基因组DNA的提取及实验方法

一： 基因组DNA的提取 采用SDS法，具体步骤如下： 1 称取2-4克（油菜）叶片，放入研钵中，加液氮后充分研磨。 2 转入20ml (约样品的一倍体积) DNA提取液中，混匀，65℃水浴振荡（301-501 rpm）1h左右。 3 取出冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混匀 后，置摇床上轻摇一小时。  4 室温振荡1h左右使之完全混合。 5 室温3000rpm离心30min。 6 取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置1h后，使DNA沉淀。 7 钩出DNA，于70%酒精中漂洗2-3次。 8 挑出DNA，用DNA 真空干燥机真空干燥后，溶于适量TE（pH=8.0）中。 DNA纯化：加入适量 10mg/ml RNase，置37 oC 30min，充分降解RNA。 再用氯仿-异戊醇抽提一次，DNA沉淀、干燥、溶解程序同上。取适量DNA稀释液与 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 浓度λDNA同时在1%琼脂糖凝胶电泳上进行DNA定量并检查DNA质量。 附：（1）DNA提取液（1000ml）                              1M Tris-HCl（PH8.0） 100ml 0.5M EDTANa2（PH8.0） 100ml 5M NaCl 100ml 20% SDS 62ml Na Bisufite (Coda S-9000) sigma) 3.8g ddH2O 637.5 ml     即配即用，充分混匀后调节pH至8.0。 （2）50×TE（100ml） Tris-HCl             242g            冰醋酸                 57.1ml            EDTA Na2            18.6g            加水至1000ml，灭菌。 （3）Tris-HCl  pH=8.0  1M    1000ml Tris碱                    14.1g            H2O                     800ml            浓HCl                     49ml            混匀充分溶解后，调整pH至8.0，灭菌。 PCR反应在10l体系中进行 模板（基因组DNA） 1l（10ng/l） Primer (R) 0.2l（10uM） Primer (F) 0.2l（10uM） 10×buffer 1l dNTP (2.5mM) 0.8l MgCl2 (25mM) 0.8l Taq酶 0.1l (0.5U) ddH2OH2O 5.9l   10l     PCR扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2l，混匀，取4l PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V，电泳1h左右，UV检测扩增产物的多态性。 PCR扩增条件 94℃ 3min 94℃ 30Sec X（按所用引物确定退火温度） 50Sec 72℃ 1min 72℃ 10min 4℃ 保存     二： 种子贮藏蛋白质样品的提取 按Hurkman和Tanaka（1986）的苯酚为基准的总蛋白样品提取方法，并有所改进。将0.5 g成熟种子在液氮中研磨成粉末状，分别加入提取液10mL [50% （v/v）苯酚, 0.45 M 蔗糖, 5 mM EDTANa2, 0.2% （v/v）β-巯基乙醇, 50 mM Tris-HCl，pH 8.8]，充分混匀后将装有匀浆液的离心管在4℃条件下，摇床上振荡30 min，然后4℃ 5000 g离心15 min，吸取上清液至新一离心管中加入5倍体积的-20℃的0.1 M乙酸铵（0.7708 g 乙酸铵溶解在无水的100 mL甲醇中），-20℃冰箱静置沉淀16 h或过夜。第二天4℃ 5000 g离心10 min，沉淀的蛋白用0.1 M乙酸铵洗涤2次，再用冰冻的80%的丙酮洗1次，最后用70%的乙醇洗涤后，蛋白粉37℃干燥后，放置-70℃冰箱保存备用。（接下来要做SDS-PAGE跑垂直胶） SDS-PAGE电泳  按Sambrook等（1989）的SDS-PAGE程序，取适量种子总蛋白样品与2×样品缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，200 mmol/L DTT，4% SDS，20% Glycerol，0.2% bromophenol blue R)混合，99℃变性处理10 min后，在8%的分离胶和5%的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。使用DYY 212型电泳仪和DYCZ 228C型垂直双板夹芯式电泳槽，电极缓冲液为十二烷基硫酸钠-甘氨酸(pH 8.3) 。每个样品点样15μl，室温下40V电压待指示剂到达分离胶与浓缩胶界面时，再调至100 V稳压电泳，待指示剂迁移至凝胶底部后结束电泳。 染色和脱色  取下胶后，在染色液（1.0 g考马斯亮蓝R250，450 mL甲醇，100 mL冰醋酸，450 mL 双蒸水）中染色30 min，然后用脱色液（100 mL甲醇，100 mL冰醋酸，800 mL双蒸水）脱色1 d。 Rf值及统计蛋白质亚基条带数 参照刘敏轩等（2006）的方法，根据电泳结果计算每个实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 蛋白带的Rf值及统计蛋白质亚基条带数。蛋白质的相对迁移率Rf = 蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 样品中产生的多态性蛋白带，同一Rf值位置上有蛋白条带的记为1，无蛋白带记为0。输入计算机，用cluster软件统计分析，根据Main方法构建表征树。 