因的真实序列,确保实验结 容易形成病毒。 果的可靠性,彻底排除人为等外界因素的干扰,在 扩增.船基因区序列时尽量使用高 也是调控胆固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷 保真酶。另外,实验过程中构建的所有携带 脂合成与吸收重要转录因子,在 维持动物细胞脂质 姗基因的载体均需要测序验证,以确保所得 的稳态方面起着重要的作用。目 前关于.基 基因序列的准确性。为方便在克隆载体、 因家族的研究,首先集中在与胆固 醇、脂肪酸代谢 穿梭载体、重组腺病毒载体等过程中对脚基相关的人的疾病方面 .,; 因的操作,在扩增引物中插入酶切位点时,应 .,;呵 .,;【 .,; 综合分析基因序列自带酶切位点和各载体多克隆 .,; .,;其次是外源性 位点信息,以方便目的基因与载体的连接。 的药物、化学试剂等物质对.脚基因的表达情 将外源基因导入真核细胞以实现目的基因的 况的影响张培东等,;窦晓兵等,;汤世 过表达,是目前研究基因功能的重要方法之一。目 ,;吴婷婷等,;再者是通过建立特 国等 前将外源基因导入真核细胞方法有多种,主要分为 定的动物模型来研究衄基因的功能郝军 三类:一是通过脂质体介导的化学方法;二是应用 等,。本研究通过克隆秦川牛的尉强尸基 核转仪、电转移等手段的物理方法;三是以携带外 因,应用一腺病毒载体系统,构建获得 源基因的病毒、农杆菌等为媒介的生物学方法。然 一蚴和空白对照?病毒重组体, 而,化学试剂和物理操作容易对细胞造成损伤,影 包装得到。蚴和?腺病毒,从而实 响细胞的正常功能,并且有许多细胞系很难实现高 现通过直接对蚴基因的操作来研究其对脂 效转染,尤其是大多数培养的原代细胞。因此,本 肪酸、胆固醇等的代谢过程中的作用,提供一种新 研究选择了腺病毒载体系统,将目的基因础强 的思路。 插入病毒基因组,利用病毒的侵染性实现目的基因 综上,本研究获得了..和? 在真核细胞的过表达,并且能最大限度的保护细胞 重组腺病毒并用标记法测病毒滴度为× 不受损伤,使细胞保持良好的生长状态。 和.× 。本研究还将病毒侵染牛的前 / 腺病毒载体系统与其他病毒载体系统相比具 体脂肪细胞,实时定量检测结果显示,侵染 时 有诸多优点,如腺病毒靶细胞种类多,可以侵染不 朋基因的表达提高了.倍,验证了病毒的 同分裂期、非分裂期细胞及体内组织;容易包装得 有效性,为在细胞水平研究朋基因功能提供 到病毒,快速提高病毒滴度,侵染效率高;可以携带 了基础资料。 约 的大片段外源基因而不与宿主基因组整合 材料与方法 等 .,; .,; 万方数据农业生物技术学报。啪 鲥 。。。 .实验材料 产物大小是 ,将引物送英潍捷基 上海贸易有限公司美国合成。 穿梭载体?、含有腺病毒骨架载 ..总斟的提取与的合成 体?的大肠杆菌凰施 菌株、细胞系来源于人肾纤维母细胞,组成 利用嘶法提取秦川牛皮下脂肪组织中的 型表达腺病毒和蛋白的细胞系、牛前体 总,并立即反转录于一?保存备用, 脂肪细胞均由西北农林科技大学国家肉牛改良中 反转录体系与详细步骤参考公司 ;大肠杆菌既廊玩埘 【感受态、 心保存 ? 仃 试剂盒使 连接酶购自天根生化科技北京有限公司中 用说明。 国;质粒小量提取试剂盒、无内毒素质粒小量提取 .. 基因的克隆 试剂盒、胶回收试剂盒均购自公司 用?..高保真性反应酶扩增 美国;劢口、硒 、‰和,聊限制性内切、 酶购自公司美国,觑 娟僦基因,反应体系为:/此模购自中科瑞泰北京生物科技有 砌。儿 板.此,岬。儿引物各.此, 限公司;??.高保真聚合酶购自东洋纺 儿 ?.此, 止,× 上海生物科技有限公司日本;九~ 仃 此,一 /此.此,用: 缸 、’讥口如 补齐至总反应体系皿;程序为:?预变 ” 与 性 ;?变性 ,?退火 ,?延伸 实时定量 鼬均购自公司美国; ,个循环反应;?延伸 。产物 砌“试剂盒购自公司日本; 经%的琼脂糖凝胶电泳分析,其迁移率与预期一 嘶、琼脂糖购自美国们公司美国;固相 致。胶回收符合目的大小的片段,回收产物与 去除剂购自北京天恩泽基因科技有限公司 ” ./ 尉中的 中国;胎牛血清、厄和 连接,连接产物转化感受态,然 均购自公司美国;引物 后在含有氨苄霉素的琼脂平板培养基上过夜培 由英潍捷基上海贸易有限公司合成美国;细胞 养,挑取单克隆菌落于含有氨苄霉素的液体培 培养耗材均购置公司美国。 养基中振荡过夜培养,菌液鉴定,将鉴定正确 .实验样品制备 /劢 的扩大培养,取 菌液提取质粒用勋 以国家肉牛改良中心良繁场月龄秦川牛 酶切鉴定并测序,得到鲫基因的克隆载体 ?口册公牛为实验材料,屠宰后立即取适量皮 飘? 下脂肪组织置于无和的 冻存管 . .衄病毒重组体的构建 ,迅速置于液氮中,运回实验室于一?保存备用。 中 .. .载体的构建 .田陋:别眩基因的克隆 仍 用蜘 分别酶切克隆载体. .. 引物的设计和合成 .和穿梭载体.,电泳检测并 根据【公布的牛的姗基因序列 胶回收目的片段,将二者回收产物用。 . 为模板设计引 连接酶连接,连接产物转化 【感受态,依次在 物,为方便操作,在综合分析基因序列和实验所需载 含有氨苄霉素的琼脂平板培养基和液体培养 体多克隆位点信息的情况下,在上游和下游引物中 基中培养,取 菌液提取质粒用硒 脚口酶 分别插入硒 和舶 酶切位点,具体引物信息: 切鉴定并测序,构建得到?. .: 载体。 鱼鱼?笾; 睁 .. 醐蜊和空白对照.重组腺病 . .: 毒载体的构建 卫卫笪曼鱼。 釉 用,聊限制酶分别酶切线性化蚴基 万方数据表实时定量引物信息 .病毒有效性的鉴定 蹦腓璐 一劬 咖纽 解冻复苏牛的前体脂肪细胞并在含%胎牛 血清的/培养基中培养,侵染前 将生 长状况良好的细胞于 细胞培养皿中传代培 养,待细胞生长至约%融合度时分别加入一 后更换成完全培养 蚴和?病毒, 基, 后收集细胞,提取总并反转录成 。 以牛的甘油醛.一磷酸脱氢酶 一 因表达载体.肼删和空穿梭载 , . 体?,酶切产物分别转化含有腺病毒 奶基因 作为 内参,实时定量检测魍基因的相对表达 骨架载体?的丘感受态,涂布 在含有氨苄霉素的琼脂平板培养皿中过夜培 量,使用皿反应体系,具体反应条件等参考养,挑取单克隆菌落振荡过夜培养, 分别取 ‰”使用说明。实时定量 引物信息见表。 ,用 对重组质粒酶切鉴定并测 菌液提取质粒 序验证,得到一蚴和.腺病毒重 参考文献 组质粒,然后将重组质粒转化感受态扩繁、 保菌。 , ,岫 ,皿 , , ,聊 , ,栅 , ..腺病毒的包装增殖 . , 用无内毒素质粒小量提取试剂盒分别提取重 组质粒和.删尸,各取嵋用尸缸锄鲥 仃 酶切并胶回收大片段,将回收产物用 .咖烈:“ ‖讥移 转染融合 , 只只 ,硎 度为%~%的细胞,详细操作步骤参考转觚 ..嗵 / 鹤 染试剂使用说明书。转染 后,在荧光显微镜下私 .舔 矧塔, :~ 观察细胞形态和绿色荧光数量与分布,以后每天观 柚 啪 儿,. : 察次,跟踪腺病毒的包装与增殖过程;转染删的 沁,一般均会出现局部绿色荧光葡萄串样聚集现象, ? 啪矗 ,: 说明此时已有病毒形成;转染~ ,绿色荧光铺 ~ 满整个培养容器,大量细胞病变变圆脱壁,出现明 锄 锄 , , ,. ,抽 显的空斑,待约有%细胞从培养容器底部脱落时 脏 ?收集全部培养液与细胞至离心管中,即含有第代 印. ,: 病毒的细胞悬液,将细胞悬液于一/?反复冻融 ~窦晓兵,陈庆,王宇浩,豆敏华,范春雷,. 并涡旋振荡次, /离心 ,收集上清 姜黄素对细胞固醇调控元件结合蛋白.表达 液,即为第代病毒悬液。 的影响.环球中医药,一, , 舢, 用第代病毒悬液侵染融合度约%的 也柚 . ? 细胞,~ 后,绿色荧光铺满整个培养容器,细胞 .,~: ,开始变圆脱落,待脱落%左右,按 逐渐出现病变 ~ 离心收集病毒上清液,即柚, ,.柚 前述方收集和裂解细胞, 为第代病毒悬液。然后重复“侵染.冻融一收集”等步骤,大量增殖病毒并提 高病毒滴度。用标记法测定病毒悬液的病毒滴度,具体步骤参考 . ? . 盯等 及等。 仃锄 叩,:~ 万方数据 ,,, ,蚰, ,:~. . ,. , ,. . 啪 ,汪, 曜 :~郝军,王晨,吴海江, . 赵松,段建召,史永红,段惠军,..和 啪,:~ 一在型糖尿病大鼠肾脏中的表达.中国病理 , , , , , ,生理杂志,:~ ,. , , , , ,【仃 仃 , 卜 哆? , . 一 ., 锄 唱? . :? , :~, , , , , , , , ,, , , . . , 仃..,:~啪 , , ,叩 ; 鼢:~. ,. , , : , 斟. 目 . , ,. :~ 研强剧翟巧, ,.:.. ’:~ 廖俊蕾,赵蕾, ~, : 陈曜,李青陈,昱杨,阮雄中,陈压西,.沉默胆固醇 , ,.: 调节原件结合蛋白基因对炎症因子所致细胞内胆固醇异常积聚的影 响.中华肝脏病杂志,: . ~ ,:~ ,,,,抽 , ,, , , , ,.锄 . . 疵舶 .,:?, , , 叩 巧 , , ,.啪 ,: ,,,, 柚 ~ ,.. , 巧?. 柚: ,:~ , 州.仃 彤 : 唱 , ,. ~ 印 柚 ” ~ , , , ,啪 , .,: ,.一, , ,. ’巧 ’? . . 【. ~ 啪 ,: 仃,:~ ..:锄, 谢,. :. 万方数据