三： 叶片全蛋白的提取——三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法 取油菜叶片3-4g放入预冷的研钵中加入液氮研磨成粉后（最好带上一次性手套，避免手直接接触叶片），加入3倍体积的蛋白提取液[30mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1mM EDTA，6 mM 抗坏血酸，5 mM MgCl2，1% PVP，0.02% β-巯基乙醇，1% 甘油，2%SDS]，动作迅速并始终保持4℃下混匀；转移至1.5ml离心管中，4℃ 15000rpm低温离心15min；将上清液转入另一离心管中，向管中加4体积的10%TCA溶液(10%三氯乙酸中加入0.02% β-巯基乙醇，v/v)，混匀，-20℃静置1~2h（或过夜，期间间歇一定时间振荡一次）；15000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用80%冷丙酮洗涤三次，最后用冷丙酮-乙醚液（体积1:1）洗涤，沉淀经真空干燥得到粉末状蛋白，-80℃冰箱保存备用。 蛋白质的溶解 称取1mg蛋白样品，在1.5ml离心管中加入350μl 水化缓冲液（含7M Urea、2M Thiourea、4% CHAPS、65mM DTT、0.2% Bio-ampholyte, pH3~10载体两性电解质、0.001% 溴酚兰），冰浴超声波裂解后，在4℃、8000rpm离心2min, 取上清液待测浓度。 采用Bradford法测定样品溶液中蛋白质含量 采用 Ramagli 改进的 Bradford（1976）方法，考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。以蛋白质裂解液为空白, 1mg/ml BAS标准蛋白(标准蛋白溶液用蛋白质裂解液配制) 为标准制备标准曲线, 在紫外可见分光光度计上于λ=595nm 测定用三氯乙酸/丙酮沉淀法所获得油菜蛋白质样品的含量。 溶液的配置 Bradford储液: 100mg考马斯亮兰G-250 , 50ml 95%的乙醇，100ml 85%的正磷酸，用水定容至1000ml，4℃保存于棕色瓶中，可使用数周，使用前需要过滤。 标准蛋白溶液: 1 mg/ml的BSA溶液：50mg BSA，用水定容至50ml，4℃保存。 标准曲线的制作 取0，20，40，60，80，100μl不同体积的BSA标准蛋白质溶液（1mg/ml）于6支10ml小试管中，双蒸水调体积到100μl，再加入过滤后的5ml Bradford储液，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，测量应在1小时内完成。如表5.1所示。 表5.1  BSA标准曲线 Table 5.1 Standard curve of BSA 管号 Tube No. BSA标准蛋白溶液（μl） BSA standard protein Solution (μl) ddH2O （μl） Double distilled water (μl) Bradford储液（ml） Bradford solution(ml) 吸光值 （A595） Absorption value(A595) 1 0 100 5 - 2 20 80 5 0.0335 3 40 60 5 0.0618 4 60 40 5 0.1503 5 80 20 5 0.2326 6 100 0 5 0.3275           以不同浓度的BSA（mg）为横座标，测得的吸光值A595为纵座标作标准曲线，作图得到一条标准曲线， 根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。 四： CTAB法对油菜基因组DNA的提取 1) 取油菜植株的新鲜幼嫩叶片组织100mg，液氮冷冻研磨成粉末； 2) 将粉末转移至预冷的2m1 Eppendorf离心管中，立即加入65℃预热的2×CTAB提取液700μl，涡旋振荡混匀，65℃温浴30min，期间轻轻颠倒混匀2-3次； 3) 混合物冷却至室温后，于4℃，12,000rpm，离心5min； 4) 取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀，室温放置10min； 5) 4℃，12,000rpm，离心5min； 6) 重复步骤（4）（5）； 7) 取上清液，加入三倍体积的冰冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀至DNA沉淀； 8) 4℃，12,000rpm，离心2min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次超净工作台上吹干； 加入100μl ddH2O（内含20μg/ml RNase工作液），过夜溶解沉淀并消化RNA。 PCR反应在10l体系中 模板（基因组DNA） 1l（10ng/l） Primer (R) 0.2l（10M） Primer (F) 0.2l（10M） 10×buffer 1l dNTP (2.5mM) 0.8l MgCl2 (25mM) 0.8l Taq酶 0.1l (0.5U) ddH2OH2O 5.9l 总体积 10l     PCR扩增条件 94℃ 3 min 94℃ 30 s X（按所用引物确定退火温度） 50 s 72℃ 1 min 72℃ 10 min 4℃ 保存     PCR扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2l，混匀，取4l PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V，电泳1h左右，UV检测扩增产物的多态性。 五：（黑色素） 黑芝麻色素的测定结果 一、黑芝麻色素的色价值测定： 配制100mg/L的黑芝麻色素溶液，用0.5％NaOH完全溶解，浓度加大后溶解度降低，因此以0.5％NaOH做溶剂进行光谱扫描和色价测定，测定结果为在221nm有最大吸收峰，溶液稀释3倍后A值为0.435，但是吸收峰呈一个很平缓升高的坡形，峰不是很明显。0.5%NaOH测定pH在13左右。 继续阅